1、第七章化學人工酶和酶的非水相催化第一節 化學人工酶人工酶(Artificial Enzyme)：根據酶的催化原理，模擬酶的生物催化功能，用有機化學和生物學的方法合成具有專一催化功能的酶的模擬物。 包括半合成酶和全合成酶。 底物結合位點 催化位點 疏水微環境 模擬酶的酶學根底酶的作用機制：過渡態理論對簡化的人工體系中識別、結合和催化的研究一、半合成酶半合成酶 將具有一定結構和功能的物質與特異的蛋白質結合，便可形成新的生物催化劑半合成酶。一、半合成酶1將具有催化活性的金屬或金屬有機物與具有特異性的蛋白質相結合，形成半合成酶。 Gray與Margalit將電子傳遞催化劑Rn(NH3)53+，與巨頭鯨

2、肌紅蛋白結合，產生半合成的無機生物酶。肌紅蛋白傳遞氧氣， Rn(NH3)53+能氧化各種有機物(如抗壞血酸)。這種人工酶的催化效率是鈣一咪唑復合物的200倍，接近天然的抗壞血酸氧化酶的活力。 2將具有特異性的物質與具有催化活力的酶相結合，形成半合成酶。 美國Schultz小組，寡聚核苷酸鏈連接到RNA酶的Cys166上。利用寡聚核苷酸鏈的堿基互補關系，顯示出對RNA鏈特定位點的水解作用。第一個不同于DNA限制性內切酶的RNA限制性內切酶。 Kaiser小組 黃素木瓜蛋白酶(FP) 木瓜蛋白酶Cys25的巰基參與蛋白質水解反響,而黃素是一組含N的三環芳香化合物，能催化許多不同的化學反響。8溴乙酰

3、黃素與此巰基結合后，喪失水解活性，FP催化效率是黃素的 1000倍，到達了天然黃素氧化復原酶的活性。二、全合成酶全合成酶不是蛋白質，而是有機化合物 通過將催化基團并入有機化合物，控制空間構象，選擇性地催化化學反響。全合成酶包括小分子有機物(大多為金屬絡合物)、抗體酶(催化抗體)、人工聚合物酶。二、全合成酶1、小分子有機物全合成酶：利用各種有機分子(如-環糊精、卟啉等)和金屬離子而制備的具有水解、氧化復原、轉氨、羥醛縮合酶等功能的全合成酶：(1)氨肽酶全合成酶：三乙撐四胺(Trien)的Co 絡合物。(2)轉氨全合成酶：Gly與Ala的西佛氏堿的Cu()絡合物。(3)ATP水解全合成酶：CoEd

4、da(H2O2)2-等。 -Benzyme人工酶能模擬-胰凝乳蛋白酶活性由環糊精制成的人工轉氨酶能催化酮酸與磷酸吡哆胺專一性地合成氨基酸。環糊精結構示意CD分子原來：在CD的兩面引入催化基團，通過柔性或剛性加冕引入疏水基團，改善CD的疏水結合和催化功能現在，橋聯環糊精和聚合環糊精，可得到雙重或多重疏水結合作用和多重識別作用a-胰凝乳蛋白酶模型簡介環糊精和催化側鏈組成全合成酶：催化側鏈含有天然酶三種基團羥基、咪唑基及羧基，且在恰當的位置。 是非蛋白質分子，比天然酶穩定二胺、多胺環糊精模擬醛縮酶功能，催化丙酮與對硝基苯甲醛縮合。橋聯環糊精催化羧酸對硝基苯酯的水解2、抗體酶Abzyme)：以抗原或半

5、抗原過渡態類似物制備的，并能催化其反響的抗體。3、人工聚合物酶 ：用分子印跡技術制備的人工酶。其原理與抗體酶相同，只是用人工聚合物代替抗體。 以對硝基酚甲基磷酸酯硝基酚乙酸酯水解反響的過渡態類似物為模板，得到的有機功能團的聚合物，可以催化硝基酚乙酸酯水解。4.肽酶： 模擬天然酶活性中心，用人工方法合成具有催化活性的多肽。 1977年人工合成一個八肽具有溶菌酶的活性。三、設計要點設計前：酶活性中心-底物復合物的結構酶的專一性及其同底物結合方式的能力反響的動力學及各中間物的知識 三、設計要點設計中：為底物提供良好的微環境疏水性應提供形成離子鍵、氫鍵的可能性，以利于結合底物催化基團必須相對于結合點盡

