1、WesternBlot 實驗方法及注意事項 實驗原理：WesternBlot印跡方法，又稱為免疫印記，是將獲得的蛋白質樣品 通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，對不同分子量的蛋白質進行分離，并 通過轉移電泳將凝膠上分離到的蛋白質轉印至固相支持物（NC膜或PVD用莫）上，用抗靶蛋白的非標記抗體（一抗）與轉印后膜上的靶蛋 白進行特異性結合，再與經辣根過氧化物酶標記（偶聯）的二抗結合， 最后用ECU敏發光液試劑檢測。如果車印膜上含有靶蛋白，經X光片曝光、顯影后，則會在 X-光片上出現特異性蛋白條帶。 實驗材料：分離膠及積層膠溶液、水飽和異丁醇、iXTris ?Cl/SDS,pH8,8、蛋白質分子量標準混合

2、物 、1XSDS電泳緩沖液、電 泳裝置及夾子、玻璃板、灌膠支架、緩沖液梢等附件、0.75mmfef邊墊片、0.75mmt羊品梳子、50膜微量加樣器、恒流電源 常用試劑：30%f烯酰胺/0.8% N,N-亞甲丙烯酰胺將30克丙烯酰胺和0.8克N,N-亞甲丙烯酰胺溶于總體積為60ml 水中，加熱至37c溶解之，補加水至終體積為100ml。0.45 m微孔濾 膜過濾除菌，查證該溶液pH應不大于7.0 ,置棕色瓶中保存。小心：丙烯酰胺具有很強的神經毒性并可通過皮膚吸收，具作用 具有累積性。稱量丙烯酰胺和N,N-亞甲丙烯酰胺時應戴手套和面具。可認為聚丙烯酰胺無毒，但也應謹慎操作，因為它還可能含有少量未

3、聚合材料。4x Tris ? Cl/SDS,pH8.8,在 300mlH2計溶解 91g Tris 堿(1.5mol/L),用 1mol/L 調節 pH 至8.8,補加H2O至體積500ml。用0.45止m濾膜過濾溶液，再加入2g SDS0.4%(w/v),于 4 c 可保存 1 月。4x Tris ? Cl/SDS,pH6.8,在 40mlH2計溶解 6.05g Tris 堿(0.5mol/L),用 1mol/L 調節 pH 至6.8,補加H2O至體積100ml。用0.45 m濾膜過濾溶液，再加入0.4g SDS0.4%(w/v),于 4 c 可保存 1 月。4XSDS電泳緩沖液Tris b

4、ase 24.2 g 、Glycerin 115.3 g 、20%SDS 20 ml加水至總體積1000ml。應用時稀釋4倍即為1XSDS電泳緩沖液(Tris 0.05M,Glycerin 0.38M,SDS 0.1%)。TEMED (N,N,N ,N-四甲基乙二胺)TEMEDI過催化過硫酸鏤形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N-亞甲丙烯酰胺的聚合。10%硫酸鏤過硫酸鏤提供驅動丙烯酰胺和亞甲丙烯酰胺聚合所必需配自由 基。可用去離子水配制小量10%(w/v)配貯存液并保存于4C。由于過 硫酸鏤會緩慢分解，故應隔周新鮮配制。實驗步驟: 轉染后的樣品，收毒，12000rpm離心，2min,去上清，細胞碎

5、片就直接進行下面步驟：(1)力口入 10 x RIPA buffer/ 每孑L 200 , 4 裂解 30min。(2)準備熱變性，用八連管，每孔加入 5 x loading buffer 5(3)用20膜 移液槍，將裂解后的細胞取出20屋，力口入對應的八連管 中，并吹打混勻。(4)封口，用PCFa進行熱變性處理：97 8min。(5) 4儲存變性后的樣品，待檢。1、 SDS膠的配制預先配制混合液(Tris-HCL/Acr-bis/SDS/H2O ) ,APS 以及 TEMED 在配制凝膠時現加。分離膠：用1.5M Tris-HCL 8.8、10粉離膠。(所謂的10麻度為Acr-Bis的濃度，

