1、資陽香橙枳雜種苗鑒定及耐堿株系初步篩選論文摘要：為培育耐堿的雜種砧木，以耐堿品種資陽香橙(Citrus junos Sieb. ex Tanaka)與不耐堿的枳(Poncirus trifoliata(L.) Raf.雜交，將雜種F1群體經形態學與SSR鑒定雜種真實性，并通過葉片黃化程度分級、葉綠素與有效鐵質量分數的測定以鑒定其耐堿能力，結果說明：1、以枳為父本時，與母本葉片形態上無明顯差異的F1都是珠心苗。2、真實雜種苗從第10片葉開始都有三出復葉。3、篩選到2對SSR引物能鑒定出全部雜種苗。4、在堿性土上，耐堿雜種苗葉綠素cha+b的質量分數顯著低于耐堿親本資陽香橙，而極顯著高于不耐堿親本

2、枳；但葉綠素a的質量分數顯著高于父母本。5、耐堿雜種葉片有效鐵質量分數顯著高于枳。結論：獲得了2株耐堿能力較強的真實雜種苗。論文關鍵詞：柑橘,砧木,雜種鑒定,耐堿,鑒定砧木品種改進對支撐柑橘產業開展至關重要。近年國外育種者報道了一些柑橘砧木育種的研究，多采用了起源于中國的枳作為雜交親本。枳(Poncirustrifoliata(L.)Raf.原產于我國，是我國廣泛使用的傳統砧木。但枳不抗裂皮病和碎葉病，對堿性土極為敏感，在堿性土上極易表現葉片缺鐵黃化病癥，與柚類或低酸甜橙的某些品種嫁接不親和。資陽香橙(CitrusjunosSieb.exTanaka)是我國特有的、耐堿能力強的優良柑橘砧木品種

3、。資陽香橙能適應pPH值7.2-8.4的堿性紫色土，耐裂皮病和碎葉病，樹體壽命長。其主要缺乏之處在于：實生苗幼苗較易感炭疽病；以資陽香橙作砧木的柑橘樹，大小年與隔年結果現象更為明顯圖1一株資陽香橙實生苗的葉形演變順序Fig1.Themorphologicaldevelopmentvariationofleavesfromthe1to8leafletonasameseedlingsofZiyangXiangcheng(CitrusjunosSieb.exTanaka).圖2香橙x枳的F1群體中不同于母本的葉片Fig2.Thezygoticoffspringwithtrifoliateleafle

4、tsorothercharacteristicswhichwerearedifferentfrombothtothefemaleparent(CitrusjunosSieb.exTanaka)andmaleparenttrifoliateorange(Poncirustrifoliata(L.)intheearlygrowingstage.圖3一株枳實生苗的葉形演變順序Fig3.Themorphologicalvariationofleavesfromthe1to8leafletonsameseedlingsoftrifoliateorange(Poncirustrifoliata(L.)參照

5、謝讓金的改進CTAB法提取實生苗與父母本的DNA。按江東、雷天剛的方法設計SSR引物，PCR反響體系和反響程序見雷天剛方法。篩選了12對引物，采用2對多態性高的SSR(SimpleSequenceRepeat引物對實生苗進行雜種真實性鑒定。兩對引物如下：SS17號引物的序列為:5TTCATTTGGAACAAAACCCAATTC3,5GCTGCTAATCACAGCATCAAGAGA3;CSSR038號引物的序列為:5CTTGAAAATAAGTTGAGCCA5ATCCCCAAATGAATAATC。擴增產物用8%的非變性聚丙烯酰胺電泳檢測。1.3耐堿雜種苗的篩選2021年9月，從堿性紫色土果園取土，

6、該園曾于1999年5月上旬按株行距10 x25cm栽種14萬株枳3月齡實生苗，6月下旬至7月上旬，全部14萬株枳實生苗無一例外地出現葉片黃化病癥，植株矮小、生長不良。2006年該園重新建園栽種枳砧和卡里佐枳橙砧柑橘樹，連年出現葉片嚴重缺鐵黃化病癥。，必需在每年的3月和7月分2次根施6%EDDHA-Fe才能防止葉片缺鐵黃化。從該園挖取未施EDDHA-Fe肥的果園背景土置于室內陰干混勻，以莊伊美的方法測定pPH值。12月20日將形態學雜種實生苗與父、母本的小苗同時移栽到該堿性紫色土上，分株編號。2021年3月以后，記載各株系葉片表現出程度不同的缺鐵黃化病癥時，記載其感病情況。至2021年8月10日

