1、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號傳遞概述細(xì)胞通訊（Cell communication ） 一個細(xì)胞發(fā)生的信息通過介質(zhì)（又稱配體）傳遞到另一個細(xì)胞并與靶細(xì)胞相應(yīng)的受體相互作用，然后通過細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生胞內(nèi)一系列生理變化，最終表現(xiàn)細(xì)胞整體的生物學(xué)效應(yīng)的過程。 細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間實(shí)現(xiàn)通訊的關(guān)鍵過程，它對多細(xì)胞生物細(xì)胞間功能的協(xié)調(diào)、控制細(xì)胞的生長和分裂、組織發(fā)生與形態(tài)建成時必須的。細(xì)胞通訊方式分泌化學(xué)信號的通訊內(nèi)分泌旁分泌自分泌通過化學(xué)突觸傳遞神經(jīng)信號細(xì)胞間接觸依賴性的通訊（細(xì)胞間直接接觸，通過與質(zhì)膜結(jié)合的信號分子影響其他細(xì)胞）間隙連接實(shí)現(xiàn)代謝耦聯(lián)或電耦聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)及其特征具有信號識別的特異性，放大作用

2、和信號終止、下調(diào)，細(xì)胞對信號的整合作用。細(xì)胞內(nèi)信號蛋白的相互作用細(xì)胞內(nèi)信號蛋白的相互作用是靠蛋白質(zhì)模式結(jié)構(gòu)域所特異性介導(dǎo)的。信號分子與受體信號分子 物理信號化學(xué)信號：激素、局部介質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)各種化學(xué)信號根據(jù)其溶解性通常分為兩類：親脂性信號分子：甾類激素、甲狀腺素親水性信號分子：神經(jīng)遞質(zhì)、局部介質(zhì)、大多數(shù)肽類激素（生長因子、細(xì)胞因子、內(nèi)分泌激素）氣體NO受體：是一種能識別和選擇性結(jié)合某種配體的大分子，主要為蛋白質(zhì)，多為糖蛋白，少數(shù)為糖脂。 根據(jù)靶細(xì)胞上受體的存在位置，可將受體分為：細(xì)胞內(nèi)受體 位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)或核基質(zhì)中，主要識別結(jié)合小的脂溶性信號分子，為胞外親脂性信號分子所激活。細(xì)胞表面受體 識別

3、和結(jié)合親水性信號分子；根據(jù)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和受體蛋白類型不同，分為：離子通道耦聯(lián)受體G蛋白耦聯(lián)受體酶聯(lián)受體（受體酪氨酸激酶、細(xì)胞因子類受體超家族、受體絲/蘇氨酸蛋白激酶）免疫球蛋白超家族TNF或NGF類受體家族非受體酪氨酸激酶受體對信號系統(tǒng)的調(diào)節(jié)受體數(shù)量的調(diào)節(jié)向下調(diào)節(jié)：數(shù)量減少向上調(diào)節(jié)：數(shù)量增加機(jī)制：受體合成或分解速度變化； 膜受體介導(dǎo)的內(nèi)吞與受體的再循環(huán)； 受體的位移或活性部位的暴露受體親和力的調(diào)節(jié)：受體磷酸化與去磷酸化控制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白活性的方式： 通過配體的調(diào)節(jié);通過G蛋白調(diào)節(jié)；通過可逆磷酸化調(diào)節(jié)第二信使學(xué)說： 胞外化學(xué)物質(zhì)（第一信使）不能進(jìn)入細(xì)胞，它作用于細(xì)胞表面受體，而導(dǎo)致產(chǎn)生胞內(nèi)第二信使

4、，從而激發(fā)一系列生化反應(yīng)，最后產(chǎn)生一定的生理效應(yīng)，第二信使的降解使其信號作用終止。分子開關(guān)：細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中通過結(jié)合GTP和水解GTP或通過蛋白質(zhì)磷酸化與去磷酸化而開啟或關(guān)閉蛋白質(zhì)的活性。第二節(jié) 細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路細(xì)胞內(nèi)受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)受體超家族的本質(zhì)是依賴激素激活的基因調(diào)控蛋白。在細(xì)胞內(nèi)，受體與抑制性蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，處于非活化狀態(tài)；當(dāng)信號分子與受體結(jié)合，將導(dǎo)致抑制性蛋白從復(fù)合物上解離下來，使受體通過暴露它的DNA結(jié)合位點(diǎn)而被激活。類固醇激素誘導(dǎo)的基因活化通常分為兩個階段：直接激活少數(shù)特殊基因轉(zhuǎn)錄的初級反應(yīng)階段，快速反應(yīng)；初級反應(yīng)的基因產(chǎn)物再活化其他基因產(chǎn)生延遲的刺激反應(yīng)，對初級反應(yīng)起

5、放大作用。NO作為氣體信號分子進(jìn)入靶細(xì)胞直接與酶反應(yīng)NO由一氧化氮酶（NOS）催化合成后擴(kuò)散到鄰近細(xì)胞，與鳥苷酸環(huán)化酶活性中心結(jié)合，改變酶的構(gòu)象，導(dǎo)致酶的活性增強(qiáng)和cGMP合成的增多，cGMP作為第二信使介導(dǎo)蛋白質(zhì)的磷酸化過程，發(fā)揮多種生物學(xué)作用。第三節(jié) G蛋白耦聯(lián)受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)G蛋白耦聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)與激活 G蛋白耦聯(lián)受體，指配體-受體復(fù)合物與靶蛋白的作用要通過G蛋白的耦聯(lián)，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生第二信使，從而將胞外信號跨膜傳遞到胞內(nèi)影響細(xì)胞的行為。 G蛋白是三聚體GTP結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白的簡稱，位于質(zhì)膜胞漿一側(cè)，有G、G、G亞基組成，G和G亞基以異二聚體存在，G和G亞基分別通過共價結(jié)合脂分子錨定于膜上，G

6、本身具有GTPase活性，是分子開關(guān)蛋白。 當(dāng)配體與受體結(jié)合，三聚體G蛋白解離，并發(fā)生GDP與GTP的交換，游離的G-GTP處于活化的開啟狀態(tài)，導(dǎo)致結(jié)合并激活效應(yīng)器蛋白，從而傳導(dǎo)信號； 當(dāng)G-GTP水解成G-GDP時，則處于失活的關(guān)閉狀態(tài)，終止信號傳遞并導(dǎo)致三聚體G蛋白的重新組裝，系統(tǒng)恢復(fù)進(jìn)入靜息狀態(tài)。G蛋白耦聯(lián)受體介導(dǎo)的細(xì)胞信號通路以cAMP為第二信使的信號通路磷脂酰肌醇雙信使信號通路G蛋白耦聯(lián)離子通道的信號通路G蛋白耦聯(lián)受體介導(dǎo)離子通道的調(diào)控信號途徑特點(diǎn)：1.受體/離子通道復(fù)合體,四次/六次跨膜蛋白 2.跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)無需中間步驟,又稱配體門離子通道 3.主要存在于神經(jīng)細(xì)胞或其他可興奮細(xì)胞間

7、的突觸信號傳遞 4.有選擇性:配體的特異性選擇和運(yùn)輸離子的選擇性如乙酰膽堿激活的通道,只運(yùn)輸Na+和Ca+,-氨基丁酸激活通道只運(yùn)輸Cl-乙酰膽堿-N受體（260KD）外周型：5個亞基組成調(diào)節(jié)主要為亞基變化通道開啟：Na+內(nèi)流，K+外流，膜去極化。注釋：M-型乙酰膽堿受體（乙酰膽堿的結(jié)合引發(fā)Gi亞基的活化并與G解離，k+通道開放，引起質(zhì)膜超極化）3、Gt蛋白耦聯(lián)的光受體的活化誘導(dǎo)cGMP-門控陽離子通道的關(guān)閉（圖8-25）p245G蛋白與視紫紅質(zhì)（光受體）耦聯(lián)，稱之為傳導(dǎo)素（transductin，Gt）4.3酶連受體介導(dǎo)的信號傳遞一、受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kin

