1、新型納米孔測序技術新型納米孔測序法(nanopore sequencing)是采用電泳技術，借助電泳驅動單個分子逐一 通過納米孔來實現測序的。由于納米孔的直徑非常細小，僅允許單個核酸聚合物通過，因 而可以在此基礎上使用多種方法來進行高通量檢測。此外，納米級別的孔徑保證了檢測具 有良好的持續性，所以測序的準確度非常高。對于長達1,000個堿基的單鏈DNA分子、RNA 分子或者更短的核酸分子而言，根本無需進行擴增或標記就可以使用納米孔測序法進行檢 測，這使得便宜、快速地進行DNA測序成為可能。如果對現有納米孔測序法進行進一步 發展和改進，那么它將有望成為第三代測序技術(也可稱為下、下一代測序技術)

2、，從而幫 助人們實現24小時內只花費1,000美元完成二倍體哺乳動物基因組測序這一目標。一個盛滿電解質溶液的容器被一納米孔膜隔成兩半，如果施以比較小的電壓，如約100mV 電壓，就能使用標準的電生理檢測手段測量通過納米孔的電流大小。很多生物電通道的開 關都是靠小肽段分子是否堵塞通道來實現的。基于這個事實，加州大學圣克魯茲分校(University of California Santa Cruz, UCSC)的 Deamer 和哈佛大學(Harvard University)的 George Church都不約而同地提出一個構想：如果DNA分子或者RNA分子也能堵塞某個通 道，那么應該可以運用

3、上述方法來檢測電流。接下來，Deamer和Branton等人證明了單鏈 DNA和RNA分子能通過蛋白質組成的孔道，并且能檢測到它們通過這種納米級孔道時所造 成的電流改變(圖8a)。他們使用的孔道蛋白是金黃色葡萄球菌a溶血素(Staphylococcus aureus toxin，a-hemolysin)。這種蛋白以前曾被Bayley小組用作生物傳感器。Bayley小組發 現，a溶血素蛋白非常穩定，即使在接近100C的情況下也能維持正常的功能。Deamer和 Branton等人發現，因為a溶血素蛋白孔徑非常小，簡直與單鏈核苷酸的直徑相差無幾，所 以可以將折疊卷曲的核苷酸鏈解開，并僅允許它以單鏈的

4、形式通過蛋白孔道。單鏈核苷酸 分子穿過蛋白孔道時會造成局部電流改變，即相比沒有分子穿過時的電流強度有所減小。 基于這個現象，Deamer和Branton等人猜測，如果核酸分子中每一個核苷酸通過孔道時都 能出現一種特定形式的電流改變，那么通過分析電流改變的情況不就能知道核酸的序列了 嗎？為了驗證這個想法，Deamer小組、Meller和Branton小組使用好幾種不同的RNA分子和單 鏈DNA分子進行了研究，以觀察它們對電流的影響。結果發現，polyC RNA分子引起的 電流強度下降比polyA RNA分子要強得多。此外，他們還發現，由30個A和70個C組成 的RNA分子在序列從A轉變成C時電流

5、強度也會發生改變。不過不幸的是，這種嘌吟和嘧 啶之間的明顯差異沒能在脫氧核糖核苷酸試驗中發現。實際上，在RNA試驗中觀察到的 polyA和polyC引起不同形式的電流改變是由堿基堆積(base stacking)和二級結構上的差 異造成的。隨后，使用不同DNA同聚物(DNA homopolymer)進行試驗發現，脫氧嘌吟寡 聚物(deoxypurine oligomer)和脫氧嘧啶寡聚物(deoxypyrimidine oligomer)引起的電流改 變差別并不大，只有不足5%。而且這種電流改變差異是由1015個核苷酸(占據了 a溶血 素蛋白的跨膜區)引起的，它無法區別單個核苷酸引起的電流改變

