1、2022/7/18四 類藥型評價利用計算機輔助藥物設計系統得到的化合物，除了在化學上要求易于合成以外，還應該關注溶解性、代謝穩定性和安全性性質，即設計的藥物應具有優良的ADME（吸收、分布、代謝、排泄等）特性，這些性質與藥物和“類藥性”分子的要求一致。類藥性（drug-like property）代表了理想化藥物所具有的特點，是藥物所表現出來的理化性質和結構特征在體內的綜合反映(包括藥動學性質和毒性)。簡單來講就是和已知的藥物分子所具有的相似性。一般認為化合物所表現出的結構和理化性質應與體內藥動學參數具有良好的相關性，并能夠滿足該化合物口服途徑，獲得理想的吸收、分布、代謝和排泄要求。此外還應該

2、具有易合成性和市場可接受性等特點。 2022/7/18精選ppt2022/7/18類藥性的判斷方法排除法模版法直接性質預測法2022/7/18精選ppt2022/7/181、排除法所謂的排除法就是參考已知的經驗，排除那些可能導致毒性、生物利用度低下或者其它不適宜作為藥物的性質。 利平斯基規則 已知不合適官能團排除法 其它法則 2022/7/18精選ppt2022/7/18 利平斯基規則利平斯基（Lipinsk）規則，又稱Ro5規則，是一個被廣泛認知和接受的類藥性過濾方法，也有人稱其為類藥性5規則。該規則是考慮到要使設計的化合物具有較好的生物利用度，藥物分子必須能夠穿透細胞膜，因此以分子是否具有

3、良好的膜滲透性來作為過濾的條件。Ro5 規則認為，一個化合物如果違背了下述規則中的任意兩條，就很難被生物體所吸收： 分子量小于500； 氫鍵給體 （OH或NH）小于或等于5； 氫鍵受體小于10； logP小于5。 2022/7/18精選ppt2022/7/18 已知不合適官能團排除法某些具有潛在誘變性和致癌性的官能團，如在第二章談到的毒性基團，或者在代謝過程中不穩定易產生毒性的基團一般被認為不具有類藥性，而應該嚴格控制。另外，具有活性官能團的化合物，可以與蛋白質作用，在體外產生假陽性或毒性，不再具有類藥性而應該盡可能的避免。這種篩選方法不需要特殊的計算法則，只需要根據普通的醫藥化學知識和個人的

4、經驗確定。2022/7/18精選ppt2022/7/18 其它法則又很多相應的規則，如：藥物的物理性質的類藥分子通用規則 分子量在160480之間，平均為357； logP 在-0.45.6之間，平均2.52； 摩爾折射率40130之間，平均97； 原子數在2070之間，平均48； 分子中必須同時具有以下幾種官能團中一部分：苯環、雜環、脂肪胺（最好是叔胺）、羧基、酰胺、醇羥基、羧酸酯、酮基等。2022/7/18精選ppt2022/7/18基于PSA的類藥性規則 該規則考慮了分子的柔性，要得到具有大于20%40%的生物利用度，化合物分子必須滿足： PSA小于或等于140 2（或者氫鍵供體和氫鍵受

5、體數小于或等于12），該條件與極化基團滲透細胞膜的去溶劑化能有關； 可旋轉的化學鍵小于或等于10， PSA（極化表面積極化原子的范德華表面積之和） 是與膜滲透相關的另一個參數，研究表明，口服吸收的PSA上限為1401502，穿透血腦屏障的PSA不超過90 2， 2022/7/18精選ppt2022/7/18藥效團類藥性法則： 一個類藥性分子起碼有兩個以上的藥效點，但也不能多于7個； 基本藥效點包括胺、氨基化合物、醇、酮、砜、磺胺、羧酸、氨基甲酸、胍、脒、脲和酯等，并且藥效點的雜原子間應被一個以上的碳原子所分隔，否則只算做一個藥效點，同環的多個氨基只能算一個藥效點，吡咯、吲哚、噻唑等不算藥效團；

6、 具有一個以上的羧基的化合物是非類藥性分子，無環結構的化合物一般為非類藥性分子。2022/7/18精選ppt2022/7/182、模版法與排除法相反，模版法是利用已知藥物結構的有用特征對設計的化合物進行評價，有很多相應的方法，如優先結構法、人工智能分類法等。2022/7/18精選ppt2022/7/18 優先結構法所謂的優先結構指的是可以和相應受體和酶緊密結合的特征結構類型，優先結構可來源于已知藥物，也可以來自于天然產物，一般是緊密的雜環、多環體系，在指定的三維空間中可以誘導出不同的替代模式 優先結構的內涵已經擴展到藥物分子中經常發現的結構片段，目前已經有了商業化的片段庫，可以在數據庫中提取優