8、ases, RTKs）包括6個亞族信號傳導(dǎo)：配體受體受體二聚化受體的自磷酸化激活RTK胞內(nèi)信號蛋白啟動信號傳導(dǎo)RTK-Ras-Raf信號途徑RTK-PL3K-AKT信號途徑（1）、配體與受體在胞外與受體結(jié)合并引發(fā)構(gòu)象改變，因此配體的結(jié)合導(dǎo)致受體二聚化；（2）、當(dāng)受體二聚化后，激活受體的蛋白酪氨酸激酶活性；（3）、活化的PTKs可結(jié)合帶有SH2結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白或信號蛋白。SH2SH3首先在Src蛋白中發(fā)現(xiàn),所以稱作Src同源區(qū)(Src homolog region 2 and 3, SH2, SH3)SH2選擇結(jié)合在磷酸酪氨酸殘基，SH3選擇結(jié)合在富含脯氨酸基序（motif）（4）在GEF作用下

9、，無活性的Ras-GDP變成有活性的Ras-GTPRTK-Ras信號通路配體RTKadaptorRasRaf（MAPKKK）絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶MAPKKMAPK有絲分裂原活化蛋白激酶（mito genactivated化修protein kinase）進(jìn)入細(xì)胞核其他激酶或基因調(diào)控蛋白（轉(zhuǎn)錄因子）的磷酸化。RTKGNRPRASRAFMEKERKTranscription factortranscriptionRTK-PL3K-ATK信號途徑G蛋白耦聯(lián)受體介導(dǎo)的MAPK的激活(1) MAPK(Mitogen-activated protein kinase)又稱ERK（extracelular

10、 signal-gulated kinase）真核細(xì)胞廣泛存在的Ser/Thr蛋白激酶.(2)MAPK的底物:膜蛋白(受體、酶)、膜漿蛋白、核骨架蛋白、及多種核內(nèi)或胞漿內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在細(xì)胞增殖和分化中具有重要調(diào)控作用。(3)PKC、PLC與G蛋白耦聯(lián)受體介導(dǎo)的MAPK激活(4)G蛋白耦聯(lián)受體激活G蛋白：G蛋白亞基或亞基激活PLC：PKC通過Ras或Raf激活MAPK：(5)PKA對G蛋白耦聯(lián)受體-MAPK途徑的負(fù)調(diào)控(6)cAMP，MAPK：cAMP直接激活cAMP依賴的PKA：PKA可能通過RTK或通過抑制Raf-Ras相互作用起負(fù)調(diào)控作用。4.4其他信號途徑NF-B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑旁激素信號

11、轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（又稱生長分化因子（growth and differentiation factor, GDF）,由誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生，并通過擴(kuò)散的方式到達(dá)鄰近的靶細(xì)胞）Hedgehog信號途徑Wnt PathwayNotch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑二、細(xì)胞對信號的控制靶細(xì)胞對信號分子的5種脫敏方式：受體沒收：受體-配體復(fù)合物內(nèi)吞受體下調(diào)：反應(yīng)減弱（遲發(fā)相）受體失活：受體磷酸化：受體與Gs解耦聯(lián)，cAMP反應(yīng)停止并被PDE降解信號蛋白失活產(chǎn)生抑制蛋白細(xì)胞周期調(diào)控內(nèi)容提要細(xì)胞周期的概念細(xì)胞周期的驅(qū)動因子（cyclin and CDK）細(xì)胞周期的抑制因子（p21、p27、p15、p16、）細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制G1期、G2-S

12、、S期、M期(G2-M，中期)細(xì)胞周期的基本概念細(xì)胞增殖周期通常簡稱細(xì)胞周期（cell cycle），是指細(xì)胞從上一次細(xì)胞分裂結(jié)束到本次分裂終了的過程或間隔時間。根據(jù)細(xì)胞周期不同時相的特點(diǎn)，可將細(xì)胞周期順序分為4個連續(xù)階段，即G1期(gap phase 1)、S期（synthesis phase）、G2期（gap phase 2）及M 期（mitotic phase）.1、1細(xì)胞周期的4個階段及其與G0期的關(guān)系1、2早期胚胎細(xì)胞的細(xì)胞周期早期胚胎細(xì)胞周期主要指受精卵在卵裂過程中的細(xì)胞周期。由于卵細(xì)胞在成熟過程中已經(jīng)積累了大量的物質(zhì)基礎(chǔ)，基本可以滿足早期胚胎發(fā)育的需要 ，因此早期胚胎細(xì)胞周期的G

13、1和G2期非常短，以至認(rèn)為其僅含有S期和M期。非洲爪蟾精卵前12個細(xì)胞周期共需8h，而其體細(xì)胞的細(xì)胞周期持續(xù)時間約24h。第一節(jié) 細(xì)胞周期的驅(qū)動力量cyclinhe CDK的磷酸化和去磷酸化細(xì)胞周期的程序控制主要通過各種細(xì)胞周期蛋白（cyclin）和依賴細(xì)胞周期蛋白的蛋白激酶（cyclin dependent kinase， CDK）有序的磷酸化和去磷酸化從而控制cyclin-CDK復(fù)合物的活性來實(shí)現(xiàn)的。在各個階段還可以分別處理來自細(xì)胞內(nèi)外的各種信息并作出相應(yīng)的應(yīng)答。組成這一自動程控機(jī)器的成分還有細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制因子（cyclin dependent kinase inhibit

14、or， CDI）、磷脂酶和泛素（ubiquitin）哺乳動物細(xì)胞周期不同周期蛋白的表達(dá)時期不同，與不同的CDK結(jié)合，調(diào)節(jié)不同CDK激酶的活性。部分哺乳動物和酵母細(xì)胞周期蛋白在細(xì)胞周期中的積累及其與CDK激酶活性的關(guān)系。細(xì)胞受絲裂原刺激后合成cyclin的時序和相對濃度2、2 CDK家族CDK是一組絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，目前發(fā)現(xiàn)有9種成員，有不同程度的同源性，故稱CDK家族，各成員命名為CDK1，2，39.CDK含催化亞基，但需要cyclin提供調(diào)節(jié)亞基才有活性。通常以cyclin-CDK復(fù)合物形式出現(xiàn)。CDK的上游尚有CDK活化激酶（CDK-activating kinase，CAK）。CD

15、K也能與CDI結(jié)合，而抑制細(xì)胞周期。此外，CDK 自身的磷酸化狀態(tài)與其活性也密切相關(guān)，如CDK 中的蘇氨酸（T）殘基和酪氨酸（Y）殘基磷酸化，可使CDK激活，而活化的Thr殘基發(fā)生去磷酸化則使CDK失活。CDK1 CDK1又稱cdc2.cdc（cell division cycle gene）.這些基因在進(jìn)化上高度保守，如酵母的cdc2與人的踩單車28結(jié)構(gòu)類似，編碼產(chǎn)物是相對分子質(zhì)量為34000的蛋白質(zhì)，一般表示為p34cdc2/cdc28。P34對G1/S轉(zhuǎn)換和G2/M轉(zhuǎn)換都是必需的.P34與cyclin B結(jié)合成的復(fù)合物是成熟促進(jìn)因子(MPF)的重要組分,對驅(qū)動細(xì)胞進(jìn)入M期至關(guān)重要.199