6、可能同底物的功能團相接近應具有足夠的水溶性，并在接近生理條件下保持其催化活性 1984年A. Zaks 和A.M Klibanov 首次發表了關于非水相介質中脂肪酶的催化行為及熱穩定性的研究報道，引起了廣泛的關注。傳統的酶學領域迅速產生一個全新的分支非水酶學。 現在非水酶學方法在多肽合成、聚合物合成、藥物合成以及立體異構體拆分等方面顯示出廣闊的應用前景。第二節 非水介質中的酶催化反響非水相介質：有機溶劑反響介質，氣相反響介質，超臨界流體反響介質。優點：1)酶在有機介質中由于水分子的減少，相對來說酶分子的構象表現出比水溶液中更具有“剛性特點。因而使通過選擇不同性質的溶劑來調控酶的某些特性成為可能

7、。例如在有機溶劑中，可以利用酶與配體的相互作用性質，誘導改變酶分子的構象，調控酶的底物專一性,、立體選擇性和手性選擇性等。(3) 由于引起酶變性的許多因素都與水的存在有關, 因此在有機介質中酶的穩定性得到顯著提高。(2) 在適當的條件下，可以改變酶促反響的熱力學平衡向有利于合成方向而不是水解方向進行。(5) 在有機介質中進行的酶促反響，可以省略產物的萃取別離過程, 提高收率，從低沸點的溶劑中別離純化產物比水中容易；酶不溶于有機介質，易于回收再利用。(4) 由于有機溶劑的存在, 水量減少，大大降低了許多需要水參與的副反響，如酸酐的水解、氰醇的消旋化和酰基轉移等。(6) 脂溶性底物和產物在有機溶劑

8、中的高度溶解性, 有利于提高底物濃度總的水平。同時由于底物和產物的高脂溶性，使它們在酶分子外表的實際濃度較低, 可以減少底物或產物對酶引起的抑制作用。(7)在有機溶劑的存在下，一般不存在微生物污染問題。(8) 由于酶不溶于有機溶劑中，所以是一個非均相反響體系。應用振蕩或攪拌改善底物及產物的交換是反響的關鍵。一、有機相酶反響具備條件 1 保證必需水含量。2 選擇適宜的酶及酶形式。3 選擇適宜的溶劑及反響體系。4 選擇最正確pH值。二、水的作用(一)必需水與低水系統含水量與酶穩定性有關，溫度升高導致酶分子發生可逆折疊，然后進行一種或幾種以下反響： (1)形成不規那么結構。 (2)通過消除使SS鍵破

9、壞。 (3)Asn和Gln脫酰胺。 (4)Asn殘基水解。酶在無水環境中不發生上述反響，表現異常穩定。 必需水(Essential Water)：維持酶催化活性所必須的最少量的水。與酶分子緊密結合的一層左右的水分子，對酶活性至關重要的。不同酶與必需水結合的緊密程度及所結合的必需水量是不同的。 把有機溶劑中酶催化反響理解為宏觀上是非水相，而微觀上是微水相反響。因此非水體系又稱低水體系。(二)必需水量對酶活性的影響 1983年，Rupley等人從溶菌酶的結論得知，一個枯燥蛋白的水合過程經過4個步驟： (1)參加的水首先與酶分子外表的帶電基團結合，到達每克蛋白質00.07g水。 (2)然后與酶分子外

10、表的極性基團結合(每克蛋白質0.070.25g水)。 (3)多出來的水再凝聚到蛋白質分子表而相互作用較弱的部位(每克蛋白質0.250.38g水)。 (4)最后，酶分子外表完全水化，被一層水分子所覆蓋(每克蛋白質0.38g水，大約300個水分子)。脂肪酶活性與水的關系加水量%(V/V)相對活力%070.2920.41002.075在反響體系中，必需水量也決定于有機溶劑。二、有機溶劑的選擇1、有機溶劑與酶活性： 溶劑主要是通過對體系中水、酶以及底物和產物的作用來間接地或直接地影響酶活性：(1)對吸附在酶分子上的水分的影響，溶劑可以奪走吸附在酶分子外表的必需水，破壞了維持酶蛋白構象的氫鍵和疏水作用，

