1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)2010-2011第二學(xué)期1目的：掌握分子生物學(xué)基本技術(shù)，主要包括RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、PCR、電泳等內(nèi)容：羅非魚18S基因的cDNA克隆總RNA提取電泳檢測(cè)cDNA合成PCR擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的分離、回收和純化2時(shí)間安排：5月24日 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備一：1.3去除RNA酶的實(shí)驗(yàn)用品處理5月25日 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備二：滅菌干燥離心管、槍頭5月26日 總RNA提取和電泳檢測(cè)5月27日 cDNA合成和PCR擴(kuò)增5月28日 PCR產(chǎn)物回收和純化3要求：1、分組實(shí)驗(yàn)，以小組為單位進(jìn)行考核，即以各小組實(shí)際的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，不另外安排考試。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要包括：總RNA電泳圖、PCR電泳圖，每小組交一份實(shí)驗(yàn)報(bào)告

2、，實(shí)驗(yàn)報(bào)告需對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析討論。41 材 料1.1 實(shí)驗(yàn)魚 羅非魚購自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，碎冰速凍麻醉后分離垂體、肝臟組織，立即置于TRIZOL試劑，或置于-60超低溫冰箱保存。1.2 試 劑柱式動(dòng)物RNAout（總RNA 提取試劑盒）RevertAid TM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit（反轉(zhuǎn)錄試劑盒）ExTaq PCR kit（PCR反應(yīng)試劑盒）E.Z.N.A Gel Extraction Kit（膠回收試劑盒）100bp DNA Ladder51.3 去除RNA酶的實(shí)驗(yàn)用品處理DEPC水：每1L雙蒸水中加入1mL DEPC，終濃度為0.1%，

3、于室溫?cái)嚢柽^夜，高壓滅菌。 金屬解剖器具和玻璃器皿經(jīng)180烘烤5小時(shí)，以滅活RNA酶。塑料離心管、槍頭及槍頭盒等塑料用品均用DEPC水浸泡過夜后，高壓滅菌烘干后使用。瓊脂糖凝膠電泳槽、制膠模具用3%的過氧化氫浸泡過夜后，用DEPC水洗凈備用。61.5移液槍的正確使用選擇合適量程；對(duì)應(yīng)合適槍頭；吸液后輕放以避免將液體吸入到槍體內(nèi)；用完后調(diào)回最大量程。71.6安全注意事項(xiàng)DEPC：焦碳酸二乙酯，是強(qiáng)的蛋白變性劑和致癌物。開瓶時(shí)要使瓶子盡可能遠(yuǎn)離操作者，因?yàn)閮?nèi)部的壓力可能導(dǎo)致飛濺。操作中應(yīng)戴上手套，并在通風(fēng)廚中進(jìn)行；有機(jī)溶劑：RNA提取試劑為有機(jī)揮發(fā)試劑（硫氰酸胍-苯酚、氯仿、異丙醇），均有毒，需在

4、通風(fēng)廚操作或屏息操作，少講話，以免將有毒氣體吸入體內(nèi)。若試劑不小心沾到皮膚上，請(qǐng)立即用自來水沖洗；EB：溴化乙錠，是誘變劑，具有高致癌性，配制使用時(shí)，應(yīng)戴乳膠手套，并且不要將該染色液灑在桌面或地面上，凡是接觸過EB的器皿或物品，必須經(jīng)特殊處理后，再進(jìn)行清洗或棄去。8實(shí)驗(yàn)相關(guān)知識(shí)及操作方法RNA提取瓊脂糖凝膠電泳PCR及反轉(zhuǎn)錄9二、RNA提取的基本原理與方法（一）總RNA提取的基本原理與方法1、原理通過變性劑破碎細(xì)胞或者組織，然后經(jīng)過氯仿等有機(jī)溶劑抽提RNA，再經(jīng)過沉淀，洗滌，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶無處不在，隨時(shí)可能將RNA降解，所以實(shí)驗(yàn)中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會(huì)前功盡棄。提取

