1、關于感受態細胞及轉化克隆/建庫/表達專用超級咼效感受態細胞國外的同學說一般他們克隆都是直接購買感受態細胞轉化，實驗效率很高的。我總是以為如果是一般的克隆實驗，自己做感受態好像夠用了-如果是建庫，購買現成的感受態細胞就是非常必要的首選，因為轉化效率確實比實際手工制備的高2-3個數量級以上，特別是建庫，能實實在在地提高實驗的效率。實際上，除了建庫以外，Stratagene為更好的表達蛋白、以及轉化效率較低的巨無霸質粒，而特別優化了一些感受態細胞，做表達的人其實可以參考一下，有點用處的。生物通在 這里借用Merck公司提供的資料供大家參考。Stratagene的XL10-Gold?幾乎算得上是高效轉

2、化的代名詞了，研究者一旦要克隆大質粒、連 接DNA和建庫，克隆甲基化 DNA，進行藍白斑篩選等，首選的就是XL10-Gold?和其衍生菌。XL10-Gold? 用途包括：-克隆大DNA :包括表達質粒，基因組 DNA克隆-構建質粒文庫：減少DNA大小偏倚性，使全長cDNA克隆、雙雜交質粒等各種大小的質粒轉 化效率更接近，提高文庫代表性（比 DH10B高25倍）。Hte基因型Hte （高效轉化）基因型是 Stratagene開發的特異性提高大質粒、連接DNA的宿主菌基因型，并使細胞生長加快（當天獲得菌落），已經成功應用于25kb超螺旋DNA和8kb連接DNA的克隆。XL10-Gold? , BL

3、21-Gold , BL21-CodonPlus? , SoloPack? Gold 和 96Pack? Gold 等系列細胞都 帶有這個新的性狀。超級感受態細胞Stratagene提供多種5 x10 9轉化子/卩g超螺旋DNA轉化效率的化學法超級感受態細胞正是 克隆獲得大質粒、連接 DNA克隆和建庫時最值得推薦的。電轉化感受態細胞效率1X1010 ）電轉化感受態細胞均具有endA基因型，保證質粒優質高產；recA 重組缺陷基在DNA材料極珍貴、量少時,Stratagene的電轉化感受態細胞特別耐受電擊處理，方便好用,或構建有代表性文庫時，建議采用電轉化感受態細胞。ElectroTe n-Bl

4、ue? 細胞是目前商品化的電轉化感受態細胞中效率最高的，達到 3 x10 10轉化子/卩g超螺旋DNA。此外XL1-Blue , XL1-Blue MRF , SURE? , ABLE? 和TG1等細胞也提供電轉化形式感受態細胞。SURE?克隆不穩定 DNA大腸桿菌DNA修復系統會針對重復序列、二級結構（如 Z-DNA ）等真核DNA進行重排或刪 除修飾。SURE感受態細胞針對 uvrC,umuC,SbcC 和RecJ等參與修飾的大腸桿菌基因或蛋白進行 突變，提高了真核來源、不規則DNA的穩定性達20倍以上，并且適合克隆甲基化DNA。提供化學和電轉化感受態細胞，效率分別達1x10 10和1x1

5、0 9。ABLE?克隆毒性 DNA目的DNA的蛋白產物常常對細胞產生毒性，通常的解決辦法是采用低拷貝質粒，或者采用極為嚴緊的表達調控。為了獲得穩定的克隆，ABLE細胞減少ColE來源質粒的拷貝數（如 pUC、pBluescript系列載體），以達到保持相對較高拷貝數的同時使本底表達對于細胞的毒性降至最低的 效果。MR系列？一克隆甲基化DNA真核基因組DNA常常因高度甲基化而被大腸桿菌修飾系統切割、刪除，在構建文庫時，由于要對cDNA進行甲基化保護，某些cDNA克隆也較難完成。采用Stratagene的MR （Minus Restriction） 突變刪除了修飾系統的感受態細胞，可以構建質量非常

6、高的cDNA和基因組文庫。這些細胞包括：用于大質?？寺〉?XL10-Gold?超級感受態細胞，克隆連接DNA、轉化效率 目前最高的ElectroTen-Blue? 電轉化感受態細胞，單次反應包裝的SoloPack? Gold ，以及 XL2-Blue MRF ,XL1-Blue MRF Kan （四環素抗性質粒），XL1-Blue MR （沒有F附加體），克隆有二級結構的 SURE 細胞等。重點推薦Stratagene 的 ElectroTen-Blue （轉化效率 3X1010 ）和 Novagen 的 Nova XG Zappers （轉化因型適合甲基化 DNA克隆，確保片段不被刪除或重排

7、；能以IPTG誘導進行藍白斑篩選（lacZ M15）,也使這兩種細胞非常好用。此外，ElectroTen-Blue 還可被M13單鏈噬菌體感染（F）。感受態細胞轉化操作流程及提高轉化效率的建議1、 在冰上預冷2支14-ml BD Falcon聚丙烯圓底離心管。1支用來轉化樣品，1支做pUC18 對照。同時將 NZY+ broth培養基在42 C預熱。在轉化實驗中使用圓底14-ml BD Falcon聚丙烯試管（貨號#352059 ）也是關鍵之一。一般的試管容易被b-巰基乙醇降解。而極為重要的熱激步驟的操作也是根據這種型號的試管優化的。2、 冰上融化感受態細胞。融化時輕輕將細胞混勻并分裝成100