7、先的子結構。32個基本分子構架就包括了所有分子的50%,其中最常見的結構是六元環 2022/7/18精選ppt2022/7/18 人工智能分類法模版法雖可提供明確的指導，但并不能使涵蓋的所有分子具有類藥性。模仿認知機制的人工神經智能網絡被用于藥物識別模式，通過檢驗藥物可能的內在特性（如原子類型、LogP、分子量等）來區分藥物和非藥物（不具有類藥性）。 2022/7/18精選ppt2022/7/183、直接性質預測由于類藥性的概念非常模糊，而一個化合物能否成為一個藥物，與化合物的許多性質相關聯，這些性質中只有一部分是依賴于結構的，因此基于化學結構的類藥性預測當然也存在著這樣或那樣的問題。先導化合

8、物優化中遇到的問題和類藥性問題實際上是相同的，即減少毒性、提高溶解性，增加生物利用度、改善血腦屏障穿透能力和增加代謝穩定性等。 2022/7/18精選ppt2022/7/18 溶解性藥物作用的所有階段都與溶解性密切相關，但溶解性又是一種很復雜的現象，很難被準確的預測。溶解性與化合物的親脂性、和溶液之間形成的氫鍵數、分子內的氫鍵數、官能團的離子化程度以及晶體的特征（特別是結晶形態和能量）等因素有關。 有一種利用標準回歸統計的方法可以用于溶解度和其他物理性質的計算，這種方法基于對整體分子的物理描述，包括溶劑可及表面積、Lennard-Jones作用能、氫鍵給體和受體數目、氨基和硝基的數目等進行計算

9、。2022/7/18精選ppt2022/7/18 口服利用度即口服劑量中能到達血液循環部分的比例，它也與各種因素有關，包括藥物的溶解性、化學穩定性和代謝穩定性、膜滲透性等膜的滲透率與極性表面區域和親脂性等因素有關，現在已經有一些有效的預測膜滲透性的統計模型可以利用。2022/7/18精選ppt2022/7/18 血腦屏障穿透與膜滲透相似，血腦屏障穿透率與藥物的親脂性系數（logP）、氫鍵數目、離子化程度、分子大小以及柔性等有關有人提出一個簡單的QSAR方程來用于計算藥物在腦中和血液中的比率：log（c腦/c血）= -0.0148PSA + 0.152ClogP + 0.1392022/7/18

10、精選ppt2022/7/18 代謝穩定性至今為止，雖然有許多軟件可以進行預測代謝穩定性，但仍沒有特別可靠的方法進行預測，MetabolExpert 和META等程序可以預測化合物的代謝途徑，但是又難以說明產生這些代謝的可能性有多少。2022/7/18精選ppt2022/7/18 毒性化合物產生毒性的原因很多，包括藥物與DNA或者蛋白質作用，或干擾了酶系統等。相應的毒理學數據庫如RTECS（含10萬個以上的化合物數據）和TOXSYS（24萬個化合物數據）可以參考基于專家系統的計算也可預測化合物毒性，這些系統包含了那些具有潛在產生毒性的結構片段，如基于規則的DEREK和HazardExpert、T

11、oxAlert等以及基于系統的QSAR-TOPKAT和CASETOX等。2022/7/18精選ppt2022/7/18存在問題類藥性規則定義不確切，難以適用于所有體系。應考慮類藥性規則的使用環境，而不能不加區別的使用，如一個長時間服用的中樞神經系統藥物和一個僅需要短期使用快速奇效的靜脈注射藥物就需要使用不同的規則加以判斷。各種分類方法均沒有反映出已知藥物的特性，并妨礙新的結構類型藥物的發現；分類方法使用了已知的藥物相應的數據庫，因而所得到的結果可信度依賴于數據庫的完整性。2022/7/18精選ppt2022/7/18結論合理藥物設計-藥物設計的發展方向計算機輔助藥物設計的發展趨勢2022/7/

12、18精選ppt The Principle of Drug Design第六章六、 新藥研究中的基因技術基因技術及基因藥物的發展基因技術方法與基因有關的藥物設計2022/7/18精選ppt基因技術是一系列有關研究基因結構和功能的方法之一，是一項將生物的某個基因通過基因載體運送到另一種生物的活性細胞中，并使之無性繁殖（稱之為“克隆”）和行使正常功能（稱之為“表達”），從而創造生物新品種或新物種的遺傳學技術，描述這些方法的術語包括“DNA重組技術”、“基因工程”、“基因拼接”等。一、什么是基因技術6-1 基因技術及基因藥物的發展2022/7/18精選ppt1利用基因工程技術可以獲得天然來源難以得到

