1、CTGF在低氧性肺血管重建中的作用【關鍵詞】肺血管重建Expressinfintegrin5inendetritiellsanditssteridalregulatinAbstrat:bjetiveTstudytheexpressinfintegrin5inulturedhuanendetritiellsanditsregulatinbysteridalhrnes.ethdsEighteensaplesfetpiendetriuereulturedinvitr.Theulturedendetritiellseredividedintfivegrups:ntrlgrup，E2grup，Pgrup

2、，TAgrupandRU486grup.Theexpressinfintegrin5RNAfeahgruperedeterinedbyreversetransriptplyerasehainreatinethd.ResultsTheexpressinfintegrin5RNAinE2andPgrupas1.4150.286and1.3040.170respetively，hiheresignifiantlyhigherthanthatfntrlgrup1.0820.069，P0.05.InTAandRU486grup，itas0.8820.013and0.8660.054re-spetivel

3、y，hihassignifiantlylerthanthatfntrlgrupP0.05.nlusinsEstradilandprgesterneayregulatetheexpressinfintegrin5.Estradilandprgesterneinreasetheintegrin5RNAinetpiendetriu，andprtetheadhesinleadingtendetrisis.Taxifenandifepristndeelerateurrenefendetrisisbyayfresistingestradilandprgesternerinhibitingetpiendet

4、rialellsfrseretingintegrin5.Keyrds:endetritiells;ellulture;integrin5;reversetransriptin-plyerasehainreatin;steridalhr-nes摘要目的:通過建立低氧性肺動脈高壓大鼠模型，討論結締組織生長因子TGF在大鼠低氧性肺血管重建中的作用。方法:通過連續常壓低氧法建立大鼠低氧性肺動脈高壓模型，用右心導管法測定平均肺動脈壓PAP;稱重計算右心室肥厚指數RV.LV+S;肺組織切片經HE染色后圖像分析技術定量檢測大鼠肺小動脈的形態改變;免疫組織化學染色法測定肺小動脈管壁TGF蛋白表達，并經圖像分析

5、半定量檢測其表達強度。結果:3周后，低氧組大鼠的PAP、RV.LV+S、反映管壁增厚的管壁厚度占血管外徑的百分比和管壁面積占血管總面積的百分比兩指標均高于正常對照組P0.01。正常對照組大鼠肺小動脈壁TGF蛋白未表達;低氧組大鼠肺小動脈壁外膜TGF明顯表達，內膜略有表達，中膜幾乎無表達。結論:常壓低氧3周可成功建立肺動脈高壓大鼠模型，TGF與低氧性肺血管重建親密相關。關鍵詞低氧;肺血管重建;結締組織生長因子長期低氧會導致肺動脈高壓和肺源性心臟病，低氧性肺動脈高壓的形成及開展主要與低氧性肺血管收縮及肺血管重建有關。已經明確，長期低氧可使肺循環血管內皮細胞、平滑肌細胞、外膜成纖維細胞增殖肥大，同時

6、這些細胞產生和分泌的細胞外基質增多、異常沉積，導致低氧性肺血管重建，使肺動脈壓力持續增高，形成慢性肺心病1。多種生長因子對低氧性肺血管重建的形成及維持起著非常重要的作用。結締組織生長因子nnetivetissuegrthfatr，TGF隸屬N家族，能刺激血管平滑肌細胞、人肺成纖維細胞等增生，促進細胞外基質成分的產生，且與眾多和低氧性肺血管重建相關的生長因子，如血管內皮生長因子、轉化生長因子.等關系親密，但TGF在低氧性肺血管重建中的作用目前尚不清楚。本研究通過建立大鼠肺動脈高壓模型，觀察慢性缺氧性肺動脈高壓大鼠肺小動脈構造的變化及肺血管TGF表達程度，旨在討論TGF在缺氧性肺動脈高壓發病中的可