16、1年冷泉港(cold spring harbor)實(shí)驗(yàn)室發(fā)起的一次細(xì)胞周期研討會上決定把cdc2命名為CDK家族的第一號,即CDK1.細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CDI）CDI（yclin dependent kinase inhibitor）是CDK的抑制物,通過與CDK非共價結(jié)合而抑制CDK活性的，是與cyclin-CDK作用相對抗的重要機(jī)制之一，參與細(xì)胞周期檢查機(jī)制。哺乳動物細(xì)胞的才CDI主要包括Ink4、Kip及GADD45等。Ink4(inhibitor 偶發(fā)CDK4的縮寫)是一族CDK4的特異性抑制蛋白,只特異性抑制CDK4、CDK6.第一個被堅(jiān)定的成員為p16，其他成員有p1

17、5、p18及p19.Kip即kinase inhibition protein 的縮寫，包括p21、p27及p57.P21的功能在G1期p21抑制cyclinD-CDK4、cyclin A-CDK2及cyclinE-CDK2，pRb不能發(fā)生磷酸化，細(xì)胞停滯于G1期，利于細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)。但p21對cyclinB組成的復(fù)合物的抑制活性較弱。P21與p27有協(xié)同作用。通過與PCNA結(jié)合使PCNA不能與DNA聚合酶形成復(fù)合物，或使DNA全酶復(fù)合物不能在模版DNA單鏈上滑動，影響DNA的復(fù)制。在細(xì)胞應(yīng)激時，p21通過抑制應(yīng)激激活蛋白酶（stress-activated protein kinase, SA

18、PK）的活性，認(rèn)為p21參與細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)時的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。p21蛋白的功能區(qū)域示意圖功能:主要在G1和G1-S期的轉(zhuǎn)變階段抑制cyclin-CDK活性 通過與PCNA結(jié)合影響DNA的“復(fù)制” 通過抑制SAPK參與應(yīng)激時的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)：p53依賴途徑（p53作為轉(zhuǎn)錄因子啟動p21表達(dá)） 非p53依賴途徑（佛波脂、吖啶橙等可誘導(dǎo)p53-/-人類拜細(xì)胞株的p21表達(dá)。3、3內(nèi)源性增殖抑制因子抑制因子是細(xì)胞中產(chǎn)生的，具有組織特異性的，抑制生長的調(diào)節(jié)分子，作用于細(xì)胞本身。有人稱其為“抑素”。具有以下性質(zhì)：（1）無論在體內(nèi)或體外，均能抑制有絲分裂，具有組織特異性（2）無種間差異（3）制造抑素的組織即是該抑素作

19、用的靶組織（4）對有絲分裂的作用是可逆的，對細(xì)胞無損害作用3、4蛋白磷酸酶蛋白磷酸化與脫磷酸化幾乎設(shè)計所有生理過程:從胚胎發(fā)育到細(xì)胞的生長發(fā)育、分裂分化、基因表達(dá)甚至癌變等。它是使cyclin-CDK的靶分子去磷酸化的酶，其作用與cyclin-CDK相反。例如蛋白磷酸酶I（PPI），它在M期使Rb蛋白發(fā)生去磷酸化。PP2A主要在G2/M 相過渡和M 期的終止時參與一系列磷酸化的過程,組織細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期。3、5泛素為中介的蛋白水解體系Cyclin的濃度依細(xì)胞周期而變化，其產(chǎn)生取決于mRNA的轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)的合成，其降解則需要蛋白水解體系，這種水解是以泛素為中介的。泛素是高度保守的小分子蛋白。C

20、yclin被分解時，先在一種特定的連接酶作用下，泛素鏈接到cyclin分子特定的位點(diǎn)，然后由依賴泛素的蛋白水解酶的作用，將cyclin連同泛素一起水解掉。G1周期蛋白也通過類似的途徑降解，但其N端沒有破壞框，C端有一段PEST序列與其降解有關(guān)。4、CDK1激酶催化不同的底物（主要是磷酸化絲氨酸和蘇氨酸），參與細(xì)胞的多種功能）4、1 G1期G0期與G1期早期交界處有一個檢查點(diǎn)，決定細(xì)胞是停留在靜止?fàn)顟B(tài)，還是從G0期進(jìn)入G1期這一檢查點(diǎn)，通常稱之為限制點(diǎn)（estriction point）.G1晚期與S期交界處（表示為G1/S交界處）也有一個檢查點(diǎn)，負(fù)責(zé)檢查染色體DNA是否有損傷，如DNA有損傷，

21、則要求細(xì)胞先進(jìn)行修復(fù)，然后才能復(fù)制，以免遺傳信息傳遞出錯。細(xì)胞在通過G1晚期檢查點(diǎn)之前一直對各種刺激（生長因子、絲裂原、分化誘導(dǎo)劑等）敏感。細(xì)胞周期調(diào)控概況G1晚期檢查點(diǎn)決定是否進(jìn)入S期，這最終取決于外界環(huán)境能否提供增殖信號及細(xì)胞內(nèi)部有無出現(xiàn)障礙。去除絲裂原后，許多分化的哺乳動物細(xì)胞可以從細(xì)胞周期退出進(jìn)入G0期；也有一些細(xì)胞停滯于G1期，然后發(fā)生凋亡，換句話說，G1期細(xì)胞的命運(yùn)取決于外部信號能否誘導(dǎo)G1期細(xì)胞合成D型cyclin等主要調(diào)控蛋白。離子射線可誘導(dǎo)細(xì)胞增加表達(dá)p53，后者可誘導(dǎo)p21和GADD45表達(dá)增強(qiáng)，從而使細(xì)胞阻滯于G1后期。P53突變的細(xì)胞經(jīng)DNA損傷劑處理后，不能休止在G1

22、期，經(jīng)導(dǎo)入野生型p53，細(xì)胞再用電離輻射處理后則變?yōu)樾葜乖贕1期。可見p53是在G1/S期執(zhí)行DNA損傷檢查的關(guān)鍵蛋白.p53與染色體的穩(wěn)定性有關(guān).G1/S期交界調(diào)控示意圖p27閾值設(shè)定者（threshold setter）在G0期，細(xì)胞內(nèi)含有較高而相對恒定濃度的p27而缺少CDK,隨著從休止?fàn)顟B(tài)借方出來，細(xì)胞開始合成cyclin和CDK，并積累cyclin CDK復(fù)合物，但它們大多因被p27所結(jié)合而失活。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)cyclin CDK復(fù)合物增加到某一臨界值后，可將p27完全結(jié)合，此時，細(xì)胞內(nèi)游離的cyclin CDK復(fù)合物開始積累，細(xì)胞周期向S期推進(jìn)。4、2 S期S期的主要任務(wù)是進(jìn)行DNA復(fù)制

23、與修復(fù),在每一條染色體的DNA分子上,有3種特異的核苷酸序列是復(fù)制所必需的,它們是多個復(fù)制起點(diǎn)（replication orgin）、1個著絲粒（centromere）和2個端粒（telomere）.真核細(xì)胞DNA復(fù)制是多點(diǎn)起始、雙向復(fù)制的，不僅要啟動DNA復(fù)制而且要關(guān)閉復(fù)制，以確保每段DNA在一個細(xì)胞周期中只復(fù)制一次，即S期DNA復(fù)制的起始存在“開啟”和“關(guān)閉”機(jī)制。S期的cyclin/CDKS期初期主要發(fā)生cyclinE和A激活CDK2,兩者都是啟動DNA復(fù)制子所必需的。繼cyclinE激活CDK2后不久，發(fā)生cyclinA激活CDK2，且與可測定出的DNA合成同步。G1晚期阻滯細(xì)胞可表達(dá)

