1、目前實驗室常用幾種(j zhn)細胞實驗的實驗步驟和細胞熒光染色方法小結共四十一頁幾種細胞實驗(shyn)步驟EC原代的培養 實驗(shyn)前準備器械 消化酶 M199培養基 其他大號止血鉗10把，腎形盤2個，圓頭不銹鋼針頭若干，細胞培養瓶若干，50ml離心管若干，大號組織剪2把，彎鑷1把，彎頭組織剪1把，酒精棉球若干,巴氏吸管若干，膠頭若干 二型膠原酶（1mg/ml） 胰酶Try(2.5mg/ml)M199培養原液85mlFBS 15mlL-Glu 1ml濃度為200mmol/LECGS 1ml濃度為15-20ng/ml離心液細胞培養瓶NS.共四十一頁人臍帶(qdi)縱剖面和直觀圖共四十一

2、頁實驗(shyn)操作步驟將滅菌后的實驗物品按操作順序擺放在超凈工作臺內（超凈工作臺內事先UV滅菌） 注意：紫外滅菌時應關閉日光燈，送風機，人員要離開生化(shn hu)間，20分鐘后返回關閉紫外燈，打開日光燈，風機。5分鐘后進行實驗 共四十一頁打開(d ki)NS. ，點燃酒精燈（不建議使用），將酒精棉鋪開在操作臺中央，方便將所有器械和瓶蓋的擺放。共四十一頁3 將半月盤內倒入少許無菌NS.,取出新鮮臍帶輕輕放入半月盤內，用滅菌后的脫脂棉球將臍帶外周的血跡擦干，將臍帶兩端血跡擦干以便暴露靜脈血管(xugun)。將圓頭不銹鋼針頭輕緩的插入兩端靜脈血管(xugun)內，并順勢用止血鉗夾死固定。注意

3、：本實驗操作時要戴好橡膠手套，操作前進行醫用酒精擦拭消毒，當臍帶過短時，只要一端插入圓頭針，另一端用止血鉗夾死。共四十一頁共四十一頁用無菌NS.,將臍帶靜脈血管內的淤血(yxu)沖洗干凈，直到沖出的NS.無色為止，接著將血管內的空氣抽空，兩端固定。共四十一頁共四十一頁5 將型膠原酶注入臍帶靜脈血管內，此步驟操作時，注意兩端的注射器要來回做活塞運動以便使血管內壁與型膠原酶充分接觸，注入的型膠原酶比例為8ml/15cm。注意：一般本步消化時間為10分鐘左右， 型膠原酶的溫度保證在37左右消化能力最好。特別提醒的是在消化過程中要用手來回揉搓臍帶外壁，有助于內皮細胞的脫落，此細節至關重要，決定了實驗(

4、shyn)成敗共四十一頁共四十一頁此細節(xji)至關重要共四十一頁終止消化，將靜脈內含有(hn yu)EC細胞的消化液注入含有小牛血清的離心液里終止消化，兩者比例為1:1，并用離心液沖洗靜脈血管兩次，并將收集的細胞懸液裝入離心管，封口 離心，將離心管放入離心機，設定離心速度和時間。一般1200r/min,8分鐘。 待離心機完全停穩后，打開，取出離心管。小心取放，避免震動幅度過大，倒去上清液，將貼壁細胞用新鮮的培養基全液吹打垂懸，放入細胞培養瓶（一般5ml/瓶）共四十一頁9 37,5%，CO2孵箱培養(piyng)，第二天換液，去除未貼壁細胞，繼續培養(piyng)。待細胞幾乎鋪滿瓶底時傳代約

5、為3/4。一傳二共四十一頁二 SMC的原代培養(piyng)實驗(shyn)前準備器械消化酶FD-12培養基其他大號止血鉗：2把小號止血鉗：2把小號培養皿：2個眼科剪（直）：2把眼科剪（彎）：2把眼科鑷（直）：2把眼科鑷（彎）：2把 胰酶 Try(2.5mg/ml)FD-12培養原液85mlFBS 15mlL-Glu 1ml濃度為200mmol/L細胞培養瓶NS.6孔板共四十一頁SMC 細胞(xbo)來源采用方法(fngf)：組織貼壁法共四十一頁實驗(shyn)操作步驟將滅菌后的實驗物品按操作順序擺放在超凈工作臺內（超凈工作臺內事先UV滅菌） 注意：紫外滅菌時應關閉日光燈，送風機，人員要離開生

