1、關于植物分子育種之細胞工程第一張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月植物分子育種是指把供體帶有目的性狀的遺傳信息分離提取出來，導入待改良植物細胞中，使它整合、表達和遺傳，并根據人們的農業生產需要選育出帶有目的性狀的優良個體，培育出具有農業經濟價值的新品種。第二張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月細胞工程：是指以細胞為對象，應用生命科學理論，借助工程學原理與技術，有目的地利用或改造生物遺傳特性，以獲得特定的細胞、組織產品或新型物種的一門綜合性科學技術 基因工程：目的基因的定位、分離、重組、表達等。 分子標記輔助育種：DNA分子遺傳標記，或DNA標記。第三張，PPT共一百一十九頁

2、，創作于2022年6月 第一節 植物細胞工程概述第四張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月一、植物細胞工程概念(Definition of plant cell engineering)：1、植物細胞工程是植物生物技術的一個重要組成部分，是在離體培養條件下，細胞水平上對植物材料進行遺傳操作的技術，即對植物體的任何一個部分（器官、組織、細胞、原生質體）進行離體誘導使其稱為完整植株的技術。第五張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月小麥胚組織培養示意圖第六張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月 技術 應用 植物組織與細胞培養技術作物品種改良 植物細胞大批量培養技術名貴藥物、生

3、物藥品 植物細胞融合技術創造新植物種 植物染色體工程技術創造作物新類型 DNA重組技術 植物改良 外源基因導入技術植物改良 與物理、化學技術相結合植物改良 2、植物細胞工程所涉及到的主要技術和應用 第七張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月二、研究任務 通過植物細胞工程這一技術手段，在離體培養條件下研究植物組織、器官、細胞、原生質體經離體誘導形成的愈傷組織形態發生規律、外界環境條件和培養基對它的作用以及由其誘導而形成的再生植株群體的遺傳穩定性和變異性。 第八張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月三、 植物細胞工程的基本理論1、植物細胞工程的基本理論： （1）細胞是構成植物有機體

4、的結構和生命活動的基本結構單位。 （2）植物細胞的全能性，即植物細胞是在生理上和發育上具有潛在全能性（totipotent）的功能單位。 第九張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月* 1838年，MJSchleiden提出細胞學說，1839年TSchwann認為細胞學說也適用于動物。即細胞是生物有機體結構與功能的及基本單位。 * 1902年，德國植物學家GHaberlandt提出了“細胞全能性”理論。他本人被譽為“植物組織培養之父”。2、 植物細胞工程發展過程 第十張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月* 1934年， White（懷特，美國）培養番茄根尖建立了無性繁殖系，獲得

5、了離體根培養的真正成功。1937年，他又發現了B族維生素對離體根生長的重要作用。1939年，懷特成功培養了煙草原形成層細胞。懷特研制出了White培養基。 * 1934年， Gautheret（高斯雷特，法國）培養山毛櫸、黑楊的形成層組織，發現了生長素IAA的促進作用。1939年，他培養胡蘿卜根形成層也獲得成功。第十一張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月* 19371938年， Nobecourt（諾必考特,法國）培養胡蘿卜根和馬鈴薯塊莖的薄壁組織成功。 在這個階段，由于White、Gautheret和Nobecourt等人的出色工作，建立了植物組培的綜合培養基。三人一起被譽為植物組

6、織培養的奠基人。1943年，White重新提出了植物細胞全能性學說，并著了植物組織培養手冊一書。 第十二張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月* 1958年，在美國Steward（施圖爾德,英國）等從胡蘿卜愈傷組織和細胞培養中誘導產生了胚狀體，形成了完整的植株。首次證實了植物細胞全能性理論。 進入60年代，植物組織培養技術進入飛速發展階段，并應用于生產。 * 1960年， Morel（莫雷爾）培養蘭花莖尖成功，實現了快速繁殖和去病毒的目的。該方法繁殖系數極高。第十三張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月 在我國，早在20世紀30年代，李繼侗等進行銀杏離體培養，獲得了小植株。并發