6、之間的差異(圖8a)。50:駕白奸曲蒲第墨空承亂桿注國蚓宅清32蘋支茱濡*京月里芍毛51浮虎H 導擊中可匯 旺林常3衛營鞭半：W上慕；坦迎口bJP堡堪墓 互下毒J凱卓玲無應星匚駕旦區方的 門鹿玉!S醫丹港巫辛玉三通壅嵐 I1ZC幡普弦定謂江.(D.-些瓦卅壬隱河存-國中炭苦會的岐段汁遷二探云色彰推髭涅建兀，它性薰株*M的 MB B=ET1TLiNAStE：gNMP : .所后：iNhlF灘h*米五中由云忙臺防房堇陌百*如訂一牛 項京非擊胡豈度苴衛#而蚯巳：U用采，.4一筆舍KDMA無疽術頊.3.中或CiN.&畦申凱里一個攝3酸牝 戒普尋益變壬的舊/無查色手臨壓耳1?淖匡一個華腭一喳膏哦此等二任

7、距科軒亨后的知 DbJ.*t與分子可荒變.茫交拭在弓EW采芝打號子，壬：二攔況重疇藤.*荒光.度或這些荒光afw至*4屋唁 Uhj.i的出., 如 F堂啪與M穿圭汶；.：.,手-iE果中衰型蒼電隹把至吐燈至色虬荏門-當DriA噠身譏用朱炎. 時 琪向芯建營芝氏W液生查己 芥目號一坤里膏戚輪直芷巖三掃芒己當司乏棗8此云以掌扛謳暨圭的米W序.雖然這些最初的納米孔實驗并沒有獲得預期結果，但它們至少顯示出納米孔在單分子技術方 面的應用優勢，例如高度的敏感性，同時也帶動了納米孔核酸分析技術的研究熱潮，并在 理論及實驗方面取得了一些成果。自從發現在電場力作用下，長達1000個堿基的單鏈DNA 分子也能通過

8、納米孔之后，人們就更加堅信，廉價的納米孔測序技術一定會成為現實。與 此同時，與納米孔有關的研究更是大大增加。曾有人使用液態雙分子層(ipid bilayer)構建 蛋白質孔道，最近還出現了固態材料或塑料材料的納米孔道。事實上，一直為10年內完成 1,000美元檢測個人基因組這一目標努力的美國國家人類基因組研究所(NHGRI)，已經給 納米孔測序研究提供了好幾筆經費了 (詳見 HYPERLINK /grants /grants ZguideZrfa-filesZRFA-HG-04-003.html,圖 9)。R FJOiVTI WaP.T GEH CHE iSEWEHIM TECH HOL CK

9、51 EE： TH 三 51000 SEIEE岳LEE占E BftTl : rnbruary 12 500-UiLn-b! ft PA- MG-04-0&3 dhL.i fiA.B 山作止必再& IJ.Wl ILi OF. Cl04|EXIBATIOK IXATE-! 如 bB* 1E- 2-3-3n_al IrL5itutos ot Kc=al t Ji (3TIE1t, n ib - 口口言 1C0M3MENT QF Fci5 1CZ PPiTI P3 OT.&fi2fILfL7ICH ；Nst.izin.iLl Mun-921 ij?noue R*s：Mrch Institut? WKS

10、RI)IJnt史LfLWS土，T；Tr 1 -n HL胡w、C?itA2XS OF 口憤畏&L Ddesric I strict NLiMliltuK).： 53-172LEITEKKECEm LATI： ItitCh i5j 3&Q4A 3臼pDinzhfiir 14j 2DD4IMLICATIOM XECEIB DATES kpsl 1 lSr 2004. OtEfriKK LCr 200J至三!.；. :A513F .擊片布ift； ?pmFa,；rg誑 盡管納米孔技術是好幾項單分子應用技術的基礎，但DNA鏈具有的長度還是成為采用納米 孔技術進行測序的一個障礙。此外，隨著目前合成測序法(