13、的生理活性物質，并可提供足量的生物活性物質以進行結構、功能、性質等方面的研究，使之成為新藥，并避免由于免疫抗原性等原因而帶來的副作用。2.利用基因工程技術可以向生物環境中引入能編碼目的蛋白質的基因，這種蛋白質可再此環境中被大量的生產。例如使某些活性蛋白、多肽基因在微生物、細胞以及動物、植物反應器中得到高效表達，使許多難以得到的生物活性物質如胰島素、干擾素等批量生產。基因技術的優點2022/7/18精選ppt3利用基因工程技術可不斷發掘和開發更多的新型生理活性物質。例如紅細胞生長素（EPO）、神經生長因子（NGF）等。4. 利用基因工程技術可以改造內源性活性物質，對蛋白質的特異位置進行修飾，可以

14、改變氨基酸的序列，在編碼基因中引入特異的突變體，從而改變其物理化學性質，提高其生物活性、減少副作用如將組織纖溶酶原激活劑tPA分子重組縮小后，半衰期明顯延長，注射一次即可溶栓。2022/7/18精選ppt5通過基因重組技術，能夠獲得新的化合物（包括自然界不存在的化合物），擴大藥物來源，這正是制藥工業引進基因工程的主要原因之一。2022/7/18精選ppt1973年,美國斯坦福大學醫學院Prof.Coben及其研究小組把大腸桿菌質粒DNA酶切后插入抗四環素基因,組成一個可在大腸桿菌種復制,并表達出具有抗四環素及大腸桿菌質粒DNA雙抗遺傳表型的重組子第一次的基因重組2022/7/18精選ppt日新

15、月異的生物技術不斷推動著這場革命，生物工程藥物將成為21世紀藥業的支柱。與生物制藥直接相關的最新領域包括；組合化學（combinatorial chemistry）、藥學基因（pharmacogenomics）、蛋白組學（proteomics）、蛋白治療（gene therapy）、功能抗原學（functional antigenics）、生物信息學（bioinformatics）、高通量篩選（high-throughput screenign）和眾所周知的基因組學（genomics，包括后基因組學）等。 基因藥物是多學科共同發展的結晶2022/7/18精選ppt一 基本知識二 基因技術的一般

16、介紹重組蛋白的表達6-2 基因技術方法2022/7/18精選ppt一、基本知識 Nucleic Acid2022/7/18精選ppt染色體上具有遺傳作用的是脫氧核糖核酸即DNA。DNA鏈由兩條堿基互補的脫氧核苷酸鏈反向平行旋轉形成雙螺旋結構。每個脫氧核苷酸由一個堿基、一個脫氧核糖及一個磷酸分子組成。堿基的不同決定了脫氧核苷酸種類的不同。DNA中的堿基種類有四種：腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）。 基因是DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質的最小功能單位。 基因是帶有遺傳性狀的DNA片段，每個基因具有自身的遺傳密碼。基因決定著蛋白質的合成，有 “一個基

17、因一個多肽鏈”的說法。基因決定蛋白質，蛋白質決定代謝作用，代謝作用決定各種性狀。 、基因的化學本質2022/7/18精選ppt1、 核酸的分類和組成核酸分為兩大類.脫氧核糖核酸（DNA）Deoxyribonucleic Acid核糖核酸（RNA）Ribonucleic Acid。核酸的分類核酸2022/7/18精選pptDNA分子含有生物物種的所有遺傳信息，分子量一般都很大。DNA為雙鏈分子，其中大多數是鏈狀結構大分子，也有少部分呈環狀結構。脫氧核糖核酸（DNA）核酸2022/7/18精選ppt核糖核酸（RNA）RNA的功能與特征RNA主要是負責DNA遺傳信息的翻譯和表達，分子量要比DNA小得

18、多。RNA為單鏈分子。RNA的類別根據RNA的功能，可以分為mRNA、tRNA和rRNA三種。核酸2022/7/18精選ppt2、核酸的結構 核酸的一級結構多聚核苷酸是由四種不同的核苷酸單元按特定的順序組合而成的線性結構聚合物，因此，它具有一定的核苷酸順序，即堿基順序。核酸的堿基順序是核酸的一級結構。DNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲的分子形式。生物界物種的多樣性即寓于DNA分子中四種核苷酸千變萬化的不同排列組合之中。而mRNA(信息RNA)的堿基順序，則直接為蛋白質的氨基酸編碼，并決定蛋白質的氨基酸順序。2022/7/18精選ppt RNA一級結構的特點RNA一級結構研究最多的是tRNA、

19、rRNA以及一些小分子的RNA。其中tRNA分子具有以下特點：分子量25000左右，大約由7090個核苷酸組成，沉降系數為4S左右。分子中含有較多的修飾成分。3-末端都具有CpCpAOH的結構。核酸2022/7/18精選pptmRNA一級結構的特點真核細胞mRNA的3-末端有一段長達200個核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，稱為 “尾結構” ，5 -末端有一個甲基化的鳥苷酸，稱為” 帽結構“ 。核酸2022/7/18精選ppt 核酸的高級結構特點 RNARNA是單鏈分子，因此，在RNA分子中，并不遵守堿基種類的數量比例關系，即分子中的嘌呤堿基總數不一定等于嘧啶堿基的總數。RNA分子中，部分區