6、化間，30分鐘后返回關閉紫外燈，打開日光燈，風機。5分鐘后進行(jnxng)實驗 將實驗過程中需要的用到的器械依次擺放在酒精燈周圍取出臍帶（5CM即可），放入半月盤內，用滅菌后脫脂棉擦去臍帶周圍血跡 注意：個體差異性大，選取臍帶時無明顯水腫，淤血，無結節現象共四十一頁觀察(gunch)臍帶縱面，找到臍帶內兩根動脈，從中間小心剪一豁口。用組織剪牽拉兩部分，直至分離出動脈血管。 將剖離的動脈轉移到一干凈的6孔板內,孔內加入少許NS.共四十一頁剝離(bl)血管外膜，小心用一眼科直鑷夾住血管一端，用另一把彎鑷輕輕向下牽拉血管外壁，直到明顯可見一層狀組織與內層組織分離。此時應夾緊該層組織，迅速向下剝離(

7、bl)。 注意：此步驟最為關鍵，直接決定細胞組織的增殖活力7 將剩下的血管組織再次轉移到另一孔內，孔內加入少許NS.,用彎鑷夾住血管一端輕輕地套在眼科剪前端，漸次將組織依次剪開，用一滅菌脫脂棉輕輕擦拭血管內壁，除去血管內皮細胞共四十一頁8 將血管中層再次轉移到一孔內,孔內加入少許(shox)培養基，用眼科剪（直）將組織盡數剪成1mm1mm的小組織塊共四十一頁將剪好的組織(zzh)塊用一彎頭吸管吸出來放進細胞培養瓶內，小心將培養基吸出來，將組織(zzh)塊輕輕地均勻的貼在細胞瓶底。 加入新鮮的培養基，小心不要將瓶底的組織塊沖刷掉。 將細胞培養瓶放入37,5%，CO2孵箱培養 注意：此時的細胞培養

8、瓶是倒置的，第二天翻轉培養瓶時才使得組織塊浸入培養基里12 培養到第六天時可見組織塊周圍有細胞攀爬出來，此后兩天便可進行初次傳代共四十一頁三 MSC的原代培養(piyng)實驗(shyn)前準備器械消化酶FD-12培養基其他大號止血鉗：2把小號止血鉗：2把小號培養皿：2個大號組織剪：2把眼科剪（直）：1把眼科鑷（直）：2把 胰酶 Try(2.5mg/ml)- MEM培養原液85mlFBS 15mlL-Glu 1ml濃度為200mmol/LSD 大鼠一只細胞培養瓶NS.5ml注射器共四十一頁培養(piyng)方法全骨髓培養法和密度梯度離心法實驗步驟1 將滅菌后的實驗物品按操作(cozu)順序擺放

9、在超凈工作臺內（超凈工作臺內事先UV滅菌） 注意：紫外滅菌時應關閉日光燈，送風機，人員要離開生化間，30分鐘后返回關閉紫外燈，打開日光燈，風機。5分鐘后進行實驗 將實驗過程中需要的用到的器械依次擺放在酒精燈周圍共四十一頁將老鼠引頸處死，放入事先配好的醫用酒精內浸泡15分鐘后，轉移到超凈室內。用大號止血鉗夾住鼠尾，用無菌NS.將大鼠身上的酒精沖洗干凈后，放入無菌半月盤內，轉移至超凈臺內。剪去鼠尾。用第一套器械，小心剝離老鼠四肢表皮，露出肌肉層。 用第二套器械，小心剝離老鼠四肢上的肌肉層，露出股骨(gg)和脛骨共四十一頁用第三套器械，小心剝離老鼠的脛骨和股骨 注意：此步驟很關鍵，在分離四肢股骨、脛

10、骨時要格外小心，最好用眼科剪，不可暴露骨髓腔將股骨和脛骨轉移到小培養皿內，里面倒入少許NS.，用眼科剪和眼科鑷將骨頭周圍的肌肉組織剝離 將剝離后的股骨和脛骨轉移到一新的培養皿內，小心并迅速(xn s)用大號組織剪剪斷骨頭兩端，暴露骨髓腔。 不建議使用酒精，此步驟以前各步在保證無菌操作情況下可避免染菌共四十一頁 將剪斷的骨髓，用5ml的注射器吸取無血 清培養基反復沖洗骨髓腔。收集骨髓懸液的培養基。 在50ml離心管內加入Ficoll人淋巴細胞分離液，將細胞懸液小心的鋪在分離液上層 注意：在操作此步驟時，要戴好手套，口罩，在Ficoll液面上鋪細胞時眼睛要與頁面平齊小心封口離心管，離心機內離心，設

