1、解讀(ji d)個體化醫學檢測與實驗室自建試劑方法 李金明個體化醫學(yxu)（personalized medicine）通俗顧講，就是疾病的治療“因人而異”的醫學，確切地說，是根據每個患者的個體特征制定相應的治療策略的醫學，但并不意味著對每個病人都準備一套藥物或設立一套治療設備，而是根據患者對特定疾病的易感性以及對特定治療的應答程度進行分類治療，使得預防或治療性的干預措施能集中于確定會受益的人群，從而為那些不會受益的人群節省醫療開支并減少藥物的副反應。個體化醫學檢測則是為疾病的個體化治療決策服務的，也就是通過實驗室檢測，確定患者是否會對特定的治療產生(chnshng)有效的應答。2003年

2、人類基因組計劃基本完成后，進入到后基因組時代，功能基因組的研究，揭示了占人類基因組約1%的單核苷酸多態性（SNPs）不但決定個體的“高矮胖瘦”等外在特征，也決定了個體對外在刺激應對能力以及進入機體的化學物質如藥物等的代謝能力，于是產生了藥物基因組學。各種細胞信號傳導通路的深入基出研究，產生了疾病的靶向治療概念，各種靶向治療藥物研發的跟進，使得靶向治療成為現實，但靶向治療的有效性又與相應基因結構的改變、表達以及代謝密切相關。因此，進行相應基因及結構改變以及基因表達等的檢測是相關檢測的基礎，在分子水平上做出臨床診斷，從而增加診斷的準確性并根據患者的遺傳特征選擇合適的治療方法，這就是個體化醫學檢測，

3、其意義通俗地講，就是決定特定的治療藥物或方法是否能用或用多用少。個體化醫學檢測(jin c)目前國內既有經國家食品藥品監督管理總局（CFDA）批準的商品試劑，也有實驗室自建試劑方法（laboratory developed tests， LDTs） ， 但實驗室對LDTs 、性能驗證（verification）和性能確認（validation）等概念通常比較模糊，如何去做性能驗證和性能確認，以及在什么情況下做，性能驗證的合格判決斷標準(biozhn)等，也不清楚。本文特就上述方面談一點個人的理解(lji)和思考。一、國內個體化醫學檢測現狀及特點近幾年來，國內醫療機構臨床實驗室已開展了一些涉及腫

4、瘤靶向治療基因突變和藥物代謝基因多態性檢測等個體化醫學檢測項目，并呈快速增加之勢，有以下幾個方面的特點。采用的技術平臺多以聚合酶鏈反應（PCR）為基礎的技術為主，如實時熒光PCR方法（包括擴增阻礙突變系統法Amplification Refractory Mutation System，ARMS、PCR-高分辨溶點曲線分析HRM等）、PCR-雜交法（如膜上、芯片基因芯片 、乳膠顆粒Luminex）、PCR-質譜、PCR-Sanger測序、PCR-焦磷酸測序、PCR-新一代高通量測序等，其它較為常用的還有熒光原位雜交（FISH）和免疫組化等。涉及的臨床(ln chun)科室多目前國內開展個體化醫

5、學檢測的臨床實驗室所涉及的科室非常多，因為個體化藥物治療研究進展日新月異，可考慮采用基因檢測來決定藥物使用的藥物名單越拉越長，幾乎涉及所有臨床科室，只要相應科室的主任有相應知識和意識(y sh)，也有實驗室，就有可能去開展相關檢驗項目。因此，國內目前開展個體化醫學檢測項目的實驗室大部分在非檢驗科的其它科室或臨床科室的研究實驗室，如病理科、藥劑科、婦產科、腫瘤科、心胸外科、眼科、耳鼻喉科、轉化醫學中心、中心實驗室、醫療機構研究所和醫學檢驗所等。3、自配試劑(shj)多個體化醫學檢測盡管已有一些國家食品藥品監督管理總局（CFDA）批準的檢測試劑，涉及約30余個檢驗項目，但仍有許多實驗室所使用的試劑