11、sequencing by synthesis, SBS) 技術正在不斷發展，并且費用越來越低，那是否還有必要繼續研究納米孔測序技術呢？這也 正是目前大家對納米孔測序技術的一個疑問，人們希望更多領域的科學家和研究人員可以 共同參與討論，提出合理的解決方法。納米孔測序技術的特點納米孔測序技術一個最突出的優勢就是便宜，尤其是在樣品準備階段幾乎不需要耗費什么試 劑，而且也不需要像別的測序方法那樣使用核苷酸、聚合酶或連接酶等等。因此，納米孔 測序技術要比傳統的直接測序(direct strand sequencing) Sanger合成測序法或其它方法的 費用低得多，也比最近開發出的大型高通量測序儀，

12、如羅氏公司的454、Illumina公司的 Solexa、Applied Biosystems 公司的 SOLiD、Helicos 公司的 HelioScope 等要便宜。與上述所 有技術都不同，納米孔測序技術根本無需純化的熒光素試劑，也無需進行DNA擴增，因 此不僅省去了試劑的費用，還省去了克隆、擴增的時間，真正做到了省時又省錢。一臺理想的使用電檢測技術的商業化測序儀需要由以下兩個部分組成：一次性的檢測芯片(disposable detector chip)，該芯片整合有納米孔芯片、微流體系統、電子探針系統等；以 及一套可以控制試驗操作并分析試驗數據的便攜式工作系統。假設一個芯片能對一個人的

13、 全基因組進行測序，那么這一次檢測的費用就只包括制備DNA樣品的費用、設備使用費和 一次性芯片的費用。理論上說，使用納米孔測序儀只需要用不到1哽(即從不到106個細胞中提取的不到106個 基因組拷貝)的基因組DNA樣品就可以獲得六倍的序列覆蓋量。不過，在實際操作過程 中可能需要108個基因組拷貝，這樣才能保證在25gl50gl的操作體系中達到足夠的檢測濃 度。人類108個基因組拷貝大約相當于700gg人類二倍體基因組組織，這點DNA可以用商業化 的試劑盒直接從血液等組織中抽提出來，抽提一次的費用只需要不到40美元。在納米孔測序過程中，長約6x109的二倍體哺乳動物基因組會被分割成長約50,00

14、0堿基的 單鏈DNA分子分別進行測序。這種一次檢測50,000個堿基的能力大大方便了后續序列拼 接階段的工作。如果納米孔測序技術真的能夠只需要一點點樣品，同時還不需要對樣品進行 標記等操作的話，那么檢測一次的費用就只包括芯片的費用和儀器使用費，這絕對不會超 過1,000美元。不過，要實現這一美好的目標，目前還存在幾個問題需要克服。發展納米孔測序技術可能會碰到的問題現在，基于納米孔技術已經發展出了好幾種檢測堿基的方法。下面將列舉幾種，目的不是介 紹測序方法，而是為了詳細說明納米孔測序技術會碰到的主要問題。當單鏈DNA穿過生物納米孔道或固態納米孔道時檢測電流。盡管如上所述，已經有試驗清 楚證明了可

15、以通過檢測電流強度改變的情況來區分不同的多聚核苷酸分子，但到目前為止， 還沒有一種生物納米孔或人工納米孔能有一個非常合適的幾何學結構，可以讓人們在多聚核 苷酸分子穿過納米孔時檢測單個核苷酸造成的電流改變。人們目前可用的這些納米孔都太 長，沒有一個長度短于5nm，而太長的納米孔通道會造成一次有1015個堿基的單鏈DNA 分子穿過，所以無法對單個堿基分子進行檢測。即使“無限短”的通道也無法達到所需的分 辨率，這是由于電場區域決定了通道電子讀出的區域，電場區域會向通道兩側各擴展大約一 個通道直徑的長度。因為納米孔的直徑要能允許單鏈DNA分子(直徑約1.5nm)通過，而 電流的分辨率只能達到3nm，這

