1、 PAGE 3說明書【產(chǎn)品名稱】通用名稱：人乳頭瘤病毒（HPV）高危型核酸檢測試劑盒（熒光探針-熔解曲線法）英文名稱：Diagnostic Kit for High Risk Human Papilomavirus （HPV）DNA(Fluorescence- Melting Curve Analysis)【包裝規(guī)格】48人份/盒【預期用途】本試劑盒采用熒光標記實時PCR和熔解曲線分析的方法，對宮頸細胞樣本中高危型人乳頭瘤病毒核酸DNA進行檢測，適用于15種高危型人乳頭瘤病毒（16、18、31、33、35、39、45、51、52、53，56、58、59、66和68）感染的輔助診斷和高危型人乳頭

2、瘤病毒感染者藥物治療的療效監(jiān)測。檢測結果僅供臨床參考，不能單獨作為確診或排除病例的依據(jù)。【檢驗原理】本試劑盒采用熒光探針實時PCR技術，以15種高危型HPV基因中相對保守區(qū)為靶區(qū)域，設計特異性引物及探針，通過實時PCR對HPV DNA進行快速檢測。樣本無須進行核酸純化，僅經(jīng)過細胞裂解處理之后，以試劑盒中提供的PCR檢測試劑配制成PCR反應管，將中和后的細胞裂解產(chǎn)物加入PCR反應管中，使用熒光定量PCR儀進行PCR，并檢測熒光信號，儀器軟件系統(tǒng)自動繪制出實時擴增曲線。在擴增完成后，儀器系統(tǒng)自動繪制產(chǎn)物熔解曲線，HPV擴增產(chǎn)物和內標擴增產(chǎn)物在DNA序列、長度、GC含量等方面有所不同，所以兩者的熔解

3、溫度不同，對應的熔解特征峰出現(xiàn)在熔解曲線的不同溫度。根據(jù)對應HPV的熔解特征峰的有無實現(xiàn)對未知樣本的定性檢測。另外，本試劑盒帶有的內標物質，用于對核酸提取的整個過程進行監(jiān)控，減少假陰性結果的出現(xiàn)。【主要組成成份】試劑盒中包含的試劑組分組分名稱規(guī)格數(shù)量主要成分樣品裂解液1.5 ml2NaOH中和液1.5 ml2HClHPV反應混合液I625 ul1緩沖液， 無機鹽， dNTP，熱啟動Taq聚合酶，UNG酶HPV高危型引物III250 ul1引物、探針、及模板水300ul1滅菌水HPV陽性質控品20 ul1含15種HPV 亞型DNA片段及內標DNA片段陰性質控品20 ul 1水不同批號試劑盒的以上

4、成分不可以互換使用。【儲存條件及有效期】PCR檢測試劑、質控品、陽性定量參考品組分保存于-205，避免反復凍融，有效期6個月。【適用儀器】ABI StepOne，BioRad CFX96, ABI Prism 7500。【樣本要求】1. 適用標本類型：宮頸脫落細胞樣本2. 標本采集：女性生殖道用無菌生理棉球洗去宮頸外分泌物，將棉拭子插入宮頸管內鱗狀上皮交界處采樣，轉動3-4圈，停留數(shù)秒，將棉拭子置于無菌玻璃管，密閉送檢。（或用用宮頸刷或細胞刷取標本）3. 標本保存和運送：標本可立即用于測試，可以在28oC條件下保存，最長可達48h，如不能在短時間里測試樣本，可保存于-20oC待測，保存期為6個

5、月。樣本不宜反復凍融。標本運送時應采用0oC冰壺。【檢驗方法】1. 樣本制備（樣本制備區(qū)）1.1 準備和待測樣本數(shù)量相當?shù)男碌?.5ml Eppendorf離心管，根據(jù)樣品的標記將所有的離心管標記。1.2 取0.5ml樣品加入到對應的Eppendorf離心管中，以14000rpm速度離心10分鐘。1.3 小心將上清液吸除，加入50ul樣品裂解液(1X)到每個管中，將沉淀物重新懸浮，用震蕩器混勻。1.4 短時離心將管壁上的液體全部離心至管底。1.5 將裂解的樣品管放置在95度的干式恒溫器中加熱15分鐘。1.6 待樣品管冷卻到室溫后，加入等體積（50ul）的中和液，混勻后，即可用于擴增檢測反應。2

6、.核酸擴增試劑準備（試劑準備區(qū)）從試劑盒中取出反應主混合液、引物混合液, 陰性質控品，陽性質控品以及水，室溫融化后振蕩混勻，短時離心將管壁上的液體全部離心至管底。取N+2個（N待測樣本個數(shù)）PCR反應管， 擴增體系主混合液配制如下表：組分用量反應主混合液12.5 x (N+2)l引物混合液5 x (N+2)l水5.5 x (N+2)l將各組分充分混合，混合好后進行短時離心將管壁上的液體全部離心至管底。 將主混合液均勻地分裝在N+2個PCR反應管中,每管約含23ul主混合液。3.加樣（樣本制備區(qū)）將2l陽性對照模板加入陽性對照反應管中，將2l陰性對照模板加入陰性對照反應管中。將2l待測樣本分別加