5、步驟：破碎組織分離RNA沉淀RNA洗滌RNA融解RNA保存RNA。10所有RNA的提取過程中都有五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，即：樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋白復(fù)合體變性；對(duì)內(nèi)源RNA酶的有效抑制；有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；對(duì)于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中最關(guān)鍵的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前階段主要可采用兩種途徑:1、提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來；2、直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA留在水相。112、總RNA提取的方法（1）（異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法）TRIZOL試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂

6、解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯仿時(shí)，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層（無色）主要為RNA，有機(jī)層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。12（二）mRNA的提取mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA 3末端含有Poly（A+）的特點(diǎn)，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度時(shí)或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過兩

7、次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。13總RNA提取（柱式動(dòng)物RNAout）從低溫冰箱(80)中取出肝臟樣品，剪取小塊（約為50-100mg）后加入1 ml的溶液A，用1ml一次性塑料注射器抽打勻漿。勻漿液室溫放置（1530）1分鐘以便細(xì)胞充分裂解，每1 ml 溶液A加入0.2 ml的氯仿，用力振蕩30秒后，室溫放置1分鐘以便溶液分層，總RNA存在于上層水相中。室溫，12,000g離心3分鐘，將上清液移至干凈的1.5 ml離心管中，加入相同體積溶液B，顛倒混勻。14將溶液置于離心柱中，靜置2分鐘，8000rpm離心30S，若一次加不完，可分兩次離心。用通用洗柱液洗兩次。短暫干甩

8、后，用RNA洗脫液洗柱，室溫離心干燥30S ，溶解總RNA。0.8瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量。RNA提取注意事項(xiàng)：為防RNA降解，帶手套、口罩，少說話；試劑均為有機(jī)揮發(fā)試劑，有毒，需在通風(fēng)廚操作，屏息，若不小心沾到試劑立即用自來水沖洗15（二）瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是重組DNA研究中常用的技術(shù)，可用于分離，鑒定和純化DNA片段。不同大小、不同形狀和不同構(gòu)象的DNA分子在相同的電泳條件下（如凝膠濃度、電流、電壓、緩沖液等），有不同的遷移率，所以可通過電泳使其分離。凝膠中的DNA可與熒光染料溴化乙錠（EB）結(jié)合，在紫外燈下可看到熒光條帶，籍此可分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。16一、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝

9、膠電泳是重組DNA研究中常用的技術(shù)，可用于分離，鑒定和純化DNA片段。不同大小、不同形狀和不同構(gòu)象的DNA分子在相同的電泳條件下（如凝膠濃度、電流、電壓、緩沖液等），有不同的遷移率，所以可通過電泳使其分離。凝膠中的DNA可與熒光染料溴化乙錠（EB）結(jié)合，在紫外燈下可看到熒光條帶，籍此可分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Section2 凝膠電泳1718步驟：將凝膠成形模具兩端用醫(yī)用膠布封好，水平放置，將選好的梳子放好，梳子底部與模具之間留1mm空間。稱取DNA電泳用瓊脂糖0.8g放入250ml的三角燒杯中，加入100ml 1TAE緩沖液，混勻后，將燒瓶置于電爐上，加熱煮沸，直至瓊脂糖完全溶解。關(guān)閉電爐，取下三角燒

10、瓶，將其置室溫下冷卻至70左右（手握燒瓶可以耐受），再加入溴化乙錠（10mg/ml）5l，混勻后，即將凝膠溶液倒入膠板鋪板。19室溫下待凝膠完全凝固，需時(shí)約30分鐘，揭去兩端膠布，拔出梳齒，將膠板放入電泳槽中。在電泳槽中加入1TAE緩沖液，以高出凝膠表面2mm為宜。將樣品置震蕩器上混勻，短暫離心。用加樣器吸取樣品。依次分別加入三個(gè)點(diǎn)樣孔中，注意加樣器吸頭應(yīng)恰好置于凝膠點(diǎn)樣孔中，不可刺穿凝膠，也要防止將樣品溢出孔外。接通電源，調(diào)節(jié)電壓至50伏，電泳90分鐘后，將凝膠板取出，在紫外燈下觀察結(jié)果。20影響DAN片段瓊脂糖電泳的幾個(gè)因素：DNA分子的大小：線性DNA分子的遷移率與其分子 量的對(duì)數(shù)值成反