16、就決定了只檢測電流強度的變化無法達到“空間”上的分辨 率要求。而且單鏈核苷多聚物在150mV的電場中，以大約1個核苷酸/四的速度通過納米孔。 但是要達到在皮安(pA)電流水平上檢測單個核苷酸的精度就需要延緩單鏈核酸分子通過 納米孔的速度，至少要超過1msec以上。雖然使用納米孔無法區分DNA鏈中相隔僅0.4nm的相鄰核苷酸，但如果納米孔技術和雜交 測序技術結合起來，那么測得的粗略的電流改變信息就能用于核酸分子測序。所謂雜交測 序，就是通過大量已知序列的探針與待測樣品雜交，然后根據產生的雜交圖譜排列出靶DNA 的序列。不過在雜交測序時，與待測樣品結合的探針的位置和數量都必須弄清楚，但是僅 靠雜交

17、測序是不能得到這些信息的。而納米孔測序技術就很容易區分單鏈DNA和雙鏈DNA 了，所以也就能很好地判斷被探針雜交的位置和數目。因此，如果能將這兩種技術結合起 來，就能實現準確的測序了。實際上，這也正是雜交輔助納米孔道測序技術（hybridization-assisted nanopore sequencing, HANS）的原理。不過，目前 HANS 技術還存在 兩大問題（表12）。SI2目前HANSil術序荏的兩丈何成綻責孔按點皇酉能準艷判祈獲31區應？日萄在桂* WDNA法告的探計上反技槌脫計準碓無誤地W精瀏尚股給芻上汪薦 在若技末上的曜制，那、竟童應諺碰用條長的CiNAU段行宣均T依次從

18、DNA鏈末端切割堿基，以檢測這些堿基逐個通過納米孔道時引起的電流變化，用這 種新方法來測序。Keller等人當初認識到可以使用核酸外切酶逐次水解DNA末端的脫氧單 磷酸核苷（deoxynucleoside monophosphate, dNMP），然后逐個識別這些dNMP，這樣就可以 對DNA鏈進行測序了。但當時苦于沒有好的辦法確認這些未被標記的dNMP，所以阻礙了 這種測序技術的發展。現在，納米孔技術的發展給這種測序技術帶來了重生的曙光。研究 發現，a溶血素與一個氨基化環糊精配體（aminocyclodextrin adaptor）結合之后（即在a溶 血素孔道內共價結合上一個環糊精），就可以

19、識別未被標記的堿基了。基于這項研究成果， 英國牛津納米孔技術公司（Oxford Nanopore Technologies）最近成功地將一個氨基化環糊 精配體共價結合到了 a溶血素孔道內（圖8b）。當一個dNMP通過固定于脂質雙分子層中的 a溶血素 氨基化環糊精孔道時，跨孔電流強度會發生四種改變，即每一種dNMP通過納米 孔道時都會引起一種特定形式的電流強度改變，因此，可以通過測量電流強度的改變來判 斷究竟是哪一種堿基（A、T、G、C）通過了納米孔。另外，由于電流強度的改變非常明顯（因為堿基堵塞納米孔和未堵塞之間，電流強度差異特別大），所以也就可以準確的判斷出 有多少個堿基通過納米孔了。現在，

20、對于這種納米孔測序技術來說，最重要的是如何保證被 核酸外切酶依次切下來的堿基能100%依次通過納米孔。由于該方法采用納米孔來識別釋 放的dNMP，而不是通過對完整的DNA鏈上的堿基進行鑒別，因此，這種逐次“閱讀”堿基 的方式能否如實反映DNA鏈中堿基的真實順序就顯得尤其重要了。最后，選擇哪種核酸外 切酶也是很重要的一步。可以采用將核酸酶和a溶血素基因剪接在一起的重組片段，或者采 用 化學方法將核酸酶與a溶血素結合在一起，從而確保釋放的dNMP能夠通過納米孔。這 種核酸外切酶應該具有可持續性、檢測時低噪音，以及同時能在高鹽環境下工作的特性。 最好這種核酸外切酶能夠切割基因組雙鏈DNA，而且易于操