7、，參照彭良志方法，略加改進，從一年生實生苗末次梢最上端一片充分老熟的葉片開始評級，從該葉往下數共5片葉片黃化程度作為分級依據，用目測法將全體雜種苗葉片黃化程度分為5級。0級完全沒有病癥；1級輕度缺鐵:主脈、側脈綠色，網狀細脈間葉肉為黃綠色或淡綠色;2級中度缺鐵:主脈、側脈及其附近葉肉綠色，網狀細脈綠色，其余葉肉為黃綠色；3級嚴重缺鐵:全葉白色或黃白色，或僅有主脈為綠色其余局部為黃白色或白色；4級極度缺鐵:全葉白色或黃白色，或僅有主脈為綠色;植株葉片黃化程度按各取樣葉片的黃化程度分級求平均值4舍5入后定級。在葉片黃化程度分組后，每株采5片葉片，3-6次重復。以Wellberum等的方法用普析TU

8、-1901型紫外可見分光光度計測定各級別雜種苗葉綠素質量分數。2021年7月中旬，從葉片不表現病癥的2株耐堿雜種株系采樣，參照江榮風的方法測定葉片中活性鐵的質量分數。分別以相同pPH值條件下的父母本和葉片黃化的雜種苗作為對照采樣分析。使用PE反交實生苗幼苗在葉片形態上與母本旺蒼大葉枳比照暫未發現差異。資陽香橙為母本，枳為父本的F1實生苗，形態學鑒定結果見表1。表1資陽香橙與不同單系枳父本雜交所得雜種苗數Table1ThenumberofzygoticoffspringsfromZiyangXiangchengx4specifictrifoliateoranges 父本 Male parent

9、實生苗數/株個seedling Number 單胚雜種苗數/株個Mono- embryonic seedling Number 多胚雜種苗數/株個 Poly-embryonic seedling Number 全部雜種苗數/株個 Zygotic offspring Number 飛龍枳 Flying dragon trifoliate orange 689 11 30 41 普通枳 normal trifoliate orange 702 14 42 54 晚花枳 late-blooming trifoliate orange 159 5 18 23 旺蒼大葉枳 Wangchangdaye t

10、rifoliate orange 6014 17 13 30 2.2雜種苗的SSR鑒定以資陽香橙、旺蒼大葉枳、飛龍枳、普通枳和晚花枳為材料，從12對引物中篩選到2對多態性強的引物。利用這2對引物，對資陽香橙x枳所有F1代形態學雜種苗進行鑒定，同時還對局部葉片形態與母本相似的F1代進行鑒定，鑒定出的雜種結果見圖5、6。 M 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 150bp 100bp M：50bpDNAMarker；01：資陽香橙；02：普通枳，320：對應代表F1代群體中的118號雜種苗(父本有4種枳，1-18號

11、分別是那種父本的后代，應寫清；19-20又是什么？下同)。箭頭表示父本特征帶。M：50bpDNAMarker；01：ZiyangXiangcheng；02：normaltrifoliateoranges；03-20：zygoticoffspring圖5CSSR038號引物對形態學雜種F1代群體的擴增圖譜Fig.5ElectrophoreticpatternofthecoupleofparentsandtheirzygoticoffspringforprimerCSSR038 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 150bp 2

12、00bp M：50bpDNAMarker；01：資陽香橙；02：普通枳，320：對應代表F1代群體中的118號。箭頭表示父本特征帶。M：50bpDNAMarker；01：ZiyangXiangcheng；02：normaltrifoliateoranges；03-20：zygoticoffspring圖6SS17號引物對對形態學雜種F1代群體的擴增圖譜Fig.6ElectrophoreticpatternofthecoupleofparentsandtheirzygoticoffspringforprimerSS017用CSSR038與SS17號引物進行鑒定時，兩對引物的鑒定結果是一致的，雜種

13、苗均含有資陽香橙和枳的特征帶。其中CSSR038的特征帶在F1出現性狀別離。兩對引物都沒有父本特征帶的實生苗與形態學比照后，都無三葉，均淘汰不進行評價。由于枳的三葉為顯性性狀，因而，旺蒼大葉枳x資陽香橙的F1代群體的葉片都具有三葉的特性，在冬季落葉以前不易從形態學上有效的區分雜種苗和珠心苗。利用SS17號引物，對旺蒼大葉枳x資陽香橙雜交所獲得的所有F1代群體進行了SSR鑒定，從F1代群體中獲得了13株雜種苗。 M 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 200bp 150bp M：50bpDNAMarker；01：

