1、分子熒光和磷光光譜分析法講解 分子熒光: Fluorescence分子磷光: Phosphorescence第一節 基本原理一、熒光、磷光產生的機理1、熒光、磷光的產生 當物質分子吸收入射光子的能量之后，發生了價電子從較低的能級到較高能級的躍遷，這時分子被激發而處于激發態，稱為電子激發態分子。這一電子躍遷過程經歷的時間約為10-15 s。 躍遷所涉及的兩個能級間的能量差，等于所吸收光子的能量。紫外、可見光區的光子能量較高，足以引起價電子發生電子能級間的躍遷。 激發態分子不穩定，它可能通過輻射躍遷和非輻射躍遷的衰變過程而返回基態。 輻射躍遷的衰變過程伴隨著光子的發射，即產生 熒光或磷光。 非輻射

2、躍遷：振動弛豫（VR） 內轉化（ic） 系間竄越（isc） 這些衰變過程導致激發能轉化為熱能傳遞給介質。振動弛豫：分子將多余的振動能量傳遞給介質而 衰變到同一電子能級的最低振動能級 的過程。內轉化：相同多重態的兩個電子態間的非輻射躍 遷過程。系間竄越：不同多重態的兩個電子態間的非輻射 躍遷過程。例如： S1 S0 T2 T1 例如： S1 T1 T1S0S2S1S0T1吸收發射熒光發射磷光系間跨越內轉換振動弛豫能量l 2l 1l 3 外轉換l 2T2內轉換振動弛豫 假如分子被激發到S2以上的某個電子激發單重態的不同振動能級上，處于這種激發態的分子，很快（約10-12 10-14s）發生振動弛豫

3、而衰減到該電子態的最低振動能級，然后又經過內轉化及振動弛豫而衰變到S1態的最低振動能級。接著，有以下幾種衰變到基態的途徑：S1 S0 輻射躍遷 熒光S1 S0 內轉化S1 T1 系間竄越 T1 S0 輻射躍遷 磷光 T1 S0 系間竄越 內轉化速率很快（k為1011 1013s-1 ）， S2以上的激發單重態的壽命很短（ 10-1 10-13s ），因而除極少數例外，通常在發生輻射躍遷之前便發生了非輻射躍遷而衰變到S1態。所以所觀察到的熒光壽命通常是來自S1態的最低振動能級的輻射躍遷。 系間竄越是自旋禁阻的，因而其速率常數小得 多（ 102 106s-1 ）。 熒光是來自最低激發單重態的輻射躍

4、遷過程所伴隨的發光現象。發光過程的速率常數大，激發態的壽命短。 磷光是來自最低激發三重態的輻射躍遷過程所伴隨的發光現象，發光過程的速率常數小，激發態的壽命相對較長。2、熒光、磷光的壽命和量子產率熒光壽命f ：熒光分子處于S1激發態的平均壽命：熒光發射過程的速率常數：各種分子的非輻射衰變過程的速率常 數的總和。典型的 在10-8 10-10s 磷光壽命p ：磷光分子處于T1激發態的平均壽命。T1 S0 自旋禁阻的躍遷達到毫秒級：t=0 熒光強度：t=t 光強度 熒光（或磷光）強度的衰變 熒光量子產率（f）定義為熒光物質吸光后所發射的熒光的光子數與所吸收的激發光的光子數之比值。 熒光量子產率的大小

5、取決于熒光發射與非輻射躍遷過程的競爭結果。 F苯其激發態常由環外的羥基或氨基上的n電子激發轉移到環上而產生的，它們的n電子的電子云幾乎與芳環上的軌道平行，從而共享共軛電子結構。 吸電子取代基使熒光減弱 醛基、羰基、羧基、硝基例如： 苯 熒光 硝基苯 無熒光 Cl、Br、I等重原子取代基，通常導致熒光減弱、磷光增強。 雖也含有n電子，但n電子的電子云并不與芳環上的電子云共平面，其 n *的躍遷為禁阻躍遷，且 S1 T1系間竄越的概率大，故而熒光減弱。 *：自旋許可的躍遷 摩爾吸光系數大， 104 激發態壽命短 S1 T1系間竄越概率較小 4、 最低電子激發單重態的性質 n *：自旋禁阻的躍遷 摩

6、爾吸光系數小，102 激發態壽命長 S1 T1系間竄越的幾率大熒光： * n *磷光： n * 有利不含N、O、S等雜原子的芳香化合物：最低激發單重態 S1（、*） 含N、O、S等雜原子的芳香化合物：最低激發單重態 S1（n、*） 三、影響分子發光的環境因素1、溶劑的影響（1）溶劑極性的影響 熒光體的偶極與溶劑分子的偶極之間存在著 靜電作用，溶劑分子圍繞在熒光分子的周圍組成 了溶劑籠。 許多共軛芳族化合物，激發時發生了 * 躍遷，其激發態比基態具有更大的極性，隨著溶劑 極性的增大，激發態比基態能量下降得更多，結 果熒光光譜向長波長方向移動。 熒光體的基態分子與溶劑分子形成氫鍵絡合物，熒光物質的