21、作。納米孔測序技術使用了信號轉換技術和光學讀出技術。納米孔測序技術還有另一個發展方 向，就是將DNA序列信息轉換成兩種顏色的圖形信息，然后再通過光學讀出技術進行檢 測、分析。然而，要將熒光探針標記到DNA鏈中的每一個堿基上是非常困難的工作。于是 人們開發出了一種新的方法，用兩種不同的12堿基 寡聚體（12-mer oligos）A和B，按照四種不同的組合方式（AB、BA、AA、BB）將A、B組合起來（圖8c），這樣就可以 對DNA鏈中的每一個核苷酸進行替換了。因為單個核苷酸通過納米孔的速度實在是太快 了，完全無法進行檢測，所以將單核苷酸替換成這種長一點的寡聚體，可以減緩通過速度， 方便檢測。同

22、時，通過這種信號轉化還將DNA鏈中原本的四種信號A、T、G、C簡化成 了 A、B兩種信號。挪威 Lingvitae 公司( HYPERLINK /DPTutorial.php)%e5%b7%b2%e7%bb%8f%e6%88%90%e5%8a%9f%e5%bc%80%e5%8f%91%e5%87%ba%e4%ba%86%e4%b8%80%e7%a7%8d%e8%87%aa%e5%8a%a8%e5%8c%96 /DPTutorial.php)已經成功開發出了一種自動化 的、大規模并行處理方法。該方法可以在24小時內將一個人類基因組序列轉化成由24bp 寡聚體序列組成的“新”序列。現在，他們還在繼

23、續努力，希望能開發出更便宜、出錯率更 低、寡聚體片段更長，同時耗時更短的信號轉化方法。進行這種信號轉化看起來是增加了一 個步驟，這好像與納米孔測序的初衷(不需要進行標記等額外操作步驟)相悖，但實際情 況是，由于增加了這個步驟極大地簡化了后續的信號(序列)讀取工作，而這點恰恰是令其 它測序方法頭疼不已的大麻煩。使用兩種能分別與 A、B互補的12bp長的“分子信標”(molecular beacon)(詳見 HYPERLINK /Introduction.html /Introduction.html 雜交過程見圖 10)與經過上述信號轉化 之后形成的新DNA鏈雜交。分子信標由于自我猝滅(self

24、-quenching)機制的作用，在溶液 中的熒光背景信號極低(圖8c)。同樣，當分子信標與新DNA鏈雜交之后，由于臨近信標間存在相互猝滅作用，所以熒光信 號依然很弱(圖8c)。但當雜交鏈通過直徑不到2nm的納米孔時，與新DNA鏈互補結合 的寡聚體會脫落，并釋放出熒光信號，只需依次檢測這些熒光信號就能對原始DNA鏈進行 測序。將高密度納米孔芯片技術、光學讀取技術、高分辨率電子倍增電荷偶聯攝像技術(high resolution electron-multiplying charge-coupled device camera)結合起來，就可以同時并行處理 大量數據，大大提高測序速度。由于納米孔

25、不需要借助電子吸附(electrical contact)表面 修飾(urface modification)或轉位過程(translocation process )等步驟就可以裝載到芯片上， 因此可以得到極高密度的納米孔芯片。現在的納米加工技術(nanofabrication) 已經可以達 到上述要求了。不過，目前要生產出直徑在1.7nm2.0nm的高密度納米孔芯片還存在一定 困難。于飛嚀與口*戶，至拌JS示M吾 *.耳布擊Tin 矽-timRwg當單鏈DNA通過嵌有探針的固態納米孔時檢測橫向隧穿電流或電容。有這樣一種理論認為， 當單鏈DNA通過嵌有探針的固態納米孔時，通過每一個堿基的橫向