7、現培養基中加入銀杏胚乳提取物可促進離體胚生長。羅宗洛等對玉米根尖培養成功。羅士韋將菟絲子莖尖培養成功并在試管內開花。第十四張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月植物細胞工程涉及部分概念 植物組織培養(Plant tissue culture) 外植體（Explant）：用于體外培養的植物組織。在組織培養中，我們把由活體植物（母體）上切取下來用作離體培養的那部分組織或器官。在組織培養中，我們把由活體植物（母體）上切取下來用作離體培養的那部分組織或器官。 愈傷組織(Callus)：從植物各種器官的外植體增殖而形成的一種無特定結構和功能的細胞團。 器官發生（Organogenesis）：在組

8、織培養和懸浮培養中由培養物形成根和芽的現象 愈傷組織器官發生第十五張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月 胚狀體（somatic embryos ）：在離體培養過程中由外植體或愈傷組織產生與受精卵發育方式類似的胚胎結構現象脫分化（dedifferentiation ）：已分化的細胞在一定因素作用下重新恢復分裂機能并改變其原來的發展方向而沿著一條新的途徑發育的過程。再分化（redifferentiation ）：脫分化的細胞團或組織經重新分化而產生新的具有特定結構和功能的組織或器官的一種現象。 體細胞無性系變異（Somaclone and Somaclonal variation ） 第

9、十六張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月第二節 植物細胞全能性以及分化和去分化第十七張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月一、細胞全能性概述一個細胞所具有的生產完整生物個體的固有能力稱之為細胞的全能性。細胞全能性的相對性不是所有基因型的所有細胞在任何條件下都具有良好的培養反應；即使對于植物細胞而言，細胞全能性也并不意味著任何細胞均可以直接產生植物個體；動植物細胞全能性的表現程度存在明顯的差異。第十八張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月 植物細胞按照分裂能力分為三類：第一類是始終保持分裂能力，如莖尖、根尖及形成層細胞；第二類是永久失去分裂能力的終端分化細胞。如篩管、導

10、管、氣孔保衛細胞等特化細胞；第三類是在通常情況下不分裂，但在受到外界刺激后可以重新啟動分裂的G0細胞，如表皮細胞及各種薄壁細胞。一個植物細胞向分生狀態恢復過程所能進行的程度，取決于它在自然部位上所處位置和生理狀態。第十九張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月根據細胞類型不同從強到弱：營養生長中心 形成層薄壁細胞厚壁細胞（木質化細胞） 特化細胞（篩管、導管細胞）根據細胞所處的組織不同從強到弱：頂端分生組織居間分生組織側生分生組織薄壁組織（基本組織） 厚角組織輸導組織厚壁組織第二十張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月細胞全能性脫分化細胞分裂再分化個體再生細胞全能性的表達是通過細胞

11、脫分化和再分化實現的，在大多數情況下，脫分化是細胞全能性的前題，再分化是細胞全能性表達的最終體現。第二十一張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月二、細胞脫分化培養條件下使一個已分化的細胞回復到原始無分化狀態或分生細胞狀態的過程就是細胞脫分化離體培養下，脫分化過程發生在第一次有絲分裂之前。靜止細胞啟動分裂是分化細胞成功脫分化的重要標志。第二十二張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月（一）細胞脫分化過程可分為3個階段：第二十三張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月(二) 細胞生理與結構變化第二十四張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月（三）、 細胞脫分化的調控機理細

12、胞周期對脫分化的調控PSK的發現及其對細胞脫分化的影響激素誘導表達基因與細胞脫分化細胞脫分化與染色體解凝聚第二十五張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月1 細胞周期對植物細胞脫分化的調控第二十六張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月CycD基因首先表達生成CycD,在相關調節因子的幫助下CycD復合體使CDKa活化，進而對Rb(G1期限制點調控分子)磷酸化，使細胞通過“限制點”進入分裂周期后，則CDKb與CycB以及相關的調節蛋白質完成從S期到M期的調控。2、第二十七張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月用3、植物激素的調控作用第二十八張，PPT共一百一十九頁，創作于2