24、一定水平的cyclinE，但不表達(dá)cydinA。CyclinA的過高表達(dá)足可克服S期阻滯。S期的CDI主要為p21.DNA損傷可誘導(dǎo)p21表達(dá)，p21可抑制所有已發(fā)現(xiàn)的cyclin-CDK復(fù)合物。在S期p21抑制PCNA參與DNA的復(fù)制與修復(fù)。DNA復(fù)制的開啟與關(guān)閉DNA復(fù)制的起始特殊序列，稱為復(fù)制子（replicator），復(fù)制子是否開啟，決定于復(fù)制子與啟動有關(guān)的DNA結(jié)合蛋白組裝成復(fù)制復(fù)合物（replication complex，RC）及其狀態(tài)。起始識別復(fù)合物（orgin recognization complex，ORC）ORC由6種多肽組成；自主復(fù)制序列（autonomously r

25、eplicating sequence，ARS）與DNA復(fù)制起始有關(guān)，它與蛋白質(zhì)結(jié)合。ORC突變可使細(xì)胞阻滯于S期。極可能cdc28可直接激活ORC。CyclinE CDK2或cyclinA CDK2與ORC-ARS呈怎樣的關(guān)機(jī)，目前不完全清楚。CDC6是其中的一個調(diào)節(jié)因子，在G1期CDC6含量瞬間提高，CDC6結(jié)合在ORC上，在ATP供能下，促進(jìn)6個亞單位構(gòu)成的MC符合體和其他一些蛋白結(jié)合到ORC上，形成前復(fù)制復(fù)合體（pre-replicative complex, pre-RC）,MCM實(shí)際上就是DNA解旋酶（hellicase）。S-CDK觸發(fā)pre-RC的啟動，同時阻止了DNA再次進(jìn)行

26、復(fù)制，因?yàn)镾-CDK將CDC6磷酸化，使其脫離ORC，磷酸化的CDC6隨后被SCF參與的泛素化途徑降解；S-CDK還可以將某些MCM磷酸化，使其被輸出細(xì)胞核。其他一些CDK也參與阻止pre-RC的再次形成，從而保證了DNA的復(fù)制當(dāng)且僅當(dāng)一次。The mechanisms cotrolling S-phase initiation in animal cellsThe Rb protein acts as a brake in mammalian G1 cellsThe control of G1 progression and S-phase initiation is often disru

27、pted in cancer cells, Ieading to unrestrained cell-cycle and cell proliferation.PRb及其相關(guān)蛋白G1期CDK的主要作用底物是pRb或pRb的相關(guān)蛋白.Rb基因首先從視網(wǎng)膜母細(xì)胞癌(retinoblastoma)中鑒定出來，是一種腫瘤抑制基因。Rb基因失活可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。CyclinD CDK可使pRb磷酸化。非磷酸化的pRb能結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子E2F使之處于失活狀態(tài)，從而阻止細(xì)胞周期的推進(jìn)。E2FE2F是一類細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活化因子，因首先發(fā)現(xiàn)它可激活腺病毒E2啟動子而得名。已發(fā)現(xiàn)E2F有5個成員，即E2F-15.E2F

28、通常以與其他蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的形式存在 ,只有少數(shù)細(xì)胞株(如Hela細(xì)胞)含有大量游離形式的E2F。許多DNA合成基因和細(xì)胞生長控制基因的啟動子中都存在E2F的結(jié)合位點(diǎn)，E2F可直接活化這些基因，啟動DNA合成，從而使細(xì)胞進(jìn)入S期。4、3 M期（1）MPF的激活P34與cyclinB結(jié)合及p34的磷酸化是MPF活化的關(guān)鍵步驟.p34的T161磷酸化受CAK(cdc2-activating Kinase)催化完成.PP2A可使磷酸化的T161去磷酸化,從而抑制p34的活性.T161磷酸化使p34處于一種特殊空間構(gòu)象,適合與cyclinB結(jié)合.當(dāng)p34與cyclinB結(jié)合后空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,使T1

29、4 Y15殘基暴露出來,M期之前weel-mikl關(guān)聯(lián)蛋白使之磷酸化,此時cyclinB-p34沒有活性.進(jìn)入M期，cdc25將P34-T14-Y15磷酸基移去，于是MPF激活。M期的檢查點(diǎn)G2/M期檢查點(diǎn)G2期檢查點(diǎn)負(fù)責(zé)檢查DNA復(fù)制是否完成.DNA復(fù)制未完成,則可激活weel-mikl蛋白激酶.weel-mikl可使p34的T14-Y15發(fā)生磷酸化，MPF失活，細(xì)胞阻滯于G2期；DNA復(fù)制已完成，則cdc25表達(dá)出cdc25蛋白（p54/80）,使上的磷酸基被水解掉,MPF呈現(xiàn)活性,細(xì)胞進(jìn)入M期.4、4 M中期末的檢查點(diǎn)M中期末的檢查點(diǎn)是指cyclinB滅活機(jī)制.其中APC活性變化是認(rèn)識細(xì)

30、胞由分裂中期向分裂后期轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵問題之一。APC各成分在分裂期間中表達(dá)，但只有到達(dá)M期之后才表現(xiàn)出活性，提示M期CDK活性對APC的活性起著調(diào)節(jié)作用。APC活性受到紡錘體裝配檢查點(diǎn)的監(jiān)控，紡錘體裝配不完全或所有動粒不能被動粒微管捕捉，APC不能激活。（1995年KING在非洲爪蟾卵種分離出了一種20S的蛋白復(fù)合體，稱之為APC（后期促進(jìn)因子）。在E1、E2、泛素和ATP再生體系存在的情況下，APC可以在體外將cyclinA、B降解）染色體分離及紡錘體組裝檢控點(diǎn)的分子機(jī)制在染色體的移動依賴于紡錘體微管蛋白結(jié)合在著絲點(diǎn)上的運(yùn)動。參與該監(jiān)測點(diǎn)最重要的2類基因是MAD和BUB。MAD2和BUB1存在于

31、尚未結(jié)合微管的動粒上，這兩種蛋白在著絲點(diǎn)上可以探測動力與微管的結(jié)合。Control of proteolysis: APC regulates exit from Mitosis by Proteolysis of M-Cdk(cdk1/cdc2). The spindle-attachment checkpoint: Unattached chromosomes block sister-chromatod separation. The sister chromatid seperation is triggered by protein.小結(jié)：細(xì)胞周期及其調(diào)控可簡單地比喻為一個高度自動化

32、的機(jī)器。該機(jī)器主要由動力系統(tǒng)和制動系統(tǒng)2個部分組成，兩者相互協(xié)調(diào)、相互制約，才能保證有絲分裂的正常進(jìn)行。其動力系統(tǒng)一旦啟動，可使細(xì)胞周期依編好的程序 ，按時間有序地一步一步進(jìn)行下去。有人稱之為“細(xì)胞周期時鐘”（cell cycle clock）細(xì)胞對外界信號作出反應(yīng)，通過細(xì)胞內(nèi)信號系統(tǒng)，激活細(xì)胞周期的動力系統(tǒng)，通過有序地活化各種cyclinCDK復(fù)合物和磷酸酶，誘導(dǎo)一連串的級聯(lián)式反應(yīng)，通過對轉(zhuǎn)錄因子及其他功能蛋白的磷酸化和去磷酸化，實(shí)現(xiàn)各種細(xì)胞期的功能，細(xì)胞周期有精密的檢查機(jī)制，在各細(xì)胞期之間轉(zhuǎn)化時都有檢查點(diǎn)和檢查機(jī)制，從而確保程序進(jìn)行的正確性這個自動化機(jī)器運(yùn)轉(zhuǎn)失靈，就可能造成細(xì)胞衰老，死亡或