20、域也能形成雙螺旋結構，不能形成雙螺旋的部分，則形成突環。這種結構可以形象地稱為“發夾型”結構。核酸2022/7/18精選ppttRNA的高級結構1，tRNA的二級結構tRNA的二級結構都呈” 三葉草” 形狀，在結構上具有某些共同之處，一般可將其分為五臂四環：包括氨基酸接受區、反密碼區、二氫尿嘧啶區、TC區和可變區。除了氨基酸接受區外，其余每個區均含有一個突環和一個臂。 核酸2022/7/18精選ppt(1)氨基酸接受區包含有tRNA的3-末端和5-末端， 3-末端的最后3個核苷酸殘基都是CCA，A為核苷。氨基酸可與其成酯，該區在蛋白質合成中起攜帶氨基酸的作用。(2)反密碼區與氨基酸接受區相對的

21、一般含有7個核苷酸殘基的區域，其中正中的3個核苷酸殘基稱為反密碼核酸結構2022/7/18精選ppt 二氫尿嘧啶區該區含有二氫尿嘧啶。 TC區 該區與二氫尿嘧啶區相對， 假尿嘧啶核苷胸腺嘧啶核糖核苷環(TC)由7個核苷酸組成，通過由5對堿基組成的雙螺旋區(TC臂)與tRNA的其余部分相連。除個別例外，幾乎所有tBNA在此環中都含有TC 。 可變區位于反密碼區與TC區之間，不同的tRNA該區變化較大。2022/7/18精選pptDNADNA的二級結構1953年，J. Watson和F. Crick 在前人研究工作的基礎上，根據DNA結晶的X-衍射圖譜和分子模型，提出了著名的DNA雙螺旋結構模型，

22、并對模型的生物學意義作出了科學的解釋和預測。核酸2022/7/18精選pptDNA雙螺旋結構的特點DNA分子由兩條DNA單鏈組成。DNA的雙螺旋結構是分子中兩條DNA單鏈之間基團相互識別和作用的結果。雙螺旋結構是DNA二級結構的最基本形式。核酸2022/7/18精選pptDNA雙螺旋結構的要點（1）DNA分子由兩條多聚脫氧核糖核苷酸鏈(簡稱DNA單鏈)組成。兩條鏈沿著同一根軸平行盤繞，形成右手雙螺旋結構。螺旋中的兩條鏈方向相反，即其中一條鏈的方向為53，而另一條鏈的方向為35。2022/7/18精選ppt（2）嘌呤堿和嘧啶堿基位于螺旋的內側，磷酸和脫氧核糖基位于螺旋外側。堿基環平面與螺旋軸垂直

23、，糖基環平面與堿基環平面成90角。DNA雙螺旋結構的要點2022/7/18精選ppt（3）螺旋橫截面的直徑約為2 nm，每條鏈相鄰兩個堿基平面之間的距離為3.4 nm，每10個核苷酸形成一個螺旋，其螺矩（即螺旋旋轉一圈）高度為34 nm。DNA雙螺旋結構的要點2022/7/18精選pptDNA雙螺旋的穩定性DNA雙螺旋結構在生理條件下是很穩定的。維持這種穩定性的因素包括：兩條DNA鏈之間形成的氫鍵；由于雙螺旋結構內部形成的疏水區，消除了介質中水分子對堿基之間氫鍵的影響；介質中的陽離子（如Na+、K+和Mg2+）中和了磷酸基團的負電荷，降低了DNA鏈之間的排斥力、范德華引力等。改變介質條件和環境

24、溫度，將影響雙螺旋的穩定性。2022/7/18精選ppt 核酸的三級結構在三葉草型二級結構的基礎上，突環上未配對的堿基由于整個分子的扭曲而配成對，目前已知的tRNA的三級結構均為倒L型核酸2022/7/18精選ppt核酸2022/7/18精選ppt核酸2022/7/18精選ppt基因的定義 基因是DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質的最小功能單位。基因是決定一條多肽鏈的DNA片段。分類 根據其功能把基因分為三類編碼蛋白質的基因，它具有轉錄和翻譯功能，包括編碼酶和結構蛋白的結構基因以及編碼阻遏蛋白的調節基因；只有轉錄功能而沒有翻譯功能的基因，包括tRNA基因和rRNA基因；不

25、轉錄的基因，它對基因表達起調節控制作用，包括啟動基因和操縱基因。啟動基因和操縱基因有時被統稱為控制基因。 （三）基因概念2022/7/18精選ppt基因的結構2022/7/18精選ppt2022/7/18精選ppt2022/7/18精選ppt中心法則生物的遺傳信息從 DNA傳遞給 mRNA的過程稱為轉錄。根據 mRNA鏈上的遺傳信息合成蛋 白質的過程，被稱為翻譯和 表達。1958年Crick將生物 遺傳信息的這種傳遞方式稱為中心法則。2022/7/18精選ppt轉錄過程2022/7/18精選ppt翻譯過程2022/7/18精選ppt基因的轉錄 mRNA的合成基因轉錄是以DNA為模板合成與其堿基