7、入相對應的反應管中。4.PCR擴增和熔解曲線繪制（擴增和產(chǎn)物分析區(qū)）（做圖表格式）加樣后，反應管置于熒光定量PCR儀上，反應條件設置為：PCR擴增：95 10分鐘，1個循環(huán)；95 15秒60 30秒（收集熒光），10個循環(huán)；95 15秒65 30秒（收集熒光），50個循環(huán)。熔解曲線：95 15秒，1個循環(huán)；65 1分鐘，1個循環(huán)；以0.3/步升溫至85，每一步收集一次熒光。反應體系設置為25ul；熒光檢測通道設置為FAM。注：ABI儀器請將Passive reference選項設置為None。5.結果分析及質量控制反應結束后自動保存結果，根據(jù)相應的儀器界面調節(jié)圖像（ABI儀器在“Analysi

8、s”下選擇“Melt Curve”; Biorad 儀器可直接選“Melt Curve”）,通過分析每個反應管較高溫度（79-82oC）和較低溫度區(qū)域（72oC-77oC）是否存在熔解峰，根據(jù)以下三個條件來判定此次試驗結果：A): 陰性對照反應管高溫區(qū)（79-82oC）無熔解峰。B): 陽性對照反應管高溫區(qū)（79-82oC）和低溫區(qū)（72-77oC）均有熔解峰C): 單個樣品反應管高溫區(qū)（79-82oC）有熔解峰A)和B)必須在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。若A)和B)在同一次實驗中同時滿足，本次實驗有效，然后分析每一個樣品是否滿足條件C). 如果某個樣品不滿足條件C)

9、, 則此樣品的檢測無效，需重新檢測或重新取樣來做檢測；若樣品滿足條件C), 則察看該樣品反應管的低溫區(qū)（72-77oC）是否有熔解峰，如果有，則該樣品為陽性樣品，如果沒有，則該樣品為陰性樣品。【檢驗結果的解釋】1.每次實驗均需檢測陰性質控品，陽性質控品結果滿足質量控制要求時方可進行檢測結果的判定。2.陽性結果判定標準：熔解曲線在高溫區(qū)和低溫區(qū)均有熔解峰。3.陰性結果判定標準：熔解曲線高溫區(qū)有熔解峰，低溫區(qū)無熔解峰。4.報告建議采用以下格式：陰性結果報告格式為：樣本未檢測到人乳頭瘤病毒（HPV）15種高危型中的任何一種，或濃度低于試劑盒的靈敏度；陽性結果報告格式為：樣本檢測到15種高危型中人乳頭

10、瘤病毒（HPV）的一種或多種。5.本檢測結果僅供臨床參考，如需確診病例請結合臨床癥狀及其他檢測手段。【檢驗方法的局限性】樣本檢測結果和樣本收集、處理、運送及保存質量有關，其中任何失誤都將會導致假陰性結果。如果樣本處理時沒有控制好交叉污染，可能出現(xiàn)假陽性結果。【產(chǎn)品性能指標】靈敏度: 本試劑盒的靈敏度為優(yōu)于104拷貝/反應。特異性：本試劑盒與感染部位相同或感染癥狀相似的其他病毒,例如常見的低危型人乳頭瘤病毒（HPV 6,11, 42, 43, 44）；HIV；乙型肝炎病毒HBV；人類皰疹病毒；梅毒（Treponema pallidum）；淋病（Neisseria gonorrhoeae）無交叉反

11、應。抗干擾試驗：樣品采集過程中如伴隨有少量的血液不會對檢測結果產(chǎn)生影響。過多的血液則可能對結果有一定的影響。 【注意事項】1. 本品僅用于體外檢測，實驗前請仔細閱讀本說明書。2. 為了避免樣本中任何潛在的生物危險，檢測樣本應視為具有傳染性物質，避免接觸到皮膚和粘膜；樣本的處理應在可防止氣霧外流的生物安全柜中操作，樣本制備區(qū)所用過的試管、吸頭需打入盛有消毒劑的容器，并與廢棄物一起滅菌后方可丟棄；樣本操作和處理均需符合相關法規(guī)要求：衛(wèi)生部微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通用準則和醫(yī)療廢物管理條例；3. 試劑盒中組分需在效期內使用，不使用本試劑盒提供的組分進行實驗將可能導致錯誤結果。4. 實驗室管理應嚴

12、格按照基因擴增實驗室的管理規(guī)范，實驗人員必須進行專業(yè)培訓，實驗過程嚴格分區(qū)進行（試劑準備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴增和產(chǎn)物分析區(qū)），所用消耗品應滅菌后一次性使用，實驗操作的每個階段使用專用的儀器和設備，各區(qū)各階段用品不能交叉使用。5. 使用無DNA酶、RNA酶的離心管和過濾吸頭。6在操作中，應使用不含熒光物質的一次性手套（經(jīng)常替換），不能用手直接觸摸反應管。7. 檢測試劑使用前要完全解凍，8,000rpm離心數(shù)秒后使用，但應避免反復凍融。8. 完成樣本核酸提取后，建議馬上進行下一步實驗，否則請保存于-20待用(24小時內)。9. 如果在標本處理中沒有控制好交叉污染，可能出現(xiàn)假陽性。10.對每次實驗進行質量控制。11.實驗完畢用10%次氯酸或75%酒精處理工作臺和移液器