6、為自配試劑或方法為自建方法，即LDTs，如幾乎所有PCR-Sanger測序、PCR-限制性長度片段多態性分析（RFLP）、PCR-質譜和PCR-高通量測序等。此外，有許多實驗室對商品試劑盒的組份及操作進行了改變，一旦出現這種改變，所用試劑即應被視為LDTs。還有，如果使用無證商品試劑，也屬于LDTs。所以LDTs目前應可以分為三類：（1）實驗室通過購買試劑盒原材料如引物、探針、擴增緩沖液、酶等，配制(pizh)的自用試劑；（2）實驗室購買的是經過批準的商品試劑，但對試劑盒組份或操作過程進行(jnxng)了改變；（3）實驗室購買(gumi)的是未經過批準的無證商品試劑。二、國內外對體外診斷產品和

7、LDTs管理在北美和歐洲，涉及人類基因的個體化醫學檢測，極少有經過批準的商品試劑盒或檢測系數統，絕大部分都是由醫療機構通過使用LDTs來完成的。在美國，1976年的聯邦食品、藥品和化妝品醫學產品法案修正案（The 1976 Medical Device Amendments to the Federal Food，Drug and Cosmetic Act，FD&CA)授權美國食品藥品監督管理局（FDA）監管包括體外診斷產品（in vitro diagnostic devices，IVDs）在內的醫學產品。IVDs定義為用于疾病診斷或包括為治療或預防疾病確定患者健康狀態的其它目的的試劑、儀器和

8、系統，為作為商品銷售。根據其對患者的風險評估分為三類，I類為低風險，用于患者前，不需要評估或批準；類為中度風險，而進行一般和特定的控制，常需通過進入市場前的告知方式或者510（K）過程由FDA進行評估；類為高風險，則需要進入市場前的批準（premarket approval，PMA）程序。一般的藥物遺傳檢測屬于類。加拿大則將IVDs的風險分為四級，遺傳檢測歸為類，即對公眾健康有中等風險或對個體有高風險。歐盟則制定了“體外診斷醫學產品指令”（the In Vitro Diagnostic Medical Devices DirectiveCouncil Directive 98/79/EC），作

9、為歐盟的IVDs監管的要求，設定了最低安全、質量和性能標準，但具體評價由成員國的監管機構進行，一旦通過一個國家的批準，則全歐盟成員國通行有效。在國內，IVDs的監管由國家食品藥品監督管理總局（CFDA）負責，管理法規是以國務院令形式發布醫療器械監督管理條例，同樣，IVDs按低、中和高風險分為三類，第一類實行產品備案管理，第二類、第三類實行產品注冊管理。二類由省級藥監部門負責注冊，三類由CFDA負責注冊。相對于IVDs，臨床實驗室為疾病診斷和治療進行(jnxng)實驗室檢測及報告結果，在美國應遵循“1988年的臨床實驗室改進修正案（the Clinical Laboratory Improvem

10、ent Amendments of 1988，CLIA)，具體由美國醫療保險和醫療補助中心（the Centers for Medicare& Medicaid Services，CMS）監管，遵循CLIA要求對實驗室檢查、認證和認可由CMS或獨立的授權機構如病理學家協會（the College of American Pathologists，CAP）負責。CLIA關注的是檢測過程的準確性和可靠性，以及質量控制、室間質量評價（能力驗證）、實驗室檢測人員的證書、報告結果的要求和標準操作程序（SOP）文件，實驗室負責人起著核心作用。作為CLIA的一部分，FDA將實驗室檢測根據其復雜程度分為豁免、

11、中度和高度復雜三類，CLIA再針對這三類檢測提出不同的管理要求。CLIA允許臨床實驗室修改FDA批準的診斷產品以及研發其自己實驗室的檢測，亦即LDTs。在CLIA規則下的定期檢查確保LDTs遵循必要的程序，并且LDTs檢測只能是在執業醫生、實驗室科學家、遺傳(ychun)學家和分子病理學家等實驗室專家的指導下進行。在美國絕大部分的基因遺傳相關檢測均采用LDTs，歐洲亦如此，但歐洲LDTs只適用于政府的公共醫療機構實驗室，可免于IVD Directive監管，只能在自己實驗室使用，如要提供給其它機構實驗室，則需要走監管程序。國內針對LDTs在2000年發布的醫療器械監督管理條例（國務院令第276