13、022年6月植物硫化激動素(PSK) 是近年來發現的一種植物體內小分子肽類生長調節因子,具有促進細胞增殖等多種生物活性. 第二十九張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月第三十張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月第三十一張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月（四）、 細胞脫分化與愈傷組織形成細胞脫分化是細胞狀態的改變，但成功的脫分化必然會導致細胞分裂。對于單個細胞而言，分化細胞啟動分裂發生在細胞完全脫分化之后。第三十二張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月器官，組織培養時細胞分裂首先發生在傷口部位愈傷組織的形成是脫分化的細胞重新進入活躍分裂的結果，但不是脫分化的

14、過程。有些外植體的細胞脫分化以后，直接形成胚性細胞進而形成成體細胞胚。在組織器官培養時，愈傷組織內的細胞脫分化過程是不一致的。第三十三張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月三 培養細胞再分化所謂細胞分化（differentiation）,是指導致細胞形成不同結構，引起功能改變或潛在發育方式的過程。從分化的遺傳控制角度講，細胞分化是各個處于不同時空條件下的細胞，基因表達與修飾差異的反應，所以，分化也可以說是相同基因型的細胞由于基因選擇性表達所反應的不同表現型。細胞分化中基因組變化：基因表達產物及其調控與修飾是細胞分化的本質所在，越來越多的研究顯示，細胞分化主要受基因在轉錄水平和轉錄后水平

15、的調控，其中一些特異性蛋白質基因的表達調控在細胞分化過程中起到了重要作用。第三十四張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月極性與細胞分化所謂極性（polarity），是指植物的器官、組織、甚至單個細胞在不同的軸向上存在的某種形態結構以及生理分化上的梯度差異。在很多情況下，細胞的不均等分裂是細胞極性建立的標志。第三十五張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月TE的形成與細胞分化通常把離體培養中TE(tracheary elements,管狀分子)細胞的出現作為組織分化的標志。而極性的建立似乎又是微管發生的一個信號，極性建立后生長素按極性方向流動，導致TE細胞分化。由于TE細胞在分化過

16、程中具有細胞壁加厚，原生質體自溶等容易觀察的細胞特征，從而又為植物細胞分化研究提供了模式體系。第三十六張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月激素對細胞分化的調控作用激素是離體培養條件下調控細胞脫分化和再分化的主要因素。生長素和細胞分裂素、GA3、 ABA 、乙烯如：細胞分裂素和生長素對于細胞生長和分化具有同等重要的協調作用，他們的量與比值的不同配合，對于細胞分化起著重要調節作用。先用生長素處理，后用細胞分裂素處理，則有利于細胞分裂而不利于細胞分化。反之，則有利于細胞分化。如果兩者同時處理，則可促使分化頻率的提高。第三十七張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月 研究顯示，植物激素

17、對細胞生長與分化的調控是一個復雜的級聯調控過程，離體培養條件下，由于外植體細胞所處的生理狀態不同以及內源激素水平的差異，試圖尋找外源激素水平在分化中作用的共同模式可能是很難的。第三十八張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月第三節 培養基的基本成分和主要培養基 培養基是植物組織培養成功的關鍵和保證。 培養基是培養成功的關鍵，并因物種、同一物種不同型、同一基因型不同外植體的要求不同而有差異。第三十九張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月Media 同一物種不同基因型同一基因型不同外植體genus第四十張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月*1902年Haberlandt試圖

18、離體培養綠色葉肉細胞以解決碳源問題，但未能實現。因此離體培養必需依賴外來源。 * 常用碳源為蔗糖、果糖、葡萄糖，其中蔗糖是最常用的，濃度為25 。 * 其它形式碳源有麥芽糖、半乳糖、甘露醇、乳糖 * 高壓滅菌和過濾滅菌對碳源的影響 一、有機營養物（Organic compounds）1、糖第四十一張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月培養基的發展過程1865年 Knop 鹽溶液培養基1939年 Gautheret 愈傷組織培養基1943年 White 根培養基1925年Uspeaski和Uspenskaia海藻培養基1962年 Mnjrashige & Skoog MS培養基改良培養基