7、吸收光譜、熒光光譜都受影響，熒光體的激發態分子與溶劑分子形成氫鍵絡合物，熒光光譜受影響。（2）熒光體與溶劑間的特殊化學作用（氫鍵） n *躍遷、某些分子內電荷轉移躍遷 涉及非鍵的孤對電子 隨溶劑形成氫鍵能力增大 熒光光譜向短波方向移動 某些芳族羰基化合物和氮雜環化合物非極性、疏質子溶劑中 激發單重態（n、*） 熒光弱或無 高極性的氫鍵溶劑中 激發單重態（ 、*） 熒光強例如: 異喹啉 在環己烷中 無熒光 發磷光 在水中 發熒光如果熒光物質是一種有機弱酸或弱堿，它們的分子及其相應的離子，可視為兩種具有不同熒光特性的型體，介質的酸堿性變化將使兩種不同型體的比例發生變化，從而對熒光光譜的形狀和強度產

8、生很大的影響。2 、介質酸堿性的影響 例如： 水楊醛 ( ) 不發熒光，強磷光 堿性溶液中 酚基解離 強熒光 濃無機酸溶液中 羰基質子化 強熒光 （ 、*） （n、*）3 、介質的溫度和黏度的影響4、有序介質的影響 表面活性劑或環糊精溶液屬于有序介質，對發光分子的發光特性有著顯著的影響。T VR ic F p黏度 VR ic F p 四溶液熒光、磷光的熄滅 熒光的熄滅廣義的包括了任何可使熒光增強度降低的作用。狹義的僅僅指那些由于熒光物質分子與溶劑分子或其他溶質分子的相互作用所引起的熒光強度降低的現象，這些會引起熒光的熄滅的物質稱為熄滅劑 。 狹義的熒光熄滅的原因是溶液中熄滅劑分子和熒光物質分子

9、之間發生相互作用而引起熒光物質分子的熒光效率降低或熒光物質激發態的壽命縮短，從而導致熒光強度的降低。 淬滅劑動態淬滅：在動態猝滅的過程中，發光物質的激發態分子通過與淬滅劑分子的碰撞作用，以能量轉移的形式或電荷轉移的機制喪失能量返回基態。淬滅劑與發光物質激發態分子發生相互作用靜態淬滅淬滅劑與發光物質基態分子發生相互作用著名的熄滅劑:鹵素離子重金屬離子氧分子硝基化合物 鹵素離子對于奎寧的熒光有顯著的熄滅作用，但對某些物質的熒光并不發生熄滅作用，這表明熄滅劑和熒光物質分子之間的相互是有選擇性的。 熒光熄滅作用在熒光分析中有著降低待測物質的熒光強度的不良作用，但另一方面，我們可以利用某一物質對某一熒光

10、物質的熄滅作用建立對該物質的熒光熄滅法檢測。該法常具有更高的選擇性。 1.碰撞熄滅 溶液中熒光物質分子M和熄滅劑Q相碰撞 而引起熒光熄滅。 比較速率MhM*(吸光) 1 M* Mh (發生熒光) k1 M* M* +Q M+Q+熱 k2 M* Q Stern-Volmer方程式 k：熄滅常數 Q：熄滅劑濃度(M) F0,F分別是熄滅劑Q不存在時及存在時的溶液的熒光強度2. 組成化合物的熄滅 某些熒光物質溶液在加入一些熄滅劑之后，溶液的熒光強度顯著降低; 隨著溫度的升高，熒光強度而增強。 上述情況可能是由于一部分熒光物質分子M與熄滅劑分子Q作用而生成了絡合物MQ，如絡合物MQ的形成是由于微弱的范

11、德華引力的作用，則所形成的絡合物并不發生熒光，且對solu的吸收并不發生任何影響。 發生熒光的物質仍為M*分子，品種并沒有改變，所以熒光分子的平均壽命也沒有改變，至于solu溫度升高熒光強度之所以增強，可能是由于溫度升高時該絡合物較不穩定，較多地分解為M和Q分子的緣故。這一點可以作為這一類型熄滅不同于碰撞熄滅的標志。 如果絡合物MQ的形成是由于強大的力，則絡合物MQ將具有它自己的吸光特性，溶液的吸收光譜也將發生改變。3. 轉入三重線級的熄滅 E C位 E 能 * G D A BCBD處于單線態的基態EGF為第一激發單線態虛線為激發三線態 當由單線態轉移至三線態時，多余的振動能在碰撞中損失掉，s

