1、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳法apoB基因PCR產(chǎn)物電泳瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。該技術(shù)操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆操作。 原理：在 pH 值為 8.08.3 時，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電，在電泳時向正極移動。采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，在分

2、子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動率出現(xiàn)較大的差異，從而達(dá)到分離核酸片段檢測其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如 EB ）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。 DNA顯色劑多用EB，它能和堿基間的氫鍵結(jié)合，在波長為254nm365nm的紫外光照射下呈橘紅色（530nm）的熒光。瓊脂糖電泳分離DNA的范圍瓊脂糖可以形成各種形狀、大小的孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場下電泳。電泳指示劑 核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)（ bromophenol blu

3、e, Bb ）呈藍(lán)紫色；二甲苯晴（ xylene cyanol, Xc ）呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的遷移率比溴酚藍(lán)慢。 膠濃（%）溴酚藍(lán)二甲苯青0.61kb10.6kb2kb1.40.2kb1.6kb20.15kb影響凝膠電泳的因素 DNA的分子大小、構(gòu)象 線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比。 超螺旋DNA移動最快,開環(huán)其次、線狀雙鏈DNA移動最慢。瓊脂糖濃度一個給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。影響凝膠電泳的因素電源電

4、壓 在低電壓時,線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到最大,所加電壓不得超過5v/cm。 嵌入染料的存在 熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng),還會使線狀DNA遷移率降低15。 離子強(qiáng)度影響 電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率最小,DNA幾乎不移動,在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10電泳緩沖液),則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重時會引起凝膠熔化或DNA變性。實(shí)驗(yàn)材料及試

5、劑 瓊脂糖 電泳緩沖液：1TAE 6 加樣緩沖液：溴酚藍(lán)、二甲苯青、甘油 EB染色液； 溴化乙錠 實(shí)驗(yàn)操作及注意事項(xiàng)瓊脂糖凝膠板的制備（制板、梳子位置與高度、1%倒膠3mm、凝固后拔梳）倒緩沖液，加樣（PCR樣品:全部上樣，marker:10uL,1孔/板基因組樣品：加入6體積的上樣buffer）電泳（方向、電壓、時間）染色與檢測（EB10 min，紫外檢測）注意事項(xiàng)倒膠時把握好膠的溫度，不要高于60 ，否則溫度太高會使制板變形膠一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要豎直向上，不要弄壞點(diǎn)樣孔點(diǎn)樣時槍頭下伸，點(diǎn)樣孔內(nèi)不能有氣泡，緩沖液不要太多EB有毒，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境，膠勿亂扔紫外線照射

6、不要太久apoB (用個人基因組DNA為模板）混合液21 lDNA模板4 l總體積：25 l 945min（預(yù)變性） 94 1min（變性） 60 4min退火+延伸（30個循環(huán)） 60 5min（續(xù)延伸） 4 保存 PCR加樣表PCR程序PCR基本原理及相關(guān)知識聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外擴(kuò)增特異DNA片斷的技術(shù),能在短時間內(nèi)獲得數(shù)百萬個特異DNA序列的拷貝。Kary Mullis PCR技術(shù)最早由美國 Cetus公司人類遺傳研究室Kary Mullis及同事于1985年發(fā)現(xiàn)并研制成功的。Kary Mullis因發(fā)明了“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”

7、而獲得1993年度諾貝爾化學(xué)獎。 相對DNA克隆而言，這種方法的特點(diǎn)：操作簡便、時間短、特異性高、靈敏度高、實(shí)用性強(qiáng)廣泛的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、分子生物學(xué)、分子克隆、基因診斷、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)等各個領(lǐng)域。 PCR擴(kuò)增DNA片段的原理 PCR是在模板DNA、引物和四種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應(yīng)，整個擴(kuò)增過程分三步： 變性：加熱，模板DNA形成兩條單鏈 退火：降溫，模板單鏈DNA與引物配對結(jié)合 延伸：在DNA聚合酶及鎂離子等存在的條件下，引物3-端向前延伸，合成與模板配對的新鏈上述三步為一個循環(huán)，經(jīng)過一個循環(huán)DNA量增加一倍。新合成的鏈又可以成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過25-3

8、0個循環(huán)后目的DNA就可以擴(kuò)增106109 倍。 通過循環(huán)可以提高PCR的特異性。PCR反應(yīng)體系的組成及功能 完整的PCR反應(yīng)體系包括：模板 單、雙鏈DNA均可，不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。相對于分子克隆、酶切、連接、標(biāo)記等，PCR對DNA模板純度的要求并不嚴(yán)格。模板用量很低，一般認(rèn)為102104拷貝模板就可以滿足要求。一般100ng DNA模板/100L。 模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。引物 是預(yù)擴(kuò)增DNA片段兩端的已知序列，是保證 PCR特異性的關(guān)鍵因素，引物濃度：0.1-0.5 mol/L， 濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配,反應(yīng)特異性下降。Taq

9、DNA聚合酶 有良好的熱穩(wěn)定性，具有5-3聚合酶活性和3-5外切酶活性，因此。它對核苷酸的錯配是沒有校正功能。 其活性對Mg2+濃度非常敏感 終濃度一般為：2.5u/100ul，酶量增加使反應(yīng)特異性下降；酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。 dNTP 已有商品化的混合液，終濃度一般為20200umol/L。10PCR反應(yīng)buffer 已作成商品化的產(chǎn)品，它包括： 250500mmol/L KCl； 100500mmol/LTris-HAC（pH8.4）；1520mmol/L MgCl2（對Taq酶的活性影響很大，一般濃度為1.52.0mmol/L，實(shí)際應(yīng)用時根據(jù)反應(yīng)體系的情況進(jìn)行調(diào)整。）； 0.1%明膠或牛

10、血清白蛋白dd H2O 調(diào)節(jié)反應(yīng)體積液體石蠟油影響PCR的主要因素PCR反應(yīng)體系的各個組分 PCR循環(huán)的溫度（預(yù)變性、變性、退火、延伸）PCR循環(huán)的次數(shù)和平臺效應(yīng)操作環(huán)境平臺效應(yīng)及其原因 遺傳多態(tài)現(xiàn)象(genetic polymorphism) 是指同一交配繁殖群體中存在兩種或兩種以上遺傳變異的類型, 其中頻率最低的類型并不依靠重復(fù)突變維持。 染色體多態(tài)現(xiàn)象 蛋白質(zhì)多態(tài)現(xiàn)象 DNA多態(tài)現(xiàn)象DNA多態(tài)現(xiàn)象產(chǎn)生的原因單個核苷酸的點(diǎn)突變即核苷酸的替換單一DNA序列的插入或缺失整串DNA序列的插入或缺失基因轉(zhuǎn)換DNA多態(tài)現(xiàn)象的類型RFLP(restricted fragment length poly

11、morphism)RAPD(random amplified polymorphic DNA)微衛(wèi)星多態(tài)性(microsatellite polymorphism)SSCP(single strand conformation polymorphism)DSCP(double strand conformation polymorphism)DNA芯片(DNA chips)DNA指紋隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD) 由Williams等于1990年創(chuàng)立。其基本原理與PCR技術(shù)一致；由人工隨機(jī)合成的DNA 分子為引物，以基因組DNA 為模板，進(jìn)行多態(tài)性DNA片段的隨機(jī)合成。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳、染色分析，就可直接在紫外光線下看到新合成的DNA分子片段形成的不同條帶。 遺傳材料的基因組DNA如果在特定引物結(jié)合區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變，就有可能導(dǎo)致引物結(jié)合位點(diǎn)的分布發(fā)生相應(yīng)的變化，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物增