14、旺蒼大葉枳；02：資陽香橙，315：F1代群體中的雜種苗。1620：F1代群體中的珠心苗。箭頭表示父本特征帶。M：50bpDNAMarker；01：Wangchangtrifoliateoranges；02：ZiyangXiangcheng；03-15：zygoticoffspring；15-20nucellarseedlings.圖7SS17號引物對旺蒼大葉枳x資陽香橙的F1代群體的擴增圖譜Fig.7Electrophoreticpatternofthecoupleofparents,zygoticoffspringandnucellarseedlingsforprimerSS017SSR鑒

15、定說明：4個以資陽香橙為母本的雜交組合，所有的雜種苗都有枳的三葉特征。而沒有三葉的實生苗，盡管出現過完全不同于母本的葉形變異特征(見圖3)，但都不是真實雜種苗。因此F1代葉形與母本葉形沒有差異的實生苗都是資陽香橙的珠心苗，可以提前淘汰。形態學上難以區分的2株資陽香橙x普通枳F1實生苗：第518號株系在第22片葉片才表現出二出復葉特征，但其后，該實生苗和該株系的高接樹一年后，都無二出或三出復葉；第51號株系，除二出復葉與三葉外，在第6、第8葉還表現出五出羽狀復葉特征，這種羽狀復葉與卡里佐枳橙的個別株系相同。經這兩對SSR引物鑒定結果：518號株系的譜帶與母本資陽香橙完全相同，是珠心苗；51號株系

16、為真實雜種苗。反交也有2個株系出現5出復葉，經SSR鑒定同樣是真實雜種苗。2.3耐堿雜種苗初步篩選在pPH8.1的堿性土條件下，移栽8個月后，枳已表現出嚴重的缺鐵黃化病癥，而資陽香橙嫩梢葉片略有黃化，香橙與枳的雜種F1表現出程度不同的耐堿性，按葉片黃化程度，可以分成5個級別。篩選到2株真實雜種苗缺鐵黃化程度為0級，即完全不表現缺鐵黃化病癥，。其他雜種苗葉片黃化級別為:1級14株，2級23株，3級23株，4級55株。雜交親本及各級別雜種苗葉片葉綠素質量分數見圖8。圖8香橙與枳雜種苗缺鐵程度與葉綠素質量分數的關系。IV:4級黃化葉片;III:3級黃化葉片；II:2級黃化葉片；I:1級黃化葉片；0:

17、0級無病癥葉片；香橙(female)；枳(male)Fig9Contentsofchlorophyllinleavesofthetestedseedlingsatdifferentyellowinglevelsofzygoticoffspringandtheirparent.IV:Thefourthgradeyellowingleaves；III:Thethirdgradeyellowingleaves;II:Thesecondgradeyellowingleaves;I:Thefirstgradeyellowingleaves;0：Zerogradeyellowingleaves;femal

18、e:ZiyangXiancheng(CitrusjunosSieb.exTanaka)；male:Trifoliateorange(Poncirustrifoliata(L.)Raf.4級極度缺鐵的雜種苗與對照枳黃化程度無差異，而0級不表現缺鐵病癥的雜種苗葉片顏色青綠色，與資陽香橙相當。葉綠素測定結果經SPSS13.0軟件(P分析說明：4級極度缺鐵的雜種苗與對照枳的葉綠素Fig2Contentsofactiveironinfreshleavesofthetestedseedlingsofthezygoticoffspringandtheirparents. 材料material 葉片活性鐵質量

19、分數 Contents of active iron in fresh leaves /mg/kg 資陽香橙Ziyang Xiancheng(Citrus junos Sieb. ex Tanaka) 耐堿雜種苗tolerance seedlings of zygotic offspring 黃化雜種苗yellowing seedlings of zygotic offspring 枳Trifoliate orange(Poncirus trifoliata (L.) Raf. 經SPSS13.0軟件分析，耐堿性較強的株系的葉片活性鐵質量分數顯著低于母本資陽香橙，但顯著高于枳和黃化的雜種苗。3

20、討論三葉遺傳，學術上有兩種理論結論，。Wabber的研究結果說明：枳可能具有同質結合的2個顯性基因由于枳和枳雜種的童期;通常要數年之久，初步篩選到的耐堿株系繼續鑒定一年后，仍未出現葉片黃化病癥，但仍有必要等到這些株系開花結實后取種子繁殖F2實生苗進一步鑒定篩選，以進一步了解不同株系耐堿的PH極限范圍。參考文獻1 DENG Xiu-xin. Advances in worldwide citrus breeding. Acta Horticulturae Sinica, 2005,32(6): 1140-11462 CHENG Zhu-sheng, WAN Liang-zhen. The atl

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