26、順序互補的mRNA的過程。細胞生長周期的某個階段，DNA雙螺旋解開成為轉錄模板，在RNA聚合酶催化下，合成mRNA。mRNA不能自我復制，即其本身不能作為復制模板，因此在轉錄過程中即使出現某些差錯，也不會遺傳下去。2022/7/18精選pptmRNA 是DNA的轉錄本，攜帶有合成蛋白質的全部信息。蛋白質的生物合成實際上是以mRNA作為模板進行的。2022/7/18精選ppt遺傳密碼mRNA分子中所存儲的蛋白質合成信息，是由組成它的四種堿基（A、G、C和U）以特定順序排列成三個一組的三聯體代表的，即每三個堿基代表一個氨基酸信息。這種代表遺傳信息的三聯體稱為密碼子，或三聯體密碼子。 因此 mRNA

27、 分子的堿基順序即表示了所合成蛋白質的氨基酸順序。 mRNA的每一個密碼子代表一個氨基酸。20種基本氨基酸的三聯體密碼子都已經確定。此外，還有一個密碼子是肽鏈合成起始密碼子, 三個是終止密碼子，以保證蛋白質合成能夠有序地進行。2022/7/18精選ppt遺傳密碼2022/7/18精選ppt、基因技術的特征及研究內容 基因工程的基本方法總結 基本的DNA克隆技術 PCR技術二 基因技術的一般介紹2022/7/18精選ppt、基因技術的特征及研究內容1、基因工程的定義基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遺傳工程，或重組體DNA技術。它是一項將生物的某個基因通過基因載體

28、運送到另一種生物的活性細胞中，并使之無性繁殖（稱之為克隆）和行使正常功能（稱之為表達），從而創造生物新品種或新物種的遺傳學技術。 2022/7/18精選ppt基因工程是專指用生物化學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）與載體系統（病毒、細菌質粒或噬菌體）的DNA結合成一個復制子。復制子所在的宿主生物或細胞中復制，繼而通過轉化或轉染宿主細胞、生長和篩選轉化子，無性繁殖使之成為克隆。直接利用轉化子，或者將克隆的分子自轉化子分離后再導入適當的表達體系，使重組基因在細胞內表達，產生特定的基因產物。 2022/7/18精選ppt基因工程中內外

29、源DNA插入載體分子所形成的雜合分子又稱為嵌合DNA或DNA嵌合體（DNA chimera）。構建這類重組體分子的過程，即對重組體分子的無性繁殖過程又稱為分子克隆（molecular cloning），基因克隆（gene cloning）或重組 DNA（recombinant DNA）。2022/7/18精選ppt2、基因工程的特征基因工程有兩個重要的特征：可把來自任何生物的基因轉移到與其毫無關系的其他受體細胞中，因此可以實現按照人們的愿望，改造生物的遺傳特性，創造出生物的新性狀；某一段DNA可在受體細胞內進行復制，為制備大量純化的DNA片段提供了可能，拓寬了分子生物學的研究領域。2022/7

30、/18精選ppt3、基因工程的研究內容基因工程的研究內容主要包括：從復雜的生物體基因組中采用鳥槍克隆法、人工合成法等方法分離并獲得帶有目的基因的DNA片段；在體外將含目的基因的DNA片段和具有自我復制功能、并帶有選擇性標記的載體分子進行酶切連接，獲得重組DNA分子； 利用特定的方法將重組DNA分子轉移至適當受體細胞（寄主細胞），并與其同步增殖；從大量的細胞繁殖群體中，篩選出克隆有重組DNA分子的寄主細胞；將目的基因克隆至適當的表達載體，采用特定的方法將基因導入受體細胞，使其在新的遺傳背景下獲得活性表達，從而得到需要的特定目的物質。2022/7/18精選ppt基因工程流程模式圖2022/7/18

31、精選ppt、基因技術在藥物研究中的基本方法基因技術可將已知編碼蛋白基因導入生物環境并使蛋白能夠被大量的表達，同時還可以改變蛋白特定位置上的氨基酸的位置，既可以對氨基酸個點位置、也可以使編碼蛋白基因中特定位置的突變等。具體的方法包括基因重組技術，如cDNA的克隆、PCR擴增等；重組蛋白的表達，表達宿主包括大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、轉基因動物等；新型蛋白質設計，新設計的蛋白包括天然蛋白質的變異物、不同蛋白質結構域的嵌合物等。2022/7/18精選ppt、基因技術中常用的工具酶基因工程使用的每一種工具酶都具有自身特定的功能。有的像“手術刀”（限制性核酸內切酶），可以進行DNA分子的特