11、比。DNA分子的形態(tài)：在同一濃度的瓊脂糖凝膠中，超螺旋DNA分子遷移率比線性DNA分子快，線性DNA分子比開環(huán)DNA分子快。瓊脂糖濃度：一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的遷移率是不相同的。相反，在一定濃度的瓊脂糖凝膠中，不同大小的DNA片段的遷移率也是不同的。若要有效地分離不同大小的DNA，應(yīng)采用適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠。電流強(qiáng)度：每厘米凝膠電壓不超過5V，若電壓過高分辨率會(huì)降低，只有在低電壓時(shí)，線性DNA分子的電泳遷移率與所用電壓成正比。瓊脂糖凝膠濃度 可分辨的線性DNA片段大小（kb） 0.4 560 0.7 0.810 1.0 0.46 1.5 0.24 1.75 0.23 2.

12、0 0.13 瓊脂糖凝膠濃度 可分辨的線性DNA片段大小（kb） 21PCR技術(shù)：1985年由美國 Cetus 公司的Kary Mullis 首創(chuàng)，可以將微量目的DNA片段擴(kuò)增一百萬倍以上。 優(yōu)點(diǎn)：敏感度高、特異性強(qiáng)、產(chǎn)率高、重復(fù)性好以及快速簡(jiǎn)便等，廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、考古學(xué)、法醫(yī)學(xué)及體育等領(lǐng)域，并已普及到許多普通實(shí)驗(yàn)室，大大簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)，從而比較容易地對(duì)目的基因進(jìn)行分析、鑒定。 Kary Mullis 本人因此獲1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)22DNA擴(kuò)增的傳統(tǒng)方法：一般采用分子克隆法，需將構(gòu)建的含有目的基因的載體導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，并需要用探針進(jìn)行篩選，牽扯到DNA酶

13、切、連接、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)及探針雜交等技術(shù)，雖然技術(shù)上已無難點(diǎn)，但操作復(fù)雜，需數(shù)周到數(shù)月的時(shí)間，且不利于普及。23 一、PCR的原理： 用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA片段，類似于天然DNA的復(fù)制過程。 以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)分別與模板5末端和3末端互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，重復(fù)這一過程，即可使目的DNA片段得到擴(kuò)增。24（一）PCR技術(shù)的基本過程擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA的特異結(jié)合，基本反應(yīng)步驟分三步：1. 變性 (Denaturation)： 加熱使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈。

14、94 302. 退火 (復(fù)性) (Annealling): 突然降溫后模板DNA與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合，也存在兩條模板鏈之間的結(jié)合，但由于引物的高濃度，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，主要的結(jié)合發(fā)生在模板與引物之間。55 30 253. 延伸 (Extension): 將反應(yīng)溫度調(diào)節(jié)到酶的最適溫度，在DNA聚合酶、4種 dNTPs 及鎂離子等存在的條件下，以引物的 3端開始，結(jié)合單核苷酸，形成與模板鏈互補(bǔ)的新DNA鏈。72 1 上述 3 步為一個(gè)循環(huán)，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過2540個(gè)循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106 109 倍。26 PCR 的基本

15、反應(yīng)步驟變性95C延伸72C退火Tm-5C275Primer 15Primer 2 5 5Template DNAPCR技術(shù)原理28Cycle 32530 次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。29PCR擴(kuò)增的特異性是由一對(duì)寡核苷酸引物所決定的。反應(yīng)初期，原來的DNA擔(dān)負(fù)起使模板的作用，隨著循環(huán)次數(shù)的遞增，由引物介導(dǎo)延伸的片段急劇增多而成為主要模板，最終的擴(kuò)增產(chǎn)物是介于兩種引物5 端之間的DNA片段。30 二、PCR反應(yīng)體系：終濃度緩沖液： 10 50 mM Tris- Cl (pH8.4) 維持 Taq 酶作用環(huán)境的偏堿性 25 50 mM KCl 促進(jìn)引物退火，50 mM 會(huì)抑