19、B5-十字花科(Gamborg 等，1968) N6(朱自清等,1975,1987) & Nitsch H (Nitsch,1969) -禾本科植物花粉培養 WS (Wolter & Skoog 1966) & LS(Lingmal & skoog 1962) -木本植物 第四十二張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月MS培養基 30、40年代簡單培養基無機鹽濃度低，雜質高，培養效果差維生素氨基酸生長調節物質調節無機鹽濃度（含有較高濃度的硝酸鹽、銨鹽、鉀鹽）胡蘿卜黑櫻桃MS基本培養基改良MS培養基 椰乳、水解酪蛋白、氨基酸等 增加各種無機鹽濃度，尤其是N和K的濃度第四十三張，PPT共一

20、百一十九頁，創作于2022年6月糖的作用* 在胡蘿卜的細胞培養中，高濃度蔗糖下形成的胚狀體較少，但其發育更接近于合子胚的情況。 *在由煙草開花植株莖形成的愈傷組織及豬耳草莖、葉組織的再生中，葡萄糖促進花芽形成。 *在某些試驗中發現，在同一激素比例下，隨糖濃度的不同，器官形成的類型也可能不同。第四十四張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月 含氮物質-維生素類物質和肌醇等 維生素類物質： 硫胺素-維生素B1 吡哆素-維生素B6 煙 酸-維生素B3 泛酸鈣-維生素B5 肌 醇；水解酪蛋白（CH）；椰乳 （CM）；玉米乳；麥芽提取液（ME） 番茄汁（TJ）；酵母提取液（YE） 2、氮* 各種培

21、養基中無機N都以兩種形式供應：硝態氮和銨態氮配合使用，若單獨應用硝態氮遠優于銨態氮，因硝態氮的培養基易造成堿漂移，加入少量銨鹽會抑制這種漂移。 第四十五張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月含氮物質作用*肌醇、腺嘌呤、酪蛋白水解物（CH）、酵母提取物（YE）和椰子汁等，對胚狀體和芽的形成有良好的促進作用。 *活性炭在花藥培養中對提高誘導頻率有良好作用，已發現在胡蘿卜、洋蔥等植物的體細胞培養中，加入活性炭也促進胚狀體和器官的形成。 第四十六張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月愈傷組織器官發生 植株再生生長素、細胞分裂素、赤霉素等激素之間的互相平衡作用3 生長激素 A、生長素（用

22、于細胞分裂和根的分化） 常用生長素：IBA吲哚丁酸；NOA萘氧基乙酸 IAA吲哚乙酸；2,4,5T2,4,5三氯 苯氧乙酸; NAA萘乙酸；PCPA-對氯 苯氧基乙酸; 2,4-D-2,4-二氯苯氧乙酸 * NAA和IBA常與細胞分裂素結合用于芽的增長。 * 生長素可溶解在稀NaOH中或溶于乙酸。第四十七張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月 B、細胞分裂素 常用的有：Kt-激動素 BAP-芐氨基嘌呤 2iP-異戊烯腺嘌呤 * 溶于稀酸或稀堿 C、赤霉素：GA3，較生長素和細胞分 裂素少用，可溶于水。 *有報道可以促進高粱形成的不定胚再生小植株的正常發育。 * 注意激素的種類、濃度（絕

23、對量）和配比對愈傷組織誘導、植株再生的作用。第四十八張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月二 無機營養物質1 氮和鐵對某些組織胚狀體形成的作用*胡蘿卜細胞培養中發現培養基中的氮含量與胚狀體形成密切有關。煙草花藥培養中鐵對胚狀體的形成有良好促進作用。2 無機鹽濃度*在芽形成后，根的誘導形成通常降低培養基中無機鹽的濃度并去除培養基中細胞激動素，或再加一種生長素(IAA、NAA、IBA)。通常采用White或1/2MS培養基。第四十九張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月* 愈傷組織缺無機營養表現癥狀:（Heller,1965） N-某些愈傷組織出現花青甙， 沒有導管形成 N、P或K

24、-細胞過度增大且形成層減少 S-愈傷組織非常明顯褪綠 Fe-細胞分裂停止 B-細胞分裂和細胞伸長遲緩 Mg和Mn-影響細胞伸長第五十張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月(4) 瓊脂 *瓊脂并不是培養基必要的成分， 對培養物起到支持作用。 *使用濃度0.8-1.0%。*培養基類型:固體培養基和液體培養基。 *培養基的pH值: a 通常為5.0-6.0 b pH6.0培養基硬度大。 c 目前多采用pH=5.8。第五十一張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月MS基本培養基（mg / L）,pH=5.8 硝酸銨1650鉬酸鈉0.25硝酸鉀1900硫酸銅0.025氯化鈣440氯化鈷0.

