1、植物組織培養實驗六（設計性實驗）1一、配制培養基二、無菌操作三、無菌培養四、觀察記錄 上交實驗報告時間：第15周 實驗安排本周六下午2：30；3：30。本周（第九周）（11.511.9）第11、12、13、14周每周進行觀察（11.1912.14）2 （1）深刻理解植物組織培養的基本概念和理論依據。 （2）訓練利用實驗室的條件來合理設計和完成實驗的基本技能。實驗目的3 植物組織培養就是將植物離體的生活部分（如器官、組織、細胞甚至原生質體等）通過無菌操作接種在適宜的培養基上，在人工控制的條件（如溫度、光照、濕度等）下進行培養的技術。 理論依據：植物細胞的全能性。 植物體的每一個細胞都攜帶著一套完

2、整的基因組，并具有發育成完整植株的潛在能力。實驗原理4完整植株脫分化再分化外植體愈傷組織芽、根實驗設計的依據依據一分化5植 物 組 織 培 養 的 過 程接種脫分化再分化愈傷組織外植體再分化沖洗表面消毒6 培養基中植物生長物質的種類和濃度在脫分化和再分化中起重要作用，尤其是生長素和細胞分裂素類的比例。實驗設計的依據依據二生長素類/細胞分裂素類高 誘導根的分化中 愈傷組織生長不分化低 誘導芽的分化7MS培養基的大量元素；MS培養基的微量元素；MS培養基的鐵鹽；有機附加成分； 2,4-D、NAA 、6-BA；蔗糖、冷凝脂；0.1mol/LNaOH和0.1mol/LHCl。條件一：實驗藥品實驗條件8

3、條件二：實驗儀器及設備 燒杯、移液器、量筒、精密電子天平、三角瓶、pH試紙、封口膜等； 高壓滅菌鍋； 無菌操作間、超凈工作臺； 能夠控制光照和溫度條件的培養室。實驗條件9要求 1.以菊花無菌苗為材料進行以下培養基的設計。（1）誘導菊花無菌苗葉片形成愈傷組織（2）誘導菊花無菌苗莖段形成苗實驗設計10菊花無菌苗實驗材料11具體做法全班分成小組，根據設計要求結合實驗原理、設計依據及已提供的實驗條件，在查閱資料的基礎上，合理設計實驗（主要對培養基進行設計）。設計出初步方案后，每組推選一名代表向全班匯報設計的原理、方案和預期的結果；再經全班討論確定最后的設計方案。12 全班分成6個小組，按照要求經查閱資

4、料、代表匯報和全班討論，最后確定設計的培養基如下（MS為基本培養基）：1.誘導菊花無菌苗葉片形成愈傷組織（1）MS + 6-BA 1 + NAA 0 （1組，7人）（2）MS + 6-BA 1 + NAA 2 （2組，7人）（3）MS + 6-BA 1 + NAA 4 （3組，7人）2.誘導菊花無菌苗莖段形成芽（4）MS + 6-BA 0 + NAA 0.2 （4組，7人） （5）MS + 6-BA 0.2 + NAA 0.2 （5組，7人）（6）MS + 6-BA 2 + NAA 0.2 （6組，7人）根據設計的培養基，利用提供的實驗條件，我們將按照下列步驟完成實驗。13 一、配制培養基二、

5、無菌操作三、無菌培養四、觀察記錄 實驗步驟14一、配制培養基 1.配制母液實驗步驟MS培養基的大量元素母液（20）；MS培養基的微量元素母液（100）；有機附加成分母液（100）； 肌醇母液（100）； MS培養基的鐵鹽母液（200）； 6-BA、2,4-D、NAA母液(0.5mg/mL)。15 2.配制培養基 各個小組根據自己的設計方案進行。 要求：每一種培養基400mL，分裝10瓶，每瓶40mL，每瓶做好標記，如：1，2，。 （1）加溶液。順序為：大量元素微量元素附加成分肌醇鐵鹽植物生長調節劑蔗糖冷凝脂 （2）攪拌混勻; （3）定容至400mL； （4）調pH值至5.86.2； （5）分裝

6、、封口。 3.培養基滅菌高壓滅菌(壓力1.1 kg/cm2 , 121, 20min )。濕熱滅菌16各物質加入量： 400mL大量元素母液（10） 100mL/L -40 mL; 微量元素母液（100） 10mL/L -4 mL ；有機附加成分母液（100） 10mL/L -4 mL ；蔗糖(30g/L)、冷凝脂(6g/L) 12g、2.4g;肌醇母液（100） 10mL/L -4 mL ；鐵鹽母液（200） 5mL/L -2 mL ；6-BA、2,4-D、NAA母液(0.5mg/mL) 17編號培養基組成（mg/L）各物質加入量（mL/400mL）6-BA NAA1MS + 6-BA 1

7、+ NAA 00.802MS + 6-BA 1 + NAA 20.81.63MS + 6-BA 1 + NAA 40.83.24MS + 6-BA 0 + NAA 0.200.165MS + 6-BA 0.2 + NAA 0.20.160.166MS + 6-BA 2 + NAA 0.21.60.16表培養基中植物生長調節劑加入量18二、無菌操作 1.接種前的準備 （1）空間滅菌(30min)。無菌操作間和超凈工作臺。開紫外燈開鼓風機關紫外燈10min后開日光燈。 （2）操作人員的準備 剪指甲用肥皂徹底洗手35次自然風干進操作間用7075%酒精反復檫手(圖)。 （3）器具滅菌 實驗器械的消毒滅

8、菌（圖）。 19 2.接種 （1）切取材料 左手持鑷，右手持刀切取材料葉片：0.5cm0.5cm，莖段帶一個腋芽。 20 （2）接種 取三角瓶打開封口膜接種葉塊：正接，每瓶3塊莖段：形態學下端插入培養基，每瓶3個 （3）重新封口 （4）做標記 班級，日期 21三、無菌培養 將接種好的三角瓶置于培養室進行培養。 培養條件：光/暗 = 14 h/10 h； T = 25 ； RH(relative humitidy) = 70 80%四、觀察記錄 22 在培養過程中，每周定時觀察記錄實驗結果1次。內容： （1）污染率 污染率(%)=(污染的瓶數/接種瓶數) 100% （2）愈傷組織形成的時間、部位、顏色、大小、形狀，計算出愈率。 出愈率(%)=(產生愈傷組織的葉塊數 / 接種的葉塊數)100% （3）芽形成的時間、芽數、葉數、叢生芽數，計算出芽率。 出芽率(%)=(出芽的莖段數 / 接種的莖段數)100%23（1）比較不同的培養基對愈傷組織形成的影響；（2）比較不同的培養基對芽形成的影響。結果分析與討論24你認為組織培養獲得成功的關鍵因素 有哪些？思考題25 本次實驗歷時6周，在此過程中大家經歷了大量查閱資料，精心設計方案，認真動手操作，仔細觀察記錄，全面總結分析等各個環節。 通過該