11、定為2000r/min, 30分鐘 離心后 取出離心管，小心吸取離心管內中間(zhngjin)白色云霧層，用無血清培養基混勻后再次離心，設定為1500r/min,10分鐘共四十一頁 將離心后的上清液棄除，用新鮮的全培養 基垂懸細胞，裝入細胞培養瓶 15 將細胞培養瓶放入37,5%，CO2孵箱培養 24小時后將細胞瓶內的培養基吸出放入新的培養瓶內，讓尚未貼壁的細胞繼續貼壁 一般(ybn)在24h后細胞便可見梭型形，一周后傳代共四十一頁 EPC的原代培養 方法同MSC，培養基內加入VEGF誘導因子即可 SPC的原代培養 方法同上 ，培養基內加入PDGF-BB誘導因子即可 外周血來源的EPC的培養同

12、MSC的操作步驟（1117） 人臍帶(qdi)間充質干細胞的培養同SMC組織貼壁法。去除動脈血管和靜脈血管后組織貼壁即可共四十一頁八 細胞試驗中注意(zh y)的要點關于傳代問題 a try配置時PH=7.4時效果(xiogu)較好 b try使用時的溫度 37度時效果較好，過低不易消化，導致細胞死亡 c try消化后離心重新垂懸細胞活性高共四十一頁d 細胞(xbo)傳代時要充分混勻上圖為傳代(chun di)時沒有充分混勻導致細胞團聚嚴重共四十一頁關于血清問題 a EC 培養時血清含量不要高于20%。否則老化速度(sd)過快 b smc培養時原代血清含量控制在15%，傳代后控制10%左右，可

13、有效控制其老化速度 c 干細胞培養時同SMC， 在細胞旺盛期血清含量可進一步下調至5%共四十一頁關于染菌問題 a 常見的多為真菌感染，細胞瓶內可見(kjin)白色菌絲。一旦出現此種情況，需要立刻丟棄細胞瓶。孵箱內重新進行滅菌處理 b 常見細菌感染 如桿菌 球菌 支原體等 c 最近實驗室出現黑膠蟲染菌現象共四十一頁 對于“黑膠蟲”的處理方法：首先，血清買回來滅活前凍融應逐級凍融，即按照-204完全(wnqun)融化后，再置入水浴中，與室溫一起升高到56度，這樣的目的是避免溫度驟變，導致血清中的營養物質喪失活性。 第二，血清滅活后分裝保存。按照每次用血清的量分裝，盡量減少血清凍融的次數。分裝時注意

14、無_ 第三，細胞培養時血清濃度稍大一些。通常細胞培養血清濃度為10%-15%，但如果血清凍融次數過多，那營養物質喪失活性，按15%的濃度配制事實上達不到15%的營養成分，故培養基配置時一般用18%-20%的血清。共四十一頁4 關于(guny)細胞凍存 a 10%的DMSO、40%胎牛血清、50%培養基 b 4,40分鐘;-20 ,30分鐘;-80 ,24h后液氮罐保存 c 如果凍存細胞多要先把凍存液配好放四度冰箱(bngxing)(因為DMSO放熱，剛加進去和容易損傷細胞，常溫DMSO對細胞毒性也大。) d 凍存的原則是慢凍快蘇共四十一頁關于熒光(ynggung)染色實驗步驟1 細胞取出固定2

15、h后，也可4保存多日后一起染色 2 將孔板內固定液（2.5%戊二醛或者4%多聚甲醛）吸出，用PBS清洗(qngx)3次，每次5分鐘 3 用triton脫細胞液（ 0.1%濃度）包被樣品5分鐘，目的是增加細胞通透性，后用PBS清洗3次共四十一頁BSA 封閉液封閉（具體看抗體的種屬來選擇包被液) 37 4h ,也可以4過夜 抗 30um/well即可 ，37 30分鐘 取出樣品清洗3次，每次5分鐘，加一次封閉30分鐘 加熒光抗 （需避光） 30um/well 37 30分鐘 注意：此步驟不用(byng)清洗 上清液吸干 ，加DAPI（40ng/ml）濃度較好 4分鐘即可 清洗5次 熒光拍照共四十一

16、頁注 ：細胞染色有多重方法(fngf)，本實驗僅是抗-actin染色實驗。其他染色方法有很多相近之處 本總結有許多不足之處，需要不斷完善，制 定統一實驗方法共四十一頁共四十一頁做流式檢測，一般陽性指標可以檢測CD73,29,105，陰性指標可以檢測34,45等。陽性細胞活力取決于很多因素(yn s)，例如大鼠的年齡，體外分離的時間，是否有酒精的污染，胎牛血清的濃度，換液技巧等。推薦用1520FBS，頭24小時后換液指標大于95%,陰性指標小于5%,比較純共四十一頁細胞如果低密度長期培養(piyng)，容易出現老化，分化共四十一頁內容摘要目前實驗室常用幾種細胞實驗的實驗步驟和細胞熒光染色方法小結。L-Glu 1ml濃度為200mmol/L。注意：