26、電流都各不相同，故 根據電流情況判斷出是哪種堿基通過，也就能對ssDNA進行測序了(圖8d)。這種方法與 前面所述的因為每種堿基堵塞了納米孔道導致電流減小的幅度不同來對堿基進行判斷的方 法不同，它是檢測橫向裝載在納米孔道中的一對電極對通過納米孔的堿基施加的橫向電流來 判斷究竟是哪種堿基通過的。雖然在試驗中該方法的效果很不錯，但是還是要介紹一下有 關該方法的幾種不同觀點。與在掃描隧道顯微鏡(scanning tunneling microscope, STM)中一樣，使用合適的探針(電極)， 可以得到納安級(nano-ampere)的電子隧穿電流。使用這種納安級的電流檢測堿基的速度 比在直徑不到

27、3nm的納米孔中使用皮安級的電流檢測要快得多。雖然這種方法只需使用納 米孔和電流檢測設備，并有望成為最便宜、最快速的測序技術，但它也面臨著四種主要的 挑戰(表13)。沽13條甬垸安贖印尹理浪混基的嘿度的育法存性的ESG蘭要擔技菖曇橫化葷遷志壓fdH為白biE：制洎茁襄律，頓童能最大化地國分四神不底的理基，誼到高準葬度心航布一套機制保H蒞一入訝芫？II曇一忘的方權要蛙電松、團為隧穿電？t蕓E寇，多.祓伯母在方向司距 聽上發生雨子鼠的孰說部各引起隧穿電流坷安化=心航產成制株哽,岸向mu納米？l時的泄度、聰保母一匹要精在電ta處匪如作留。,|爪缸以麻證椎 測的推曲性玲肖除皆黑琨京占鼻工冠動吾英的二剃

28、）.這*跨H曳至能棵證甘每一個睡基的瘦瀏時間引 旻此用景新的疝置誠*喬理溥.而正狠里芝所福的曠間Witj兩個戳歇上們邛在e不灣囹嗔閭魔寞皂噪丁靛區分囚種眥基之封，呈否妊馥禎列黑基之回的空隨cp：.如 SnESlp-耶么奩溫仔天沖口心時就推瞞很汗扼區泠前后混蘭言間的陌仔了不過，現在使用單壁碳納米管（single-walled carbon nanotube）就有望解決上述第二和第三 個挑戰，如果對碳納米管進行合適的改造甚至還能解決第一個挑戰。納米管能以一種獨特的 方式和方向與堿基結合，而且每一個堿基的結合活化焓（binding activation enthalpie）%7 便于控制DNA鏈通過

29、納米管的速度，也都處于可被溫度、離子強度或偏置電壓調控的范圍 之內。要借助橫向隧穿電流來分辨堿基還有一種方法，就是在化學修飾的金屬電極和待測堿基之間 形成堿基特異性的氫鍵。Ohshiro和Umezawa發現，在STM中如果金屬探針（電極）被A、 G、C、U的硫氫基（thiol）修飾之后，電極和堿基之間的隧穿電流會被極大地放大。他們 發現，使用經胞嘧啶修飾過的探針（電極），可以區分出序列TTTTTTTTGTTTTTTTTT和 序列 TTTTTTTGGTTTTTTTTT。基于 Ohshiro 和 Umezawa 的工作，Lindsay 等人猜想，是 否可以使用經兩種不同化學修飾方法加工過的電極，令