25、025硫酸鎂370硫酸亞鐵27.8磷酸二氫鉀170Na2EDTA37.3碘化鉀0.83甘氨酸硼酸602肌醇100硫酸錳22.3蔗糖（）3硫酸鋅8.6第五十二張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月常用培養基的分類與特性 根據目前常用培養基配方中含鹽量多少可將培養基分為以下四大類。 （一）含鹽量較大的培養基 較高濃度的硝酸鹽、銨鹽和鉀鹽，微量元素種類也很多 MS培養基以及改良的MS培養基。LS（Linsmaier和Skoog，1965）、BL（Brown和Lawrence，1968）、ER（Eriksson，1965）。 該類培養基有利于愈傷組織的誘導、生長和細胞培養。其中MS培養基在各類

26、植物的組織、器官、細胞和原生質體培養中都取得很好的效果，是應用范圍最廣和適應性最強的培養基。 第五十三張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月（二）硝酸鉀含量較高的培養基 這類培養基鹽濃度也很高，尤其是硝酸鉀的含量較高，如B5（Gamborg等，1968）、N6（朱至清等，1975）、SH（Schenk和Hildebrandt，1972）。培養基中的 和 由NH4H2PO4提供。 B5培養基含有較低的銨。實踐證明，有些植物的愈傷組織和懸浮培養物在B5培養基上更適宜，比在MS培養基上生長得要好，尤其是那些對銨比較敏感的植物組織和細胞的離體培養效果更好。 N6培養基中也含有較低濃度的銨離子，

27、尤其是氨態氮和硝態氮的比例很合理，在禾谷類植物的花藥、花粉和原生質體培養中得到廣泛應用。 第五十四張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月（三）含鹽量中等的培養基 這類培養基中大量元素為MS的1/2，微量元素種類減少，但含量增加，維生素種類比MS多，如H培養基（Bourgin 和 Nitsch，1979）。 第五十五張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月（四）低鹽濃度的培養基 這類培養基包括White培養基（1943）、WS（Wolter和Skoog，1966）和HE培養基（Heller，1953）等，其中White培養基由于無機鹽的數量比較低，更適合木本植物的組織培養。 以上四

28、類培養基中，前兩類培養基比較適合愈傷組織誘導和細胞培養，但選用哪一類培養基，應依植物種類、基因型和外植體等而定；后兩類培養基有利于根的形成。誘導愈傷組織常用的培養基為MS和B5。高鹽濃度的培養基可能對培養過程中愈傷組織數量及鮮重的增加有利。 第五十六張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月*培養基選擇與制備 1、培養基選擇 2、培養基制備 A、逐一稱取藥品直接配成用于接 種用的培養基。 B、先配成母液備用。第五十七張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月*促進組織和細胞培養中器官分化和胚狀體的形成應注意以下幾點： 降低或除去原來細胞增殖培養基中的生長素，這點在用2,4-D 誘導細胞

29、脫分化時更要注意；或用NAA、IAA代替2,4-D。但也要注意在某些情況中，低濃度的2,4-D對胚狀體形成的促進作。 調整培養基中生長素/細胞激動素的比例，通常較高濃度的細胞激動素利于長芽，而較高濃度的生長素利于長根，但細胞激動素對胚狀體的形成通常不利。 除了激素的比例外，也要注意所加激素的絕對量的響。第五十八張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月 要注意所用生長素和細胞激動素的種類，因為同類激素的不同化合物在不少情況下作用也不同。在某些情況下也可以考慮配合使用其它類激素如ABA、赤霉素等或生長抑制物質等 提高培養基中的氮含量及其它鹽的濃度。 在不少情況下，還要注意順序改變培養基的激素