7、能作用。1對象與方法1.1動物20只安康SD雄性大鼠，由東南大學醫學院動物實驗中心提供，平均體重254.03.9g，日齡70d左右;普通大鼠飼料動物中心提供喂養，飲用自來水，自由攝食和飲水，分為低氧組和正常對照組。1.2主要儀器常壓低氧艙自制，主體由厚15的有機玻璃建成，容積約280L966545，配有測氧儀、電磁閥、減壓閥、電動風扇;aLab.4sADInstru-ents生物信號采集系統AustraliaADInstruents公司消費;SP.2000病理圖文報告系統2.0版上海世珈醫療設備消費。1.3主要試劑胃蛋白酶消化液北京中山生物技術消費;濃縮型DAB試劑盒福州邁新生物技術開發消費;

8、TGFL.20Santaruz公司消費;Vltra-SensitiveS.P超敏試劑盒Kit.9706，福州邁新生物技術開發消費。1.4試驗方法1.4.1建立肺動脈高壓大鼠模型采用薛全福法2，將試驗組10只大鼠置于10.00.5%氧濃度的常壓低氧艙內，連續低氧，每次艙內氧濃度從21%降至10%的時間約為30in，每天8h，每周6d，第7天不低氧，共3周;正常對照組10只大鼠置于同一實驗室內，呼吸室內空氣。1.4.2肺動脈壓的測定所有試驗用大鼠以2%戊巴比妥40gkg-1行腹腔內注射麻醉后，將充盈肝素生理鹽水的硅膠導管插入右頸外靜脈，緩慢推入右心室，導管另一端連接靜脈壓力換能器到aLab.4sA

9、DInstruents生物信號采集系統，觀察至屏幕顯示典型的肺動脈壓波形，用hartv3.5.2生物信號分析系統記錄并計算平均肺動脈壓PAP。1.4.3右心室肥厚指標檢測肺動脈壓檢測完畢后放血處死大鼠，完好取出心臟和肺組織，心臟置10%中性甲醛溶液中固定1周，剪去心房組織，別離右心室RV和左心室加室間隔LV+S，濾紙吸干后分別稱重，計算RV.LV+S值以反映右心室肥厚的程度。1.4.4肺組織標本采集及標本切片制作將左肺置10%中性甲醛溶液中固定，標本嚴格于垂直位石蠟包埋，垂直于支氣管細支氣管斷面，沿矢狀面最大周徑處進展橫斷取材約3厚，酒精梯度脫水，二甲苯透明標本，浸蠟，包埋，連續切片厚度5，作

10、HE染色。1.4.5肺組織切片的半定量分析顯微鏡下觀察大鼠肺組織切片，用SP.2000病理圖文報告系統進展圖像采集，IAGE.PRplus4.5軟件進展圖像分析，測量與呼吸性細支氣管及肺泡管伴行的肺小動脈外徑、管壁厚度、血管總面積及管壁面積，計算管壁厚度占血管外徑的百分比T%和管壁面積占血管總面積的百分比A%。每只大鼠肺切片共測量10條血管的上述指標，計算均數進展統計分析。1.4.6免疫組織化學分析將上述肺組織標本切片貼于多聚賴氨酸處理過的載玻片上，常規脫蠟至水，3%H22孵育，胃蛋白酶消化液修復抗原，正常兔血清封閉，滴加一抗山羊抗大鼠，Santaruz公司和二抗兔抗山羊，福州邁新生物技術開發

11、，DAB顯色，蘇木素輕度復染后顯微鏡觀察以細胞質明晰棕色為陽性，并進展免疫組織化學圖像分析。1.4.7統計學處理采用SPSS11.5統計軟件，數據以xs表示，組間均數比擬采用兩樣本均數配對t檢驗。2結果2.1肺動脈高壓模型建立常壓低氧3周后，低氧組的大鼠肺小血管普遍增厚，管腔狹窄，PAP為26.731.52Hg1Hg=0.133kPa，高于正常對照組的15.500.82Hg，差異有顯著性P0.01，提示低氧性肺動脈高壓模型制作成功。2.2右心室肥厚形成常壓低氧3周后，低氧組的大鼠RV.LV+S為33.361.46%，高于正常對照組的22.670.76%，差異有顯著性P0.01，提示低氧3周后產