33、惡化。細(xì)胞分化第一節(jié) 細(xì)胞分化的概念發(fā)育細(xì)胞分化基因選擇性表達(dá)蛋白/DNA相互作用信號網(wǎng)絡(luò)胞外信號 衰老 組織器官 細(xì)胞周期細(xì)胞分化細(xì)胞凋亡 染色質(zhì) 細(xì)胞分化 組織器官 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞增殖細(xì)胞分化 細(xì)胞衰老 不對稱分裂干細(xì)胞(組織干細(xì)胞) 細(xì)胞分化 干細(xì)胞 分化細(xì)胞 去分化(重編程) 轉(zhuǎn)分化?第二節(jié) 細(xì)胞分化的分子基礎(chǔ)細(xì)胞分化(cell differentiation):在個體發(fā)育中,由一種相同的細(xì)胞類型經(jīng)細(xì)胞分裂后逐漸在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上形成穩(wěn)定性差異,產(chǎn)生各不相同的細(xì)胞類群的過程細(xì)胞分化是多細(xì)胞生物發(fā)育的基礎(chǔ)與核心;細(xì)胞分化的關(guān)鍵在于特異性蛋白質(zhì)組成；合成特異性蛋白質(zhì)實(shí)質(zhì)在于組織特異性基因在

34、時間和空間上的差異性表達(dá)；差異性表達(dá)的機(jī)制是由于基因表達(dá)的組合調(diào)控。細(xì)胞癌變是正常細(xì)胞分化機(jī)制失控的表現(xiàn)。細(xì)胞分化是基因選擇性表達(dá)的結(jié)果：細(xì)胞分化主要是奢侈基因中某些特定基因的選擇性表達(dá)基因表達(dá)可在三層水平上進(jìn)行調(diào)控：基因水平，轉(zhuǎn)錄水平，翻譯水平1.1 基因表達(dá)的調(diào)控DNA的甲基化：哺乳動物失活的X染色體在生殖細(xì)胞形成時才重新恢復(fù)活性狀態(tài)雌性哺乳動物中一條X染色體保持緘默：巴氏小體DNA重排：淋巴細(xì)胞合成不同的抗體馬蛔蟲染色質(zhì)消減體細(xì)胞的前體細(xì)胞在很早的卵裂階段中經(jīng)歷染色質(zhì)消減，約占80%以上的DNA被丟失，因此不再具備完整的基因組，所以僅有生殖系的細(xì)胞具有一套完整的基因組結(jié)構(gòu)。1.2轉(zhuǎn)錄水平

35、的基因調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程包括轉(zhuǎn)錄的起始，延伸和終止。這一過程的調(diào)控最為復(fù)雜，包括RNA聚合酶的選擇、啟動子的選擇、終止信號的識別等。RNA聚合酶的選擇識別正確的起點(diǎn)和終點(diǎn)1.3轉(zhuǎn)錄后加工的調(diào)節(jié)1.4翻譯水平的調(diào)控細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行的轉(zhuǎn)譯水平的調(diào)控包括mRNA穩(wěn)定性的控制、差別翻譯、翻譯起始的控制、下游區(qū)的控制等。鐵蛋白的翻譯是細(xì)胞在mRNA水平控制基因表達(dá)的一個很好的例子。卵母細(xì)胞中mRNA的翻譯調(diào)控機(jī)制mRNA masking：mRNA與其他蛋白質(zhì)結(jié)合成ribonucleoprotein（RNP）complex，阻止與ribosome結(jié)合；卵成熟或受精后，離子強(qiáng)度改變或蛋白磷酸化等導(dǎo)致mRNA解體，翻譯

36、得意進(jìn)行。5 Cap(7-甲基鳥苷酸)的調(diào)控,如某些種類的moths,其卵中的部分mRNA的5-鳥苷酸在受精后才甲基化,然后開始翻譯.mRNA sequester:指mRNA被阻隔于蛋白合成裝置,如海膽未受精卵的histone mRNA定位于原核中,受精后原核破裂,mRNA才能進(jìn)入胞質(zhì)開始翻譯。翻譯效率的調(diào)控：如將海膽卵細(xì)胞裂解液的pH從自然狀態(tài)下的pH6.9提高到（受精后自然狀態(tài)下的）pH7.4，蛋白質(zhì)合成量急劇增加。受精后pH升高的作用可能包括去除mRNA的封閉蛋白和激活翻譯起始因子。1.5 翻譯后水平上的調(diào)控Activation by cleaving some domains,e.g,

37、 proinsulin(胰島素原)Activation by removing protecting proteins,e.g., Dorsal;Control of functions by subcellular localization, e.g., membrane proteins;Assembly with other proteins, e.g., hemoglobin;Activation by binding to ions, e.g., calmodulin;Activation by modification, e.g., phosphorylation3.1細(xì)胞的全能性

38、（totipotency）概念：細(xì)胞全能性是指細(xì)胞經(jīng)分裂和分化后仍具有產(chǎn)生完整有機(jī)體的潛能或特性。植物細(xì)胞具有全能性，在適宜的條件下可培育成正常的植株動物細(xì)胞核移植（nuclear transfer）實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞核具有發(fā)育全能性3.2影響細(xì)胞分化的因素受精卵細(xì)胞質(zhì)的不均一性對細(xì)胞分化的影響細(xì)胞間的相互作用與位置效應(yīng)細(xì)胞記憶與決定 果蠅成蟲盤（imaginal disc）環(huán)境對性別決定的影響3.2.1細(xì)胞質(zhì)中含有影響分化的遺傳因子基因組是發(fā)育信息的重要的載體，但細(xì)胞質(zhì)中也同樣含有這樣的信息。啟動一個動物受精卵形成胚胎所需要的信息漁村在卵子發(fā)生期的卵母細(xì)胞里母體效應(yīng)（maternal-effect

39、）卵母細(xì)胞中貯存的mRNA和蛋白的分布是不均勻的，各種mRNA在細(xì)胞中都有定位分布，并隨卵裂進(jìn)入不同的子細(xì)胞中。DNA（核）-mRNA-Protein（細(xì)胞核）3.2.2胚胎誘導(dǎo)（embryonic induction）（圖，蛙眼發(fā)育的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)）動物在一定的胚胎發(fā)育時期，一部分細(xì)胞影響相鄰細(xì)胞使其向一定方向分化的作用稱為胚胎誘導(dǎo)，或稱為分化誘導(dǎo)。3.2.4環(huán)境對性別決定的影響爬行類依賴程溫度的性別決定：在大多數(shù)龜類和所有的鱷魚種的性別是由受精后的環(huán)境決定的。在一些龜類中：如果卵在28以下孵化，所有孵化的龜將為雌性，在32以上，每個卵產(chǎn)生的是雄性。主要缺陷：可能是物種存活的溫度限制。有人假設(shè)恐龍