30、成分及其它營養物質。第五十九張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月第三節 植物細胞及組織培養第六十張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月1、定義植物細胞培養：指在離體條件下，將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養基中，進行振蕩培養。得到分散成游離的懸浮細胞，通過繼代培養使細胞增殖，而獲得大量的細胞群體的一種技術。一、植物細胞培養 第六十一張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月植物細胞培養的意義 1懸浮細胞大規模培養生產天然植 物成分 2植物細胞培養可進行突變體篩選 第六十二張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月植物細胞按照培養對象分類： 單細胞培養 單倍體培養

31、 原生質體培養第六十三張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月2、植物單細胞培養方法 (1)固體培養：是在微生物培養基基礎上發展起來的植物細胞培養方法。一般添加一定比例的瓊脂起固化作用。 (2)固定化培養：屬于固體培養，指將游離細胞包埋在多糖或多聚化合物制備的網狀支持物中，培養液呈流動狀態的無菌操作技術。第六十四張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月(3)液體培養：也是在微生物培養基礎上發展起來的。可分為: 振蕩培養 旋轉培養 靜止培養 紙橋培養 (4)細胞懸浮培養：屬于液體培養，指植物細胞或小細胞團在液體培養基中大規模進行培養。第六十五張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年

32、6月(5)分批培養：又稱成比培養，指在一個固定容積的培養基中培養細胞，當培養基中主要的營養物質耗盡時生長就停止。 (6)連續培養：在培養過程中由于不斷注入新鮮培養基，故培養液中營養物質能夠連續得到補充，培養物的容積一般是恒定的。第六十六張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月3、植物單細胞制備（1）獲得植物單細胞三種途徑 由完整的植物器官分離單細胞的方法 由培養組織中分離單細胞 花粉 葉肉組織是分離單細胞的最好材料。第六十七張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月（2）制備方法機械法：指通過機械磨碎、切割植物體從而獲得游離的單細胞。 優點：細胞不受酶傷害。 缺點：只適合于排列松散的

33、薄壁細 胞、效率低、產量少。 1969年，Gnanam和Kulandaivelu用該方法分離出幾種成熟葉片葉肉細胞。 第六十八張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月酶解法：指用專一的水解酶在溫和條件下分解胞間層，分離細胞。 優點：最有效的一種方法。 缺點：成本較高，酶對細胞有一 定傷害。 1968年，Takebe等用該方法分離煙草葉肉細胞成功。 第六十九張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月愈傷組織誘導法：指將愈傷組織反復繼代，再轉移至液體培養基振蕩培養。添加生長素或酶。第七十張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月建立懸浮細胞培養系第七十一張，PPT共一百一十九頁，創作

34、于2022年6月4、單細胞培養方法舉例 (1)平板培養法 指將一定量細胞接種到或混合到一薄層固體培養基里進行培養的方法。 此法是Bergman (貝格曼，1960) 首創。平板培養的優點是便于在顯微鏡下對細胞進行定點觀察,選擇單細胞株和篩選突變體。第七十二張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月平板培養法具體步驟： 單細胞懸浮液的制備，并記數。 調節細胞密度。 培養基選擇與凝固劑選擇，澆平板。 接種培養。第七十三張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月平板培養法第七十四張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月（2）看護培養與飼養層培養法 看護培養：是指用一塊活躍生長的愈傷組織

35、來促進培養細胞持續分裂和增殖的培養方法。 謬爾（Muir，1953）首創此法。該方法的優點是簡便易行，效果好。但不能在顯微鏡下追蹤細胞分裂、生長過程。第七十五張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月第七十六張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月飼養層培養：是用處理過的、無活性或分裂慢的細胞來飼養所需培養的細胞，使其分裂和生長。 飼養層培養具體方法有四種： 飼養細胞與靶細胞混合。 前者位于下層，后者相反。 一起培養于液體培養基中。 雙層濾紙植板培養第七十七張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月第七十八張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月（3）液體淺層靜置培養法 液