12、olu中絕大多數轉入三重線級的分子在一般溫度下是不會發光的，它們把多余的能量消耗于它們與其它分子的碰撞之中，因而引起熒光的熄滅 。 轉入三重態的分子在低溫下可由三線態重新返回到基態，在這一過程中將放出波長較長的磷光。 含溴、碘化合物、重氮、羰基、羧基及某些雜環化合物容易轉變至三線態，因而易使熒光熄滅。電子自旋方向的改變系有強烈磁場的誘導作用所引起的，在原子核附近，尤其是在Br或I這樣重的原子核附近，存在著強烈的磁場，所以含溴、碘的化合物容易使溶液熒光熄滅。 幾乎所有會發生熒光的有機化合物都會被溶解在溶液中的氧分子熄滅劑熄滅到不同的程度。 三線態的氧分子和單線態的熒光物質分子碰撞 單線態的氧分子

13、和三線態的熒光物質分子碰撞 4. 發生電子轉移反應的熄滅 某些熄滅劑分子與熒光物質分子相互作用時，發生了電子轉移反應，即氧化還原反應，即引起熒光的熄滅。 例：甲基藍熒光溶液被Fe2+離子熄滅 D + h D* D* D + h D * + Fe2+ D + Fe3+ D + H DH（半醌） 2DH D + DH2 （無色染料） 發生電子轉移反應的熄滅劑并不限于金屬離子，I，Br，CNS，S2O32等易于給出電子的陰離子對奎寧，羅丹明及熒光素鈉等有機熒光物質也會發生熄滅作用。5. 熒光物質的自熄滅 當C 1M時，常發生自熄滅現象。 自熄滅的原因是多樣的： （1）M* M 例：F熄滅 苯和蒽 （

14、2）多聚體的形成 多聚體與單體具有不同的吸收光譜，但不會發生熒光或熒光強度很弱。 消除： （1）熒光熄滅作用均隨著熄滅劑的濃度增大而加大，因此若對solu稀釋可消除或減低熒光的熄滅作用； （2）溶解氧的除去，通入氮氣。五 熒光（磷光）強度與溶液濃度的關系 A =-lgT =bc T = F ( ) F =f 若用級數展開，略去高次項，得f kC k = bf稱為熒光的量子產率，f 濃度效應1. 內濾效應2. 發光分子形成基態或激發態的聚合物3. 發光的再吸收第二節 儀器 與UV-Vis的區別： 1.檢測方向與入射方向垂直，以便使被散射的入射光的直接檢出減至最少2.兩個單色器 3.檢測池四面透明

15、 4.激發光譜 5.發射光譜 LM1SM2DR光源(1) 弧光燈和白熾燈 高壓氙燈 250800nm(2) 激光器 強度大，單色性好，靈敏度高單色器 光柵光檢測器 PMT CCD激發光譜：固定熒光的發射波長（即測定波長）而不斷改變激發光（即入射光）的波長，并記錄相應的熒光強度，所得到的熒光強度對激發波長的譜圖發射光譜：如果使激發光的波長和強度保持不變，而不斷改變熒光的測定波長（即發射波長）并記錄相應的熒光強度，所得到的熒光強度對發射波長的譜圖第三節 熒光的測定方法一、直接測定法 只要分析物本身發熒光，便可通過測定其熒光強度而測定其濃度。 工作曲線法二、間接測定法 有些分析物，或者本身不發熒光，

16、或者因熒光量子產率太低而無法進行直接測定，便只能采用間接測定的辦法。1、熒光衍生法 熒光衍生法是運用某種手段將自身不發熒光的分析物，轉變成一種發熒光的化合物，再通過測定該化合物的熒光強度，以間接測定分析物。 化學衍生法： 化學反應 電化學衍生法： 電化學反應 光化學衍生法： 光化學反應 許多無機金屬離子的測定： 與某些金屬螯合劑反應生成具有熒光的螯合物之后加以測定。 某些不發光的有機化合物： 可通過降解反應、氧化還原反應、偶聯反應、縮合反應、酶催化反應或光化學反應等辦法，使它轉化為熒光物質。例如： 維生素B1（無熒光）維生素B1+鐵氰化鉀硫胺熒（發熒光）2、熒光猝滅法 有些分析物本身不發熒光，但卻能使某種熒光試劑的熒光發生猝滅，且熒光猝滅的程度與分析物的濃度有著定量的關系，通過測定該熒光試劑熒光強度的下降程度，便可間接地測定該分析物。3