11、降低了酶的活性和穩定性。 (2)對底物和產物的影響，有機溶劑可以直接與底物、產物分子發生反響，或者可以通過底物和產物在水相和有機相的分配，從而影響其在酶分子外表的水層中的濃度來改變酶的活性。 (3)對酶的直接影響，溶解于水層中的溶劑分子可以抑制處于水中的酶或使酶失活，酶與兩相界面的直接接觸也可導致酶的失活2選擇有機溶劑必須考慮因素(1)有機溶劑與反響的匹配性即相容性 包括反響產物與溶劑的匹配性，極性產物傾向于保存在酶附近，可能引起產物抑制或不必要的副反響發生。相容性例：對于酶促糖改性而言，使用疏水性的，與水不互溶的溶劑是不現實的，因為不溶性底物和不溶性的酶之間無相互作用，必須用親水性的溶劑如吡

12、啶或二甲基甲酰胺(2)溶劑必須對于該主反響是惰性例：酯基轉移反響涉及到醇對于酯的親核攻擊而產生另一種酯，如果溶劑也是酯，就會生成以溶劑為根底的酯，如果溶劑是醇，也會得到類似結果。(3)必須考慮的其他因素溶劑的密度、黏度、外表張力、毒性、廢物處理和本錢等溶劑因底物而宜溶劑參數lgP：即一種溶劑在辛醇/水兩相間分配系數的常用對數值，它能直接反映溶劑的疏水性。五、酶在微水體系中的催化特點1、酶分子在有機溶劑中的結構特點酶蛋白分子內氫鍵起主導作用，導致蛋白質結構剛性，酶的穩定性提高。2、酶的作用pH與離子強度有機溶劑中酶活性與酶枯燥前或吸附于載體前所在的緩沖液pH和離子強度相關。酶能“記憶原緩沖液的p

13、H，保持在原緩沖液中的構象。3、酶的底物專一性溶劑性質對酶的立體專一性的影響：在疏水性差的溶劑中，萘甲酰基進入酶的疏水性袋中比暴露在溶劑中熱力學平衡更為有利。在疏水性強的溶劑中，萘甲酰基暴露在疏水性溶劑中，而不易進入酶的疏水性袋中。4、鹽類及其他極性添加物對酶活性的影響在有機溶劑中，鹽能增加酶的催化活性。低logP值和高介電常數的極性化合物，增加酶的活性。酶在凍干前適當參加多元醇，可提高酶的活性。六 、有機介質對酶性質的影響 1、穩定性2、活性3、專一性4、反響平衡方向一穩定性熱穩定性提高儲存穩定性提高結論 在低水有機溶劑體系中，酶的穩定性與含水量密切相關；一般在低于臨界含水量范圍內，酶很穩定

14、；含水量超出臨界含水量后酶穩定性隨含水量的增加而急劇下降。二活性 1、單相共溶劑體系中，有機溶劑對酶活性影響1 有機溶劑直接作用于酶2 有些酶的活性會隨著某些有機溶劑濃度升高而增大，在某一濃度最適濃度到達最大值；假設濃度再升高，那么活性下降。2、低水有機溶劑體系中，大局部酶活性得以保存，但也有某些酶活性亦變化例：有人對吸附在不同載體上的胰凝乳蛋白酶或乙酸脫氫酶在各種水濃度下的酶活性研究說明，酶活性隨水活度大小而變化，在一定水活度下，酶活性隨載體不同而變化 3、在反向微團體系中，微團效應使某些酶活性增加超活性：但凡高于水溶液中所得酶活性值的活性稱為超活性Super-activity。認為：超活性