30、其中一組電極能結合核苷酸的磷酸基 團，而另一對電極能結合核苷酸的堿基基團（圖11）。這樣，在每一個核苷酸通過納米孔 中的“閱讀器（電極）”時就會通過“電流距離”（current-distance）而不是通過靜態的“隧穿 電流”而被檢測出來。A、C、G、T四種“閱讀器”中的每一種都會借助上面的功能基團與通 過納米孔的同一種堿基形成氫鍵。將這四種閱讀器鏈接在一起形成“DNA鏈”就可以對 dsDNA鏈進行測序了。不過，要同時將四條dsDNA鏈穿過四個閱讀器還是一大難題。壬1 ；荒H學摩京汽三髭米孔噠史弟.當一直口14，.理五”采叫蕨堇三貌悌” 七與一個宅也上站基污荻卻”炒*與IJN#.至：fc間為芨

31、黑還有人提出可以將金屬氧化硅電容和納米孔技術結合在一起通過對DNA進行靜電檢測以達 到測序的目的。透射電鏡（transmission electron microscope, TEM）發射的電子束可以將納米 孔固定到兩層摻雜硅構成的膜上（中間被厚約5nm的SiO2絕緣層隔開）。當有DNA鏈穿過 納米孔時，可以檢測到兩層硅膜間電容的靜電勢和電壓發生了改變。仿真結果表明，A、C、 G、T都有其各自獨特的電容信號，因此從理論上來說也可以通過這種方法進行測序。在早 期的一次試 驗中發現能夠檢測到DNA鏈通過納米孔時引起的電壓變化，但是由于時間太 短，還無法區分出單個的堿基。目前，該方法面臨的主要問題也

32、是如何控制堿基通過納米 孔時的速度和方向。獲取較長的測序長度納米孔測序技術還有一個非常吸引人的優勢，那就是測序距離長。因為納米孔測序儀對通過 的每個堿基進行測序，與前后的測序結果都無關。因此從原則上來說，使用納米孔測序技 術，只要DNA鏈不發生斷裂，并且能一直通過納米孔，就可以一直檢測下去。到目前為止， 人們已經證明，長達25kb的ssDNA能夠一次性通過生物納米孔，長達5.4kb的ssDNA能 夠一次性通過固態納米孔。因此，如果檢測技術能得到進一步的改善（能檢測快速通過納米 孔的堿基），納米孔測序技術還是具有非常好的應用前景的。雖然現在還無法確切獲悉納米 孔測序技術的準確度有多高，但可以確定

33、插入、缺失等序列錯誤不會影響片段的讀出長度， 因為相移在獨立的單分子讀序中并不是一個問題。只要所測序列是隨機的，而不是系統的或 具有位點依賴性的，那么足夠高的序列覆蓋率便可以保證任何水平的準確度。此外，雖然目前的第二代測序儀的測序長度較短，但它們具有高通量的優勢，因此可以將納 米孔測序技術和這些第二代測序技術結合起來，以彌補第二代測序儀在測序長度方面的不 足。考慮到在未來的測序技術發展趨勢中，測序長度是至關重要的一個指標，因此還需要進一步 研究，以弄清納米孔測序技術在檢測ssDNA時測序的極限長度 是多少。納米孔測序技術在 檢測單鏈寡聚物（不到50個堿基）時可以進行高通量檢測，此時核酸鏈通過a

34、溶血素納米 孔的速度大約是5.8個低聚物/sec gMo因為核酸鏈大分子穿過納米孔的速度與其在溶液中的 摩爾濃度有關，而摩爾濃度又不能太高以免溶液太粘稠，因此還需要進行試驗驗證50kb長 的ssDNA是否能以一個合適的速度通過納米孔。已經有幾篇論文報道指出，使用直徑約 3nm6nm的納米孔能夠檢測長約3kb10kb的ssDNA及dsDNA片段（核酸分子的濃度在 10nM20nM之間），不過文章中都沒有提及核酸分子通過納米孔的速度。此外，雖然Branton 等人已經證實了 48kb的X-DNA可以通過納米孔，但是使用最新的納米孔捕獲及再捕獲技 術對長基因片段進行測序時的效率更高。納米孔捕獲及再捕