32、定切割；有的像“粘合劑” （DNA連接酶），可以促進DNA分子之間的粘合和連接；有的像“砌磚機”，可以合成完整的雙鏈DNA分子。其他基因工程常用的工具酶，還有末端轉移酶、單鏈核酸酶和反轉錄酶等。 2022/7/18精選ppt限制性內切酶(Restriction Endonuclease)簡稱限制酶，能夠識別DNA大分子鏈上特定的核苷酸順序，并能在某一特定部位將DNA斷裂。這樣，目的基因便有可能完整地存在于某一DNA片段上，然后再把它們分離出來。在基因工程中，限制酶是進行DNA分子切割的特殊工具,具有“分子剪刀”或“分子手術刀”之稱。已經發現的限制酶多達20多種。每一種都有極強的特異性，可以準確

33、無誤地進行核苷酸的識別， 1、限制性核酸內切酶2022/7/18精選ppt根據限制性核酸內切酶在識別和切割序列方面的特性（切割位點）、分子量的大小、酶蛋白的結構、催化條件（反應所需的輔助因子等）和修飾活性，將限制酶分為I、 三類，然而在基因克隆中具有實用價值的只有類限制酶。類限制酶的特性 識別特點 不同的限制酶對DNA識別序列是不同的，多數限制酶能夠識別有48個堿基對組成的特定核苷酸序列，識別位點的一個共同特征是核苷酸順序通常呈雙重旋轉對稱結構，即回文序列，如EcoRI為5-GAATTC-3（較嚴格而獨特的識別序列），Hae I 為（序列中某些部位可有靈活性）， 2022/7/18精選ppt

34、切割方式 切割位點相對于雙對稱軸的位置而言，可有兩種不同的切割方式：一種是在識別序列對稱軸兩側相同的位置分別切割DNA，得到粘性末端（cohesive end，簡稱粘端）；地二種是在對稱軸處同時切割DNA雙鏈，產生具有平端（blum end）的DNA片段（2022/7/18精選ppt 同裂酶與同尾酶 雖然來源不同但是能夠識別相同的核苷酸序列，并且切割方式也相同限制酶稱之為同裂酶；將那些雖然來源不同，識別序列和切割方式都不同、但切割后可產生相似的粘性末端的限制酶稱為同尾酶。 末端的連接 同一種酶或者不同的酶經梅切后產生的匹配粘端可在連接酶作用下直接進行連接，這是DNA重組最常用的方法。雖然平度也

35、可以直接連接，但是效率較低。此外不匹配粘端在經過一定的修飾后，也可以進行連接。 影響限制酶活性的因素 影響限制酶的活性的因素很多，包括DNA的純度、鉤型、甲基化程度以及緩沖溶液的選擇、反應溫度（多數最佳溫度為37，也有些不是）、酶的活性、用量、反應速率（酶切時間）等。2022/7/18精選ppt2、DNA連接酶能催化兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵,它要求一條DNA的3末端有一條游離羥基,并且在另一條DNA鏈的5末端有一個有一個磷酸基團。并且它只能連接雙螺旋的DNA分子，而不能連接單鏈的或者環化的單鏈DNA分子。3、其它的酶 除上述的酶以外，在基因工程中還經常用到能夠以DNA或者RNA為模版，在

36、體外合成DNA 的DNA聚合酶。比較重要的包括大腸桿菌DNA聚合酶I、klenow酶、T噬菌體DNA聚合酶等；DNA聚合酶、測序酶、逆轉錄酶、末端轉移酶、核酸修飾酶等。2022/7/18精選ppt生物具有很強的排他性，目的基因很難進入不同種屬的細胞中，即使能夠進入細胞中，葉不能進行復制和繁殖，它必須與具有自我復制能力的DNA共價結合后才能被復制，這種具有在細胞內進行自我復制的DNA分子就是外源基因的運載體。在基因技術中，基因運載體（vector）的設計與應用是一個重要環節。運載體 2022/7/18精選ppt1、運載體的類型 運載基因的載體作媒介物是必要的經常使用的載體，目前用于基因制藥的基因

37、運載體主要包括： 質粒環狀雙鏈小型 DNA 分子，種類甚多，有的可在細菌細胞內獨立復制，有的亦可用于動、植物細胞。例如：根瘤土壤桿菌所攜帶的 Ti 質粒常用作植物細胞基因工程的載體。人工改造的質粒常用的有pBR322天然質粒，派生質粒pmB1，psC101等； 噬菌體常用的是噬菌體，經構建后，常用于細菌細胞。此外還有Mu噬菌體載體等； 病毒例如猿猴空泡病毒 SV40 常用作動物細胞基因工程的載體； 粘粒（cosmid，裝配性質粒），由質粒和Mu噬菌體的cos位點或膜等構建而成的一種大容量克隆載體等。不同的載體，分子量大小、結構和用途上存在著較大的差異2022/7/18精選ppt2、作為運載體的