15、是由圍繞在酶分子外面的外表活性劑這一外殼之較大剛性所引起。三專一性某一些有機介質可能使某些酶的專一性發生變化，這是酶活性中心構象剛性增強的結果。有些在水中不能實現的反響途徑，在有機介質中卻成為主導反響。在手性藥物酮基布洛芬的酶促拆分研究中， “微環境調控方法，將一選擇性很低的商品脂肪酶(Lipase OF)改造為高度立體專一性的生物催化劑，應用于酮基布洛芬的對映體拆分。說明, 酶的選擇性并不完全由其基因序列或蛋白質的一級結構所決定，還受到所處環境條件對其高級構象的調控作用。這為化學工程師通過介質工程(微環境工程)或構象工程(而非蛋白質工程)的手法，在不改變酶之根本結構的前提下強化酶的催化功能提

16、供了科學依據，也為拓展酶對非天然底物或在非生理條件下的應用范圍奠定了科學根底。 四反響平衡方向酶合成產物有機溶劑使用濃度（%）合成收率（%）枯草桿菌蛋白酶核糖核酸酶甘油9050無色桿菌蛋白酶人胰島素DMF和乙醇3080羧肽酶牛胰核糖核酸酶甘油9050凝血酶人生長激素甘油8020嗜熱桿菌蛋白酶天冬甜味素乙酸乙酯胰凝乳蛋白酶腦啡肽乙醇或DMF七、酶形式的選擇1酶粉： 例如：有人研究a-胰凝乳蛋白酶在酒精中轉酯反響，發現催化活性隨反響體系中酶量的減少而顯著增加。 化學修飾酶疏水性修飾、反相膠束： 例如：SOD酶經糖脂修飾后變成脂溶性，它對溫度、PH、蛋白酶水解的穩定性均高于天然SOD。 固定化酶：

17、把酶吸附在不溶性載體上如硅膠、硅藻土、玻璃珠等制成固定化酶，其對抗有機介質變性的能力、反響速度、熱穩定性等都可提高。 固定化酶：有機相中固定化后載體對酶的影響 A.載體能通過分配效應劇烈地改變酶微環境中底物和產物的局部濃度。B.載體影響酶分子上的結合水 通過選擇適宜的載體可使體系中的水進行有利分配。C.通過載體與酶之間形成的多點結合作用，可穩定酶的催化活性構象。例：-胰凝乳蛋白酶與聚丙烯酰胺凝膠共價結合后，在乙醇中的穩定性明顯提高，并且對有機溶劑的抗性隨酶與載體間共價鍵數量的增加而增強。D.酶動力學影響一個酶同時催化的兩個反響的相對速度。例 在低水活度下把胰凝乳蛋白酶固定在聚酰胺載體上，水解反

18、響被抑制卻有利于醇解反響。八、酶在微水體系中的應用1、有機合成氧化光學活性物質的合成手性藥物的合成油和脂肪的精制生物柴油生物外表活性劑的合成肽的合成其他的專一性合成2、化學分析膽固醇的測定3、聚合高聚物合成，環保材料合成4、解聚5、外消旋混合物的別離 酶促反響從單一水相拓展到各種非水溶劑體系，為酶在非生理條件下的應用開辟了廣闊的空間。 華東理工大學構建的非水相酶反響器及其長期穩定運行案例，充分顯示了生物催化劑在工業化學品合成方面的顯著優勢和巨大應用潛力。例如，非水相酶促逆水解法合成糖苷的方法和結果。另外利用自行篩選研制的沙雷氏菌脂肪酶成功地在甲苯-水兩相體系中實現了心血管藥物地爾硫卓手性前體()-環氧酯的高度對映選擇性水解, 產品的光學純度高達99%以上，而且大大縮短了反響工藝路線，是一項典型的綠色化學工藝。合成藥物過程中手性的重要性 藥物、除草劑和殺蟲劑常通過和受體、酶、大分子載體等相互作用而發揮其成效。所有這類相互作用是高度立體專一性的。 抗癆藥物乙胺丁醇2,2-(乙烯二亞氨基)-二-1-丁醇二鹽酸鹽的右旋異構體，具有有效的抗癆活性，然而左旋異構體使視神經變性，導致失明。普洛帕吩-(+)-4-(二甲基氨基)-3