35、獲技術對于提高測序質量非常 重要，因為借助這種技術就可以對同一個堿基進行反復測序。當堿基初次通過納米孔時，如 果檢測信號質量不高，實時監測軟件就會“命令”該堿基再次通過納米孔并重新接受檢測， 直至獲得滿意的信號為止，而不需要重新準備樣品，從頭再測一次。控制DNA通過納米孔DNA高速通過納米孔的特性使得高速測序成為可能，但同時這種高速度也正是很多納米孔 測序技術的“阿喀琉斯之踵（Achilles heel，意即弱點）”。因為速度太快，檢測的信號質量 就不高，甚至很多小的信號根本就檢測不到。在120mV的條件下，DNA會以每個堿基 /1gs20gs的速度通過a溶血素納米孔。這就需要探測器的檢測帶寬

36、達到MHz級，才能檢測 到皮安級的電流強度。當DNA在電泳作用下通過納米孔時，由于擴散作用的影響，降低了測序的質量。由于DNA 分子的隨機運動使得它通過納米孔的時間，即通過時間（transittime）的跨度非常大（這一 點從理論上和試驗上都已經證實了），因此，人們無法判斷有多少堿基通過了納米孔。而且， 由于跨孔DNA分子與納米孔表面間存在的非特異性的相互作用還會受到非連續性的粘滑 現象（discontinuous stick-slip phenomena）影響，所以相互作用會發生改變。這種相互作用 改變的本質和頻率會引起“逃避時間（escape time，解離時間）發生非泊松分布（non-P

37、oisson distribution），于是，同一種堿基分子通過納米孔時的通過時間也會不同。而且，如果堿基 分子通過納米孔的時間小于平均通過時間，那么它極有可能被漏檢。鑒于此，對于納米孔測序技術來說，最為重要的一點就是如何控制并減慢DNA分子通過納 米孔的速度，同時盡量消除由于納米孔表面相互作用給DNA分子跨孔動力學上造成的波 動現象。降溫和增加溶液的粘稠度可以在一定程度上減慢DNA分子通過納米孔的速度，但 這兩種方法都不能消除因納米孔表面相互作用造成的跨孔動力學波動現象。真正能降低 DNA跨孔速度的方法見表14。口曲瓦 丘筮或DM瓏結芻.演境其售對域榮：L的匣度 爆虱律化說弟弟：攔緣辟性的

38、DNA#踱士 (s-uttattr uririppi的o-f DMA aliat?,適也是攜孔的限理步寐上述這些限速步驟所達到的速度都在每個堿基/數毫秒級，同時還都會受到離子強度、溫度 以及跨孔偏置電壓的影響。最理想的狀態是，如果能發現一種電信號來代表堿基間的“空隙”，那就能清楚地知道有多少 個堿基通過了納米孔了。這種信號對于分析跨孔動力學和堿基孔內停留時間等都具有很高 的使用價值，而且可以據此來決定測序儀的檢測帶寬和其它參數。但在該信號出現之前，人 們還需弄清楚DNA的跨孔動力學，同時還要開 發出控制DNA跨孔速度的辦法。納米孔制 造技術的發展使得我們能夠制造出特殊的納米孔，這些納米孔的背景噪聲很低，而且能夠調 控DNA與納米孔表面的相互作用。最終，將DNA跨孔速度控制技術、高帶寬技術、低噪 聲檢測技術結合在一起，就能制造出高速納米孔測序儀了。生物納米孔的穩定性問題和固態納米孔的制造問題溶血素七聚體(hemolysin heptamer)是最常用于在脂質雙分子層中制造生物納米孔的材料， 它性質非常穩定。但脂質雙分子層的性質卻不那么穩定，尤其是液態脂質雙分子層，制造起 來極難且費時。Bayley等人發現包裹在兩層薄瓊脂糖中的裝載有a溶血素納米孔的雙分子層非常穩