38、條件用于基因克隆載體的理想質粒應能夠滿足： 具有復制起始點，即具有復制子功能，且復制起始區中沒有所需的限制酶切位點，并可維持使每個細胞含有一定的質粒拷貝數，一般，一個質粒只含有一個復制起始點，構成一個獨立的復制子。 具有兩個易被檢測的選擇形標記，一個理想的質粒克隆載體應具有兩種抗生素抗性基因，以便為寄主細胞提供易于檢測的選擇形標記。 具有多種限制酶的單一識別位點，適用于各種限制酶產生的DNA片段的插入，以滿足基因克隆的需要，在插入適當大小的外源DNA片段后，應該不影響質粒DNA的復制功能。 應具有盡可能小的分子量，以利于分離純化等條件 2022/7/18精選ppt3、載體的共性能在受體細胞內進

39、行獨立和穩定的DNA自我復制。在其DNA插人外源基因后，仍然保持穩定的復制狀態和遺傳特性； 易于從宿主細胞中分離，并進行純化；在其DNA序列中，具有適當的限制性內切酶位點。這些位點位于DNA復制的非必需區內，可在這些位點上插人外源DNA，但不影響載體自身DNA的復制；2022/7/18精選ppt基因工程的原料就是目的基因。所謂目的基因，是指已被或欲被分離、改造、擴增和表達的特定基因或DNA片段，能編碼某一產物或某一性狀。目前獲取目的基因的方法主要有三種：反向轉錄法從細胞基因組直接分離法人工合成法。 、目的基因的獲取 2022/7/18精選ppt（1）反向轉錄法：主要用于分子量較大而又不知其序列

40、的基因.以目的基因的mRNA為模板，借助反轉錄酶合成堿基互補的DNA片段，即cDNA，再在DNA聚合酶的催化下合成雙鏈cDNA，亦即目的基因的雙鏈DNA。 2022/7/18精選ppt（2）從細胞基因組中直接分離：包括兩個主要步驟： 基因文庫組建提取細胞的整體DNA，用內切酶或其它方法將完整的雙鏈DNA分子隨機切割成適當長度的片段，得到的DNA片段群的某一片段上可能剛好有所需要的目的基因；然后把這些片段連接到合適的基因載體上，引入受體細胞中進行分子克隆，即進行目的基因的增殖。測定所有含有重組DNA的克隆的個數，插入的染色體DNA片段的長度，加以統計處理，計算出克隆里包含的某物種染色體DNA遺傳

41、信息量的概率。如果庫內所有的重組DNA克隆上的染色體 DNA已經代表了這個物種遺傳信息量的 95以上，那么這個基因文庫就建成了。 2022/7/18精選ppt 檢索挑選含有特定目的基因的單一受體細胞。 利用某種檢測方法 根據重組克隆株明顯的表型變化，通過直接觀察挑選 利用核酸探針，直接檢測細胞內的目的基因。核酸探針是用放射性同位素或其他標記物標記的DNA片段，具有非常特異的序列，能與互補鏈結合，因此用它可以進行特定基因的檢測。 用鳥槍法分離目的基因，具有簡單、方便和經濟等優點。許多病毒和原核生物、一些真核生物的基因，都用這種方法獲得了成功的分離。 2022/7/18精選ppt（3）人工合成：

42、依照某一蛋白質的氨基酸序列，即可按密碼子推算出其基因的核苷酸序列，隨后應用化學合成法，就可在短時間內合成目的基因2022/7/18精選ppt（1）獲取目的基因 即用各種不同的方法取得人所需要的基因，也就是某些DNA片段。那里面含有一種或幾種遺傳信息的全套遺傳密碼。獲取目的基因是基因工程操作的關鍵。（2）獲取基因載體 用人工方法，取得目的基因的適宜的載體，即質粒或病毒。載體一般帶有必要的標志基因，以便進行檢測。 基因工程的基本方法總結2022/7/18精選ppt (3)重組DNA 即用人工方法，讓目的基因與運載體相結合，首先要用限制性內切酶和其他一些酶類，切割或修飾載體DNA和目的基因，然后用連

43、接酶將兩者連接起來，使目的基因插入載體內，形成重組DNA分子。這些工作都在生物體外進行，所以基因工程操作又叫體外DNA重組。（4）把重組DNA導入受體細胞進行擴增 即用人工方法，讓攜帶著目的基因的運載體進入新的生物細胞里，讓其增殖，由此形成重組DNA的無性生殖系（即克隆）。（5）篩選與培育 即基因表達產物的鑒定、收集和加工等一系列復雜過程的綜合。 2022/7/18精選ppt基因工程操作流程圖 2022/7/18精選ppt 其他相關技術1、PCR技術多聚酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)是一種依賴于特異DNA序列的體外酶促擴增技術在試管中有DNA模版、引物