8、ul/管。3、 每管中加入隨試劑盒提供的4 ml b-ME （巰基乙醇）。4、 溫和轉動試管，將細胞在冰上放置10分鐘，每2分鐘溫和轉動一下。5、 每管細胞加入0.1 -50 ng樣品DNA （或2 ml連接反應物）（參見DNA質量與體積說明。）用滅菌dH2O水按1:10稀釋對照pUC18 DNA，并取1 ml稀釋的pUC18 DNA 加入轉化細胞。6、 溫和轉動試管，并在冰上放置30分鐘。7、試管在42C水浴熱激30秒。熱激時間對轉化效率極度重要。8、試管冰浴2分鐘。9、 每管加入 0.9 ml預熱（42 C）的NZY+肉湯，37C、225 t250 rpm 搖床培養1小時。10、 取200

9、 ml轉化混和物鋪帶有相應篩選抗生素的LB瓊脂糖平板（如果進行顏色篩選還需 加入IPTG和X-gal ）。pUC18陽性對照則取5 ml鋪氨芐青霉素LB瓊脂糖平板。注意：細胞經1000 rpm離心10分鐘會聚集，應將細胞沉淀用 200 *l NZY+ 肉湯重懸。如果 用于鋪板的細胞 100 ml，先將細胞加入200 ml培養基中，然后用滅菌涂布棒鋪板。 如果采用?100 ml細胞則可以直接鋪板。傾斜涂布棒并輕輕拍打，盡量減少涂布棒上的細胞殘留。11、 37 C培養過夜。顏色篩選請參見以下Blue-White Color Screening的操作指南。12、pUC18陽性對照預計有約 250個克

10、隆(？5 X109 cfu/mg pUC18 DNA )。而樣品 DNA的轉化效率隨DNA的量和組成(超螺旋或連接產物)有較大差異，大質粒和非超螺旋DNA往往得到較少的克隆。高效感受態細胞制備方法一：效率非常高，一般可到10*8，好時可到10*9，特別適宜于大片段與文庫構建及珍貴材料的連接轉化。實驗試劑：A 液：1M，MnCl2B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用無菌水配，配后不需滅菌；C液 稱取CaCI2 0.10g ，KCl 1.18g，全部轉入細口試劑瓶，然后加入46ml三蒸水，輕輕振蕩使所有組分充分溶解。將瓶塞蓋上并用牛皮紙、棉線包扎，然后放入滅菌鍋121 C高壓滅菌備用。

11、取1管B液(0.6ml )，全部加入 C液(46ml)中，混勻后，再用 1ml移液器加入3.3ml A液， 混勻冰浴即可使用。實驗步驟：1、劃線得到單菌落,37 C培養箱培養約17小時。2、 挑取2-4個形態飽滿的單菌落接種于裝有100ml SOB 培養基的三角瓶，37 C劇烈振蕩(300 rpms )培養3-4小時。3、 將培養溫度調至18 C劇烈振蕩(3280 rpms )培養，其余與普通感受態差不多。4、每管加入4ml TB緩沖液，輕輕振蕩，使菌體重新懸浮。5、加入280ml DMSO （可用國產分析純），混勻后分裝入1.5ml EP管，冰上靜置15分鐘。6、用紗布將所有裝有感受態的 E

12、P管包好，用棉線系好后放入液氮中速凍，在液氮中靜置 12 小時以上。7、取出感受態放入-70 C超低溫冰箱備用。注意事項：1、潔凈是最重要的。無菌都無所謂，在操作臺上可正常操作。2、離心力要注意不要超過 2500g,建議1500-2000g 5min。3、涂板不要覺得不勻而多次反復，輕輕在平板上帶一下感覺板上大部分地方走過即可，特別在冰箱中保存過或在溫箱中溫浴2小時以上的板。4、涂完后建議空氣晾干（20-30分鐘）這樣會減少衛星菌落出現。5、預冷是必要的。整個過程的低溫也并非特別重要。方法二：本法效率極高，建議大家采納。實驗步驟：1、 液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌*E.COLI DH5, J

13、M109,HB101等，在LB平板上劃線,37度過夜至長出單菌落。2、挑直徑1-3毫米的單菌落*可多個，接種到250毫升/3升錐形瓶 或80毫升/1升錐形瓶的 SOB培 養基. 培養基量不可再多，會影響效率。3、 在18度150-250RPM 培養19-50小時。沒有冷卻搖床的可在室溫，但不可高于37度。4、OD600約0.4-0.8時停止培養，放在冰水中冷卻10分鐘。5、4度，300RPM 離心15分鐘，回收菌體。6、 去掉上清后，用1/3體積的冰冷TB溶液懸浮，在冷10分鐘。7、再次離心回收菌體。8、用1/12.5體積的TB懸浮,添加最終濃度為 7%的DMSO,再冷卻10分鐘9.0.1-1毫升分裝，直接在液氮中凍上。9、在液氮或-80度保存。10、 將置于液氮保存的大腸桿菌劃線在LB平板上，37 C培養活化。11、 挑取經活化的大腸桿菌單菌落于