40、可能已經(jīng)具有依賴溫度的性別決定，溫度的變化使它們的卵只能孵化出雄性或雌性，以致它們突然消亡。4.1干細(xì)胞的特征干細(xì)胞是具多潛能具自穩(wěn)定性，自穩(wěn)定性是其區(qū)別于腫瘤細(xì)胞的本質(zhì)特征增殖速度較緩慢干細(xì)胞能無線的增殖分裂干細(xì)胞可連續(xù)分裂幾代，也可在較長時間內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)干細(xì)胞通過兩種方式生長，一種是對稱分裂形成兩個相同的干細(xì)胞，另一種是非對稱分裂由于細(xì)胞質(zhì)中的調(diào)節(jié)分化蛋白不均勻地分配，使得一個子細(xì)胞不可逆的走向分化的終端成為功能專一的分化細(xì)胞；另一個保持親代的特征，仍作為干細(xì)胞保留下來。分化細(xì)胞的數(shù)目受分化前干細(xì)胞的數(shù)目和分裂次數(shù)控制。干細(xì)胞內(nèi)部，以及外部與其生境細(xì)胞間有特定的信號傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)自我更新

41、和分化。 4.2胚胎干細(xì)胞（ES cell）胚胎干細(xì)胞（ES）是指從早期胚胎的卵裂球、囊胚細(xì)胞分離培養(yǎng)和建系的細(xì)胞。而從胚胎生殖嵴中PGC分離培養(yǎng)建成的稱胚胎生殖細(xì)胞,簡稱EG細(xì)胞。它們統(tǒng)稱胚胎性干細(xì)胞4.2.1ES和EG細(xì)胞系基本特性體外能無線增殖假使在培養(yǎng)條件合適時，ES細(xì)胞可以在體外無限增殖。但實(shí)際上，傳代次數(shù)越多，ES細(xì)胞會像常規(guī)細(xì)胞一樣，出現(xiàn)核型不正常的情況，并失去了ES細(xì)胞原有的一些重要特性體外產(chǎn)生分化細(xì)胞1981-2003，這2類胚胎干細(xì)胞所分化的細(xì)胞都是體細(xì)胞2003-2004，證明體外培養(yǎng)的ES細(xì)胞能產(chǎn)生雌、雄兩性的生殖細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了體外培養(yǎng)的ES細(xì)胞也能表達(dá)“安全性”概念，這

42、是ES細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化的一個重大突破。體內(nèi)產(chǎn)生畸胎瘤ES和EG細(xì)胞若接種于免疫缺損小鼠腋窩等下，可形成由內(nèi)胚層、中胚層、外胚層多種細(xì)胞構(gòu)成的畸胎瘤。巢狀生長有多能胚胎干細(xì)胞分子標(biāo)記染色體數(shù)目和核型正常經(jīng)體外傳代培養(yǎng)后具有正常的染色體數(shù)目和二倍體核型，即使凍存蘇后仍然保持這種特性遺傳可操作性由于ES細(xì)胞在體外可以不斷自我增殖，又具有發(fā)育的全能或多能性，并能通過構(gòu)建嵌合體產(chǎn)生有功能的生殖細(xì)胞。這為通過基因工程途徑改造物種提供了獨(dú)特的、無與倫比的受體細(xì)胞。形成嵌合體實(shí)現(xiàn)種系傳遞4.2.2胚胎干細(xì)胞的鑒定首先要鑒定是否保持正常的核型通過胚胎期特異表面抗原來監(jiān)測巢素蛋白（nestin）陽性胚胎干細(xì)胞

43、堿性磷酸酶活性高，分化的細(xì)胞較低人和小鼠都表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Oct-4端粒酶活性極高，而分化的細(xì)胞則很低體外誘導(dǎo)分化，可以分化為三胚層的不同細(xì)胞譜系體內(nèi)移植至裸鼠腋下，形成的瘤體應(yīng)包含多種類型4.2.3 ES細(xì)胞分化潛能的監(jiān)測將ES細(xì)胞給同源動物或裸鼠皮下注射會形成復(fù)雜的混合組織瘤 瘤組織包括胃上皮（內(nèi)胚層）；骨和軟骨組織、平滑肌、橫紋肌（中胚層）；神經(jīng)表皮、神經(jīng)節(jié)和復(fù)層鱗狀上皮（外胚層）；說明ES可分化為三個胚層形成胚狀體（擬胚體）：ES在體外合適的培養(yǎng)條件下，部分能形成胚狀體。嵌合體實(shí)驗(yàn)：將ES與正常胚胎嵌合；（人不能形成嵌合體，倫理學(xué)原因）嵌合胚：說明早期卵裂球有同等的發(fā)育潛力。自然人群中也出

44、現(xiàn)過同時有XX型和YY型細(xì)胞的人。胚胎干細(xì)胞：保持了分化為胚胎本體的潛能的、可在體外增殖的胚胎細(xì)胞。在基因功能研究和疾病治療方面有重要的作用。4.2.4 胚胎干細(xì)胞的分化能力胚胎干細(xì)胞能分化成為體內(nèi)全部200多種細(xì)胞。但其應(yīng)用于臨床尚需解決定向分化和致瘤性兩大難題。全能干細(xì)胞：能分化成所有的細(xì)胞類型（ES,EG）多能干細(xì)胞：能分化為某一類組織中的所有細(xì)胞類型（造血干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞）4.3 成體干細(xì)胞是指一群分布在成體組織中尚未分化的、具有自我更新潛能并負(fù)有構(gòu)建和補(bǔ)充某組織的各種類型細(xì)胞的干細(xì)胞，故又稱組織干細(xì)胞。在正常生理?xiàng)l件下 ，傾向于分化成并更新所在組織的各種細(xì)胞。但在特定的外界條件下

45、，一種組織的成體干細(xì)胞能夠超越該特定組織、胚層分化成其他組織的功能性細(xì)胞，補(bǔ)充參與其他組織損傷的修復(fù)等。成體干細(xì)胞造血干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞，胰腺干細(xì)胞，肝臟干細(xì)胞，肌肉干細(xì)胞。造血干細(xì)胞的特征：形態(tài)：類似小淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志：CD34+、CD38-、Lin-、HLA-、DR+、Thy+、CD45RA-、CD71-其中CD34+是臨床應(yīng)用最多的造血干細(xì)胞標(biāo)志物。HSC的鑒定將分離的細(xì)胞植入致死量照射的小鼠體內(nèi)或SCID鼠體內(nèi)，可長期重建多譜系造血血細(xì)胞的形成與更新：胚胎發(fā)育期，血細(xì)胞發(fā)生于中胚層的血島。雞血島位于胚盤外側(cè)覆蓋在卵黃囊上的胚外中胚層上，人類的也是在相應(yīng)部位覆蓋，在卵黃囊上的中胚層上發(fā)現(xiàn)

46、的。此后，干細(xì)胞遷移到肝臟、脾臟，也可能到達(dá)胸腺。最后，它們在骨髓中增殖。出生后的哺乳動物，干細(xì)胞只占骨髓中總體細(xì)胞的0.01%，它們是提供所有細(xì)胞的唯一來源。造血干細(xì)胞的定義和分類：定義：多向分化：能分化成至少八種髓系和淋巴系的血液細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)機(jī)體血液、淋巴系統(tǒng)的正常生理功能。自我更新：通過不斷的復(fù)制維持終生的造血干細(xì)胞庫分類：胚肝造血干細(xì)胞；骨髓造血干細(xì)胞；外周血造血干細(xì)胞；臍血造血干細(xì)胞造血干細(xì)胞的移植骨髓移植外周血造血干細(xì)胞移植臍血造血干細(xì)胞移植：1988年，Gluckman等實(shí)施了世界上第一例臍血干細(xì)胞移植并獲得成功。主要局限于小孩或體重較輕的年輕人。另創(chuàng)應(yīng)用的瓶頸：造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)