12、生了右心室肥厚。2.3低氧性肺血管重建模型形成經過肺小血管圖像分析，常壓低氧3周后，低氧組大鼠的T%、A%分別為63.742.54和78.472.73，均高于正常對照組分別為33.455.23和40.563.45，差異有顯著性P0.01，提示低氧3周后低氧性肺血管重建形成。2.4TGF在血管壁的表達正常對照組肺小動脈壁未檢測到TGF表達圖1;而低氧組肺小動脈壁TGF表達呈陽性，且以管壁外膜居多，內皮層略有表達，中膜平滑肌層幾乎無表達圖2。免疫組織化學圖像分析結果提示，肺組織切片TGF陽性面積占肺小動脈面積比正常對照組為0，而低氧組為2.230.30。3討論肺血管重建是肺動脈高壓持續開展的關鍵因

13、素，其病理改變主要為內皮細胞腫脹和肥大、中層平滑肌增生肥厚、膠原纖維和彈力纖維等細胞外基質成分增多。本研究發現，在常壓低氧3周后，大鼠PAP明顯升高，右心室肥厚;圖像分析提示代表肺血管重建的兩個指標T%和A%均較正常對照組明顯增高，說明已成功建立了低氧性肺血管重建模型。TGF是一種富含半胱氨酸的多肽，屬即刻早期基因家族N的成員之一。TGF對血管的內皮細胞、平滑肌細胞、作為支撐構造的細胞外基質等組織均有重要的生物學作用，且對低氧等原因引起的血管生成過程有積極的促進作用3;機械應力如血管壓力增高4、低氧5及與肺血管重建親密相關的血管內皮生長因子6等生長因子均可誘導TGF表達增加。實驗中作者觀察到:

14、正常對照組肺小血管壁未見TGF蛋白表達;而試驗組的肺小血管壁除明顯增厚、內皮細胞腫脹肥大、中層平滑肌增生肥厚、細胞外基質成分增多外，血管組織內可見不同程度的TGF蛋白沉積，尤其以血管外膜纖維組織居多，血管內皮細胞略有表達，中膜平滑肌細胞那么未見表達。TGF是一種重要的致纖維化因子，刺激成纖維細胞增殖、細胞外基質合成是其重要作用;TGF在正常血管平滑肌細胞vasularsthusleell，VS中幾乎不存在，但在粥樣硬化斑塊內未增殖的平滑肌細胞中呈過度表達7，人平滑肌細胞系中TGF瞬間的過表達會導致其凋亡加速8，因此推測TGF僅存在于未增殖或近凋亡的VS中。而本實驗中低氧性肺血管重建的VS呈高度

15、增殖狀態，可能是血管中膜未見TGF表達的原因。TGF促進中層平滑肌增生可能通過旁分泌途徑起作用。所以作者認為，TGF在大鼠低氧性肺動脈高壓和肺血管重建過程中起到一定作用，但其在人體是否有一樣表現，其作用的信號轉導途徑、作用發生的階段、早期干預能否預防肺動脈高壓和肺血管重建的發生以及如何延緩其進展尚待進一步研究。參考文獻1DURIZAG，STENARKKR.ehanissfstruturalredelinginhrnipulnaryhypertensinJ.PediatrRev，1999，2011:91.102.2薛全福，謝劍鳴，胡長貴，等.常壓低氧性大鼠肺動脈高壓模型的建立J.中華結核和呼吸雜

16、志，1989，126:350.352.3KNDS，KUBTAS，SHIT，etal.nnetivetissuegrthfatrinreasedbyhypxiaayinitiateangigenesisinl-labratinithatrixetallprtEinasesJ.aringenesis，2002，235:769.776.4HISHIKAAK，EARBS，NAKAKIT.Statipressureregu-latesnnetivetissuegrthfatrexpressininhuanesangialellsJ.JBilhe，2001，27620:16797.16803.5SHIT，KUBTAS，KNDS，etal.nnetivetissuegrthfatrasaajrangigeniagentthatisinduedbyhy-pxiainahuanbreastanerelllineJ.anerLett，2001，1741:57.64.6SUZUAK，NARUSEK，SUZUAI，etal.VasularendthelialgrthfatrinduesexpressinfnnetivetissuegrthfatrviaKDR，Flt1，andphsphatidylinsitl3-kinase-akt-dependentpathaysinretinalvasular