16、制 Taq 酶的活性。 100g / ml 牛血清白蛋白 (BSA) 對(duì)酶有一定的保護(hù)性，如質(zhì)量不好將起相反的作 用，建議使用乙酰化的 BSA。明膠、Tween-20、 二硫蘇糖醇 (DTT) 也有類似作用。312、MgCl2: （1.52.0mM） Taq 酶具有 Mg2+依賴性，顯著影響反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增片段的產(chǎn)量，過量能增加非特異擴(kuò)增并影響產(chǎn)率，過低則酶活性顯著下降。3、dNTPs : dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP底物（0.020.2 mM） dNTPs 可與 Mg2+ 結(jié)合，應(yīng)注意Mg2+ 濃度與dNTPs 濃度之間的關(guān)系， Mg2+ 濃度比 dNTPs 濃度高 0.2

17、2.5 mM。過高：加快反應(yīng)速度，但增加堿基的錯(cuò)誤摻入率和室驗(yàn)成本。過低：反應(yīng)速度下降，可提高實(shí)驗(yàn)的精確性。324. 引物 (Primer-P)：（0.2 1 M） 預(yù)擴(kuò)增核酸片段兩端的已知序列，決定特異性。 偏高：非特異產(chǎn)物擴(kuò)增及錯(cuò)配，增加引物之間 形成引物二聚體，產(chǎn)量降低。 偏低：產(chǎn)量降低。5. Taq DNA 聚合酶：耐高熱 0.5 5 U / 100 l 1U / 25 50l 偏高：引物非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增 偏低：產(chǎn)物量降低336. 模板DNA (Template): 最低102 105 bp DNA片段，實(shí)際用量遠(yuǎn)遠(yuǎn) 超過此量，用量需在實(shí)驗(yàn)中摸索。1 5 l 過高：非特異產(chǎn)物增加 過低

18、：產(chǎn)量降低7. 水： 去離子水，補(bǔ)足整個(gè)反應(yīng)體積。34PCR反應(yīng)體系： 常用30l，各種成分的實(shí)際用量應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)者選用的該成分的終濃度及所擁有的儲(chǔ)備液濃度進(jìn)行核算。 10buffer： 130 / 10 = 3l MgCl2: 1.530 / 25 = 1.8l dNTPs: 0.230 / 10 = 0.6l 引物 P： 0.4302 / 10 = 2.4l Taq 酶(5U/l)： 1/5 = 0.2l 模板： 1l 水： 30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21l35 操作： 5份標(biāo)本 總體積 30l 6 = 180l 1. 取一 0.5 ml Ep 管，依次加入下列試劑： 1

19、0buffer： 3l 6 = 18l MgCl2: 1.8l6 = 10.8l dNTPs: 0.6l6 = 3.6l 引物 P： 2.4l 6 = 14.4l Taq 酶 (5U/l)： 0.2l 6 = 1.2l 水： 21l 6 = 126l 共174l，先用移液器 / 指彈混勻，后用離心機(jī)瞬時(shí) 混勻（管壁上液體沉至管底）。362. 另取 5 支0.2ml Ep管，分別加入上述液體29l。3. 分別取標(biāo)本模板各1l，加入上述5支 Ep 管中，混勻，分別加入2滴液體石蠟（防止加溫過程中液體蒸發(fā)影響反應(yīng)體積），離心機(jī)瞬時(shí)離心，備用。4. 反應(yīng)條件：PCR擴(kuò)增儀 9430，55 30 ，72 1， 35個(gè)循環(huán)，72 延伸 5 。 37三、PCR技術(shù)的應(yīng)用（一）反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平，