47、增造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化2001年，cell雜志報道，單個造血干細(xì)胞除重建了小鼠造血系統(tǒng)，還分化成肝、皮膚、肺組織。造血干細(xì)胞可以修復(fù)受損傷的心肌組織。神經(jīng)干細(xì)胞 CNTFR介導(dǎo)的GP130信號通路和Notch1信號通路均對神經(jīng)干細(xì)胞至關(guān)重要神經(jīng)干細(xì)胞的應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞分化為多巴胺神經(jīng)元治療帕金森氏癥紅色區(qū)域?yàn)閿z取多巴胺神經(jīng)元分布的區(qū)域移植多巴胺神經(jīng)元后病人癥狀明顯改善4.3.3胰腺干細(xì)胞胰腺干細(xì)胞治療糖尿病注射胰島素：痛苦、不便、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)胰腺移植、胰島移植胰島移植療法及其問題組織來源緊張，現(xiàn)有的胰島分離技術(shù)需要兩個以上供體的胰島才能進(jìn)行移植。免疫排斥問題突出干細(xì)胞研究將有助于解決上述問題4.3.5

48、骨髓肌干細(xì)胞肌肉的生長、更新和修復(fù)是與肌纖維周圍的衛(wèi)星細(xì)胞有關(guān)，故認(rèn)為這就是骨髓肌干細(xì)胞。4.4.4單能干細(xì)胞：腸的更新新細(xì)胞由位于小腸絨毛間,陷于腸壁保護(hù)性隱窩深處的多能干細(xì)胞所供給.干細(xì)胞的后代進(jìn)行更新的方向是縱向進(jìn)入絨毛，最終在絨毛的頂端死亡。死亡的細(xì)胞釋放消化酶。所有未分化的人類ES細(xì)胞都能表達(dá)OCT4、SOX2和NANOG基因，然而人們還不清楚粗這些基因的確切功能。馬薩諸塞州劍橋市Whitehead生物醫(yī)學(xué)研究所的遺傳學(xué)家Richard Young和同事們針對ES細(xì)胞內(nèi)這三個基因及其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了詳細(xì)的研究。 干細(xì)胞與腫瘤的發(fā)生腫瘤是在具有無限增殖和自我更新潛能的很少一部分細(xì)胞的

49、驅(qū)動下發(fā)生的,這一部分惡性轉(zhuǎn)化的靶細(xì)胞即是腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell)5.1 腫瘤的發(fā)生與干細(xì)胞關(guān)系密切腫瘤很可能源于干細(xì)胞干細(xì)胞與腫瘤都有較高的端粒酶活性兩者均有自我更細(xì)奈何無限制的增殖能干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共同的調(diào)節(jié)自我更新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有不同分化程度的干細(xì)胞,也有分化程度不同的腫瘤自我更新越頻繁的組織,干細(xì)胞自我更新率越快,腫瘤的發(fā)生率也越高,不增生組織幾乎不發(fā)生腫瘤5.2 腫瘤源于干細(xì)胞的理論依據(jù)干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞具有相似的自我更新調(diào)節(jié)機(jī)制腫瘤的產(chǎn)生是多基因突變的結(jié)果,干細(xì)胞發(fā)生多次突變的機(jī)會遠(yuǎn)比成熟的終末分化細(xì)胞高,最有可能發(fā)生多基因突變而惡變?yōu)槟[瘤細(xì)胞干細(xì)胞在長期的自我

50、更新過程中一方面由于端粒長度的變短,另一方面由于端粒酶受損,導(dǎo)致染色體核型不穩(wěn)定,產(chǎn)生腫瘤.腫瘤干細(xì)胞理論腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中存在的一種能自我更新和增殖產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞群體的細(xì)胞.按照發(fā)育生物學(xué)觀點(diǎn),正常情況下,干細(xì)胞分裂產(chǎn)生的兩個子細(xì)胞,其中一個保留了干細(xì)胞特性;另一個細(xì)胞分化。而腫瘤細(xì)胞則是兩個子細(xì)胞均保持了干細(xì)胞特性。腫瘤干細(xì)胞被成為惡性腫瘤細(xì)胞的種子。研究發(fā)現(xiàn)，誘發(fā)性皮膚癌的早期變化是由于腺囊基底部的干細(xì)胞分裂產(chǎn)生的兩個子細(xì)胞均保持了干細(xì)胞特性。絕大多數(shù)白血病細(xì)胞根本不會致病，只有百分之一的細(xì)胞會導(dǎo)致發(fā)病，而且，這些罕見的致病的腫瘤干細(xì)胞與通常的干細(xì)胞有許多相似的特征。5.3 正常干細(xì)胞

51、與腫瘤干細(xì)胞比較干細(xì)胞在增殖分化過程中不被正常信號誘導(dǎo)變?yōu)槟[瘤干細(xì)胞，而腫瘤干細(xì)胞按其遺傳特性增生產(chǎn)生腫瘤腫瘤干細(xì)胞象成體干細(xì)胞一樣具有自我更新能力，有一定程度的分化成熟能力，其自我更新和分化過程失去了正常的調(diào)控。腫瘤干細(xì)胞的不同分化程度形成了腫瘤細(xì)胞的移植性。正常干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞有一些相同的增殖和分化的信號調(diào)控途徑一定條件下 ，腫瘤細(xì)胞內(nèi)所有已表達(dá)的基因可以重新編成，腫瘤細(xì)胞可以逆轉(zhuǎn)發(fā)育成正常細(xì)胞。重編程和治療性克隆重編程：已分化的細(xì)胞恢復(fù)未分化的狀態(tài)。目前多以核移植為研究手段。治療性克隆：利用重編程過程，拜托人體胚胎干細(xì)胞研究和應(yīng)用的倫理道德問題。細(xì)胞核重新變編成是指分化成熟的體細(xì)胞由分化

52、狀態(tài)逆轉(zhuǎn)為一種未分化狀態(tài)并恢復(fù)多能性分化潛能的過程。將細(xì)胞核重新編成有三種方法：核移植，細(xì)胞融合和轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)，誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(iPS)誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPS細(xì)胞)，是借助基因?qū)爰夹g(shù)將某些額特定基因?qū)氤审w細(xì)胞 ，或者同時選擇性地在培養(yǎng)液中添加一些起輔助作用的小分子化合物，從而使體細(xì)胞去分化重編程為多潛能干細(xì)胞，此類細(xì)胞在克隆形態(tài)、生長特性、表面標(biāo)志分子、基因表達(dá)模式、表觀遺傳學(xué)特征、體外分化潛能、畸胎瘤形成和嵌合體形成等方面與ES細(xì)胞非常相似，稱為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞。6.2 體細(xì)胞種類的選擇研究表明,不同細(xì)胞類型(內(nèi)、外或中

53、胚層來源)，或不同分化程度（胚胎、新生或承認(rèn)）的體細(xì)胞，都能被重編程，只是不同胚層來源的細(xì)胞或不同發(fā)育階段的細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞的難易、效率、所需因子組合或形成克隆所需時間均不相同.從iPS誘導(dǎo)的過程考慮，可能與不同體細(xì)胞間的表觀遺傳修飾的差異相關(guān) 。不同細(xì)胞基因組的甲基化和乙酰化程度各不相同，誘導(dǎo)重編程過程中外源基因啟動表達(dá)的要求也不同。已經(jīng)證明能成功誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細(xì)胞的體細(xì)胞種類有：胚胎成纖維細(xì)胞，成體纖維細(xì)胞，腎上腺細(xì)胞，肌細(xì)胞，腎細(xì)胞，胎鼠干細(xì)胞，造血系細(xì)胞，干細(xì)胞，胃上皮細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，腸上皮細(xì)胞，成熟B淋巴細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞，腦膜細(xì)胞，神經(jīng)祖細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞和胰腺細(xì)胞。總之，