12、號）中的第十條規定，醫療機構根據本單位的臨床需要，可以研制醫療器械，在執業醫師指導下在本單位使用。2014年新發布的醫療器械監督管理條例（國務院令第650號）刪去了這一條，但并沒有規定不允許自制醫療器械。近些年來，在美國一些商業實驗室開展了直接針對消費者的檢測項目（direct to consumer，DTC），主要是一些疾病風險預測(yc)的項目，均為LDTs。因為其意義的不明確和結果解讀的問題，對被檢者有可能造成不可預知的困惑或傷害。例如，美國好萊塢著名女演員茱莉2013年5月14日在美國(mi u)紐約時報發表了“My Medical Choice（我的醫療選擇）”一文，她表示自己(zj

13、)由于攜帶乳腺癌1號基因（BRCA1），已經接受預防性的雙側乳腺切除手術，以降低罹癌風險。據茱莉介紹，自己的母親曾經與癌癥作斗爭了近十年，于56歲時去世。由于媽媽給她遺傳了BRCA1基因，因此患乳腺癌和卵巢癌的幾率比較高，分別是87%和50%。因此，美國FDA試圖對LDTs進行有限的監管，2014年7月再次向美國國會提交議案，在這份提案中FDA計劃按照LDT類型分為I級低風險；II級中度風險，III級高風險，分別對應告知（reporting）、注冊（registration）、510(k)認證等監管要求。對于罕見疾病，以及有巨大的臨床需求，且安全性被證實的診斷技術，FDA把它劃為I級低風險，仍

14、然由CMS監管。但也有眾多學者反對，提出FDA是管診斷產品的，而臨床實驗室研發LDTs提供的只是一種醫學服務，并非產品。但強調LDTs在臨床應用前，應有嚴格的性能確認程序，使用中有嚴格的質量控制和使用情況監控。國內LDTs如何能有效地為臨床服務，如何進行管控是值得業界思考的一個問題。三、性能(xngnng)驗證和性能確認為保證檢驗質量，臨床實驗室在正式開展日常(rchng)檢測之前，應對其檢測試劑方法或系統進行性能驗證（verification）或性能確認（validation）。性能驗證在廣義上的概念是指通過提供客觀證據證明特定的要求得到滿足。而美國的CLIA中的性能驗證術語特指使用某特定檢

15、測試劑或系統的實驗室按照所提供的試劑盒或檢測系統說明書使用時，能復現生產廠家所宣稱的檢測性能。說明性能驗證特指針對經批準的商品試劑或檢測系統，其所要驗證的是在特定的實驗室條件（環境、人員、標準操作程序）下的檢測性能指標是否與試劑盒說明書上所標示的是一致的。因此，對各項檢測性能指標如精密度、準確度、分析敏感性等的驗證是否合格的判斷標準應以試劑盒說明書為準，如何進行性能驗證也可按試劑盒說明書中相應性能指標確立時的方法(fngf)進行，但可以適當簡化。而性能確認（validation），美國FDA和國際標準化組織（ISO）均將其定義為，通過檢查和提供客觀證據證明，對一特定預期用途（intended use）的要求始終能得到滿足。性能驗證和性能確認在美國FDA和ISO術語相似，差異在后者的“預期用途”。比如說，某實驗室自制了一個表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）1821號外顯子基因突變檢測試劑，也就是其預期用途是檢測上述基因突變，性能確認就是通過實驗所提供的客觀證據證明該試劑是否能正確的且可重復地檢測到相應基因突變。世界衛生組織（WHO）則將“性能確認”定義為，證明所使用的一個程序、過程、系統設備或方法能按預期進行工作以及取得預期結果的活動（或過程）。因此，“性能確認”可用來指在測定方法