6、即丙烯酰胺的濃度，用水定容，其他成分不變)；濃縮膠：用 1M Tirs-HCL 6.8、濃度：5%2、上樣電泳：所用梳子為15孔，Marker占用一孔，故每塊凝膠可以檢測14支樣品。上樣量：Marker： 5屋/孔； 樣品：20區l/孔；參數：80V,待樣品跑出上樣孔；120V,樣品進入分離膠；200V,直至結束(藍色指示帶 到凝膠底部即完成電泳)3、轉膜：轉膜三明治結構順序：黑色板、網墊、一層濾紙、凝膠（習慣將Marker 放在右側）、NC膜（在膜的蛋白面左上角做好標記）、兩層濾紙、網墊、白色板。備注：所用的濾紙也分粗糙面和細膩面，細膩面對著凝膠和NC膜，粗糙面對著網墊。將三明治結構的夾子放

7、入電極時，黑色板對應電極的黑色一面（負極）、白色版對應電極的紅色一面（正極）。強調：凝膠和NCI （硝化纖維素膜）的順序千萬不要放反，所用的 NC 膜分粗糙面和光滑面，粗糙面為接受蛋白面，該面和凝膠直接接觸。蓋梢蓋時，同樣注意黑色對應黑色、紅色對應紅色；同樣導線電極連接電源的時候，也是黑色對黑色、紅色對紅色。上述任何一步弄反，都會導致蛋白轉膜失敗，切記。轉膜所用參數：穩流45mA過夜（999min）。4、封閉所用封閉液：5% Nonfat milk ,用 TBSTt己制，RT （室溫），30min1h（根據實際情況確定時間，比如封閉液已使用次數、ECL顯色的背景）。為了防止奶粉變質，加入疊氮鈉

8、即 NaN3（ 一種光譜的防腐劑），終濃度為0.02% （本實驗室疊氮鈉儲存液濃度為 2%洗：TBST洗去殘余的奶粉。5、一抗孵育所用抗體：mouse Anti-Flag。一抗稀釋：4%BSA by Super Block, 1:1000。亦加入 0.02% 的疊氮鈉NaN3孵育：R1 23h。洗：TBST 3 x 5min6、二抗孵育所用抗體：HRP anti-mouse。二抗稀釋：5%Nonfat milk by TBST , 1:2000.（二抗一般用兩次或三 次就更新）（強調：二抗中不可以加NaN3，因為其會抑制HR用勺活性） 孵育：RT, 1h。洗：TBST 6 x 5min。7、顯

9、色：ECLA液/B液，各取300屋等體積混合，現用現配。用熒光筆標記好 NC 膜上的Marker以及上樣孔的位置。將反應液均勻的加到膜上（蛋白面）， 浸濕整張膜，然后輕輕的將膜的蛋白面向下放入顯色儀，蓋上蓋子， 點擊開始。注意事項1、開始配膠的板子一定得夾緊，防止漏膠。2、上樣的板子也得夾緊，防止漏電緩液，在跑膠出現膠的快慢不一樣， 原因上樣前兩塊膠的板子沒有加緊漏電緩液，還有就是膠的濃度不一 樣。3、上樣時，marker5ul加5 x loading buffer混勻一起上樣，這樣可 以防止在跑電泳的過程，樣品把 marker給擠的越來越窄。4、轉膜時，NC膜的正面左上角先用marker筆做

10、好標記，防止后面孵 育抗體與顯色的過程分不清 NC膜的正反面。5、轉膜之前，先把NC膜放在轉膜液浸泡，注意從一端慢慢的往下浸泡，否者NC膜容易泡不透，影響轉膜。6、顯色時，往NC膜上加轉膜液也得從一邊慢慢往下加，否者最后顯色效果也不好。7、轉膜時，NC膜與膠的接觸之前千萬不可有氣泡， 否者對結果的目的 條帶有影響。常見問題1、膠片是一片空白，是怎么回事？如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現在一抗和抗原制備上。1)二抗的HRP活性太強，將底物消耗光；ECL底物中H2O杯穩定，失活；ECL底物沒覆蓋到相應位置；一抗選擇不當；5)二抗失活。2、背景高咋回事？膜沒有完全均勻濕透，建議 使用100

11、% methanol浸透膜；洗膜不充分，可以增加洗液體積和洗滌次數；電極不平衡或者加樣位置偏斜，可以調整電極和加樣；封閉物用量不足，可以提高封閉物濃度，孵育時保證封閉液完全浸沒轉印膜；封閉物使用不當，比如檢測生物素標記的蛋白時不可用脫脂奶粉封閉；封閉時間不夠，一般情況下室溫37度封閉1小時以上或者4度封閉過 夜；7）抗體非特異性結合，可以降低抗體濃度，減少孵育時間一抗稀釋度不適宜，可以對抗體進行滴度測試，選擇最適宜的抗體 稀釋度一抗孵育的溫度偏高，建議4c結合過夜10）抗體濃度過高或洗滌不夠，建議降低抗體濃度，增加洗滌次數和時間11）化學顯色底物過多，建議按說明書加入適量的顯色底物3、為啥條帶