36、體淺層靜置培養法：指將一定密度的懸浮細胞放在培養皿中形成一淺薄層，封口靜止培養。 該方法優點：易于補加新鮮培養基，便于鏡檢。 第七十九張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月（4）培養細胞生長的測定方法 細胞計數法：用血球計數板，以cells/ml表示。 細胞體積：將細胞離心于離心管內，測定細胞層所占體積。 細胞密實體積（PCV）法 細胞鮮重或干重第八十張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月（5）微室培養 是指在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細胞液培養在少量培養基上，使其分裂增殖形成細胞團的方法。 此法是De Ropp (戴洛普，1955) 首創，Torry (托瑞，1957)

37、、Jones(瓊斯，1960)改進。優點是便于在顯微鏡下進行少量單細胞活體連續觀察。 第八十一張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月第八十二張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月5、懸浮細胞培養的同步化方法 （1）物理方法 體積選擇法：又稱分級過篩法 冷處理法 （2）化學法 饑餓法 抑制法 不連續密度梯度離心法第八十三張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月6、細胞的保存 （1）繼代培養保存法 懸浮培養的細胞每隔12周更換一次新鮮培養基繼代培養。 （2）低溫保存法 一般選擇510溫度下培養，每隔10天更換一次培養液。 （3）冰凍保存 低溫保存 超低溫保存第八十四張，PPT

38、共一百一十九頁，創作于2022年6月7、植物細胞培養的應用 （1）與整株植物相比，細胞培養技術生產次生代謝物的優點如下： 生產條件可控制。可選擇優良的細胞系和優化的培養條件提高代謝物產量。節約土地、能源，生產不受季節限制。 無菌培養，可減少病蟲害。 通過特定生物轉化途徑獲得均一有效成分。 探索新的合成途徑，獲得新的有用物質。第八十五張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月（2）細胞培養產品系列 藥用代謝物，包括苷類、甾醇類、生物堿、醌類、蛋白質類等。 天然食品、食品添加劑，如色素、香料、甜味劑等。 殺蟲劑、殺菌劑。 飼料、精細化工產品， 第八十六張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年

39、6月 植物組織培養包括種子培養、胚培養、細胞培養、愈傷組織培養、芽培養、器官培養、原生質體培養和莖尖培養。二、植物組織培養的類型第八十七張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月 1、種子培養 種子培養（Seed culture）是指在離體條件下通過種子獲得苗或植株的培養。第八十八張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月 2、胚培養 胚培養（Embryo culure）是指離體成熟胚或幼胚的培養。第八十九張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月 3、器官培養 器官培養（Organ culture）是指離體植物器官的培養，可以包括不同的類型，如莖尖（shoot tip）、芽培養、

40、根培養和花藥培養。第九十張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月 4、細胞培養 細胞培養（Cell culture）是指保持較好分散性的離體細胞或很小的細胞團的液體培養。第九十一張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月5、原生質體培養 原生質體培養（Protoplasm culture）是指利用纖維素酶和果膠酶去除植物細胞壁而獲得的完整的具有活力的原生質體的培養。第九十二張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月純化的葉肉原生質體第九十三張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月第九十四張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月（一）微型繁殖技術1）保持優良品種的遺傳特

41、性;2）高效快速地實現種苗的大量繁殖,在短時間中獲得大量的優質種苗.第九十五張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月（二）作物脫毒第九十六張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月（三）人工種子第九十七張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月（四）單倍體育種第九十八張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月花藥 花粉細胞培養 接種脫分化愈傷組織 分化出小植物再分化單倍體植株移栽正常植株染色體加倍第九十九張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月（五）植物體細胞雜交第一百張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月第四節 細胞工程在植物分子育種中的生物反應器大規模培養第一百零一張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月 1959年，圖萊克（Tulecke）和尼 克爾（Nickell）首次將微生物培養用 的發酵工藝應用于植物細胞懸浮培養。第一百零二張，PPT共一百一十九頁，創作于2022年6月一、培養特性 1植物細胞本身的特性 （1）植物細胞較大。 （2）培養體系有較多的大小不等細胞團。 （3）細胞壁在培養中易被