54、在理論上人或鼠的任何一種體細(xì)胞均可被重編程為iPS細(xì)胞。皮膚成纖維細(xì)胞、血細(xì)胞（如T和B細(xì)胞等）和脂肪細(xì)胞由于取材方便，來源廣泛和培養(yǎng)簡單，是iPS細(xì)胞誘導(dǎo)中較為理想和常用的供體細(xì)胞類型。外源轉(zhuǎn)錄因子的導(dǎo)入方法優(yōu)缺點(diǎn)比較優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)在干細(xì)胞中沉默局限于分裂的細(xì)胞，基因組整合分裂和不分裂的細(xì)胞到都導(dǎo)入基因組整合無病毒成分，低頻率基因組整合重編程效率低，需多輪轉(zhuǎn)染低頻率基因組整合重編程效率低，產(chǎn)生四倍體控制誘導(dǎo)過程靈活非特異性作用，毒性不以核算為基礎(chǔ)，直接導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子某些蛋白純化困難，半衰期短6.4外源轉(zhuǎn)錄因子的選擇最經(jīng)典和最常使用的轉(zhuǎn)錄因子包含Oct4,Sox2,K1f4和c-MycOct4:由Po

55、u5F1基因編碼產(chǎn)生，含有POU結(jié)構(gòu)域，是一種屬于Oct蛋白家族的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)多種基因，在胚胎干細(xì)胞、早期胚胎和生殖細(xì)胞中特異性表達(dá)，是維持細(xì)胞自我更新和多向分化的關(guān)鍵性因子。Sox2：常被作為一種多能性細(xì)胞的分子標(biāo)記。在胚胎發(fā)育的早期，Sox2與Oct4在桑椹胚、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、上胚層和生殖細(xì)胞中的表達(dá)廣泛重疊，提示Sox2作為協(xié)同因子參與Oct4介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控。Klf4：即Kruppel like factor 4，是具有結(jié)合位點(diǎn)特異性的鋅脂蛋白轉(zhuǎn)錄因子，屬于klf蛋白家族一員。Klf4基因在小鼠的ESCs中高表達(dá)，但是對于ESCs的自我更新和未分化狀態(tài)的維持不是必需的，它對細(xì)胞的增殖

56、和分化起到重要的開關(guān)作用。c-Myc：是myc癌基因家族中最重要的一員，70%的人類癌癥中都表現(xiàn)出c-Myc表達(dá)的失調(diào)。C-MYC基因的表達(dá)是與細(xì)胞的增殖潛能密切相關(guān)的。C-Myc已經(jīng)被證明不是誘導(dǎo)重編程的必需因子，它在重編程中的作用可能是（1）增強(qiáng)細(xì)胞的增殖力；（2）調(diào)節(jié)染色質(zhì)的構(gòu)象，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榭膳cOct4、Sox2快速結(jié)合的狀態(tài)。6.5轉(zhuǎn)錄因子的組合四個轉(zhuǎn)錄因子組合（Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4）Takahashi等通過反轉(zhuǎn)錄病毒載體，將4個基因（Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4）分別轉(zhuǎn)入小鼠和人的成纖維細(xì)胞中，成功獲得小鼠和人的iPS細(xì)胞。但是小鼠的嵌合體實(shí)驗(yàn)表明，導(dǎo)

57、入c-Myc基因可使嵌合體小鼠的腫瘤發(fā)生率高達(dá)20%，且這一現(xiàn)象與外源c-Myc的再活化有關(guān)。三個轉(zhuǎn)錄因子組合（Oct4、Sox2和Klf4）Nakagawa等利用慢病毒載體將3個轉(zhuǎn)錄因子（Oct4、Sox2和Klf4）導(dǎo)入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，獲得了iPS細(xì)胞系，且由形成的嵌合體小鼠中沒有發(fā)生腫瘤。但3個轉(zhuǎn)錄因子組合的誘導(dǎo)效率比4個轉(zhuǎn)錄因子組合低大約10倍，誘導(dǎo)時間明顯增長。兩個轉(zhuǎn)錄因子組合（Oct4和Sox2 或Klf4）Kim等利用慢病毒載體將2個轉(zhuǎn)錄因子（Oct4和Klf4）導(dǎo)入自身高表達(dá)Sox2和c-Myc的神經(jīng)干細(xì)胞中，成功得到iPS細(xì)胞。使用反轉(zhuǎn)錄病毒載體 ，在丙戊酸（抑制組蛋白

58、去乙酰基酶活性）的幫助下，只用Oct4和Sox2兩個轉(zhuǎn)錄因子能將人成纖維細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞單個轉(zhuǎn)錄因子組合（Oct4）Aoi等在小鼠神經(jīng)干細(xì)胞中用反轉(zhuǎn)錄病毒載體只導(dǎo)入1個轉(zhuǎn)錄因子（Oct4）也獲得了iPS，只是誘導(dǎo)成功率明顯低于使用兩個因子組合。6.6 IPS細(xì)胞的篩選方法Fbx15：多能性分子Fbx15特異的表達(dá)于細(xì)胞干細(xì)胞或早期胚胎中，是胚胎干細(xì)胞自我更新和發(fā)育所必需的。Nanog：因?yàn)閚anog基因僅在ES細(xì)胞中特異表達(dá)，在分化的ES細(xì)胞和體細(xì)胞中不表達(dá)Oct4：Oct4基因只在全能或多能性細(xì)胞如ES細(xì)胞和EG細(xì)胞中表達(dá)，是ES細(xì)胞的一個特異標(biāo)志分子。6.7 IPS細(xì)胞特點(diǎn)IPS細(xì)胞

59、在形態(tài)學(xué)特征、生長特性、表達(dá)標(biāo)志分子、分化潛能等方面都與ES細(xì)胞基本一致，具體包含：能夠形成ES細(xì)胞樣的克隆、細(xì)胞核大、核質(zhì)比高、堿性磷酸酶（AP）染色呈陽性、表達(dá)內(nèi)源性O(shè)ct4、Sox2和Nanog，端粒酶活性提高，具有無限增殖和自我更新的能力。將iPS細(xì)胞注射到免疫缺陷鼠皮下可形成由內(nèi)、中和外胚層來源的畸胎瘤將小鼠iPS細(xì)胞注射如小鼠囊胚，可發(fā)育形成嵌合體，同事，通過四倍體胚胎補(bǔ)償法可獲得完全由小鼠iPS細(xì)胞發(fā)育而來的小鼠在體外實(shí)驗(yàn)中，iPS細(xì)胞在一定培養(yǎng)條件下可分化形成含三個胚層來源細(xì)胞的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)IPS細(xì)胞哦能在體外定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)前體細(xì)胞、功能性的成熟神經(jīng)細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元、造血

60、前體細(xì)胞、造血細(xì)胞、胰腺細(xì)胞和干細(xì)胞、分泌胰島素的細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和耳蝸毛細(xì)胞等各種細(xì)胞。IPS細(xì)胞的應(yīng)用前景建立疾病模型迄今為止，人們已經(jīng)建立了來自各種不同遺傳性疾病病人的iPS細(xì)胞系（Park et al. 2008a）l型糖尿病、帕金森病、進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良癥等.這些細(xì)胞系為在體外條件下比較正常與病理組織的形成提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。通過體外研究這些疾病特異性的iPS細(xì)胞，有助于間接推斷 疾病的發(fā)病機(jī)制及尋找有效的治療措施自體干細(xì)胞移植同種異體移植由于供體細(xì)胞、組織和器官來源有限以及移植后的免疫排斥反應(yīng)，臨床應(yīng)用受限。而胚胎干細(xì)胞移植除了存在免疫排斥問題，同時還要面對胚胎來