12、形狀不好看？1）膠凝的不均勻或聚合不好，建議灌膠前將溶液充分混勻2）某些樣品鹽濃度較高，建議除鹽或將樣品鹽濃度調成一致3）緩沖液陳舊，成分改變，可以重配4）凝膠下面有氣泡，電泳前要先將氣泡趕走5）電泳時溫度過高，可以降低電流或電壓6）樣品中含有不溶性顆粒，建議樣品充分攪拌混勻4、蛋白條帶位置（大小）不對咋整？膠濃度不對，不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差，可以調整濃度抗體孵育不充分，建議增加抗體濃度，延長孵育時間3）酶失活，建議直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活 了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物4）目的蛋白存在翻譯后修飾或剪切體，建議查詢相關文獻確定5）標本中不含靶蛋白

13、或靶蛋白含量太低，建議設置陽性對照比對結果, 增加標本上樣量5、有很多雜帶咋回事？1）目的蛋白有多個修飾位點，本身可以呈現多條帶，建議查閱文獻或 進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確 定蛋白實際大小2）樣本處理過程中目的蛋白發生降解，建議加入蛋白酶抑制劑；樣本 處理時在冰上操作3）雜蛋白多，建議處理目的蛋白4）抗體特異性不強，建議使用特異性強的抗體5）抗體孵育時間過久，建議減少抗體孵育時間6）二抗與抗原有交叉反應，建議選擇合適的封閉物7）二聚體或多聚體存在，建議增加蛋白質變性過程及強度8）底物顯色與曝光時間過長，建議縮短顯色及曝光的時間6、背景有黑色斑點或有不均勻的白色

14、斑點以及暗背景上白色帶1）抗體與封閉試劑反應，建議使用前過濾封閉試劑HR哈量過高，建議降低酶聯二抗的濃度HRH禺聯二抗中有聚集體，建議過濾二抗試劑，去除聚集體4）抗體分布不均勻，建議孵育抗體時使用搖床7、細胞水平要做 WB多少細胞提的蛋白夠做 WB答：一般5X10八6就足夠。8、為什么我的細胞提取液中沒有檢測到目的蛋白？可能的原因有：1）細胞中不表達這種蛋白質，換一種細胞；2）抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，是否有問題；3）可能是沒有保持低溫操作，樣品保存不當，樣品放置時間過長；4）細胞中的蛋白質被酶降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶 活性。9、我的目的帶很弱，如何加強？1）可以加大抗

15、原上樣量，這是最主要的；2）也可以將一抗稀釋比例降低；3）還可以延長曝光時間。10、我做的蛋白質分子量很小（10KD ,請問怎么做 WB1）可選擇孔徑0.22um的PVDF膜或者NC膜，轉膜時間縮短，另外可采用 Tricine-SDS體系；2）也可以選擇PSQ膜，同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起， 再轉移。其他按步驟即可。11、大分子量蛋白200KD在做W嚷注意什么？1）做200kd蛋白的WB寸要注意，分離膠最好選擇7%勺；剝膠時要小 心；2）轉移時間需要相應延長；要做分子量參照（否則出現雜帶不知道如 何分析）；3）轉膜液中甲醇含量可適當降低，推薦使用濕裝轉膜效率更高哦！12、如果上樣

16、量超載，要用什么方法來增加上樣量？可以濃縮樣品，也可以根據目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一 般地，超載30%是不會有問題的。如果已經超了不少了，而且小分子 量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試 1.5mm的。13、WE抗體的可以重復應用嗎？抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴，可反 復使用2- 3次。稀釋后應在2 3天內使用，4度保存，避免反復凍融。 14、上下梢緩沖液有何要求，怎樣才能達到最佳效果？無特殊要求。但一般是上梢放新鮮的緩沖液，下梢可以是重復使用過 一兩次的緩沖液。15、免疫組化和 W麗以用同一種抗體嗎？免疫組化時抗體識別的是未經變性處理的抗原決定簇（又稱表位）， 有些表位是線性的，而有的屬于構象型；線性表位不受蛋白變性的影 響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空間結構 限制，煮后變性會消失。如果所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個 氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于