44、和含有四種不同堿基的脫氧核糖核苷酸的合適緩沖液中，DNA聚合酶催化DNA合成的往復循環，體系中含有短的DNA引物和幾種脫氧核苷酸混合物，其中一條引物與cDNA未尾結合另一引物與cDNA的互補鏈另一端結合，反應的結果使模版DNA被大量的擴增，反應往返循環下去就使靶序列大大擴增，理論上每循環一次，就使產物在前一循環的基礎上翻一倍，依次下去，經過2530個循環后，最初的靶序列就可擴增105109倍。 2022/7/18精選ppt2、生物芯片技術.生物芯片是近年來在生命科學領域中迅速發展起來的一項高新技術。主要是指通過微加工技術和微電子技術在固格體芯片表面構建的微型生物化學分析系統，以實現對細胞、蛋白

45、質、DNA 以及其他生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。2022/7/18精選ppt6-3 與基因有關的藥物設計一、核酸的作用基礎二、以核酸為靶點的藥物設計三、基因突變、基因重組與藥物設計2022/7/18精選ppt一、核酸的作用基礎基因的研究已經深入到許多領域，但研究的基礎卻可以用一個模型、一個法則和四個概念來簡述：一個模型：1953年由Watson和Crick提出的DNA的雙螺旋模型，基因研究的結構基礎；一個法則：基因表達的中心法則指的是生物的遺傳信息從 DNA傳遞給mRNA的過程稱為轉錄。根據mRNA鏈上的遺傳信息合成蛋白質的過程，被稱為翻譯和表達。四個概念：復制（replicatio

46、n）、轉錄（transcription）、翻譯(translation)和密碼子(codon) 2022/7/18精選ppt中心法則DNA復制與生物遺傳信息的保持在復制開始階段，DNA的雙螺旋拆分成兩條單鏈。以DNA單鏈為模板，按照堿基互補配對的原則, 在DNA聚合酶催化下，合成與模板DNA完全互補的新鏈，并形成一個新的DNA分子。通過DNA復制形成的新DNA分子, 與原來的DNA分子完全相同。 經過一個 復制周期后，子代DNA分子的兩條鏈中，一條來自親代DNA分子，另一條是新合成的，所以又稱為半保留復制。2022/7/18精選ppt1、DNA的復制與生物遺傳信息的保持DNA復制的要點是：1）

47、在復制開始階段，DNA的雙螺旋拆分成兩條單鏈。2022/7/18精選ppt2）以DNA單鏈為模板，按照堿基互補配對的原則, 在DNA聚合酶催化下，合成與模板DNA完全互補的新鏈，并形成一個新的DNA分子。2022/7/18精選ppt3) 通過DNA復制形成的新DNA分子, 與原來的DNA分子完全相同。 經過一個 復制周期后，子代DNA分子的兩條鏈中，一條來自親代DNA分子，另一條是新合成的，所以又稱為半保留復制。2022/7/18精選pptDNA復制過程2022/7/18精選ppt2、RNA與生物遺傳信息的表達 首先，DNA通過轉錄作用，將其所攜帶的遺傳信息（基因）傳遞給 mRNA, 在三種

48、RNA（mRNA、tRNA和rRNA）的共同作用下，完成蛋白質的合成。2022/7/18精選pptRNA與生物遺傳信息的表達首先，DNA通過轉錄作用，將其所攜帶的遺傳信息（基因）傳遞給 mRNA, 在三種 RNA（mRNA、tRNA和rRNA）的共同作用下，完成蛋白質的合成。2022/7/18精選ppt二、以核酸為靶點的藥物設計研究表明，中心法則不僅適用于正常的基因的復制、轉錄和翻譯等，某些疾病的產生也遵循中心法則。因此，藥物的設計既可以以蛋白質為靶點，同樣也可以以核酸為靶點。以核酸為靶點的藥物研究主要從下面兩個方面進行的： 阻斷疾病基因的表達 基因表達調控理論的發展，腫瘤基因的表達也遵循中心

49、法則。在復制、轉錄、翻譯等環節中對腫瘤、病毒等基因的表達進行阻斷是可能的。 調整或關閉導致疾病產生的酶和受體的合成 按照中心法則，所有的蛋白酶、受體的合成都受制于DNA、RNA的編碼和組織。以核酸為靶點的藥物設計可以通過抑制有害蛋白的合成而將疾病阻斷在早期階段。是關閉或調整某些不正常酶或受體合成的有效途徑。在藥物設計中對核酸的分子識別非常重要。2022/7/18精選ppt目前，以核酸為靶點的藥物設計主要集中在反義核酸（anti-sense nucleic acid）酶性核酸(核酶，ribozyme)的設計小分子與核酸的相互作用其它 2022/7/18精選ppt、反義核酸技術反義核酸（包括asR

50、NA和asDNA）是以選擇性抑制特定基因為目的，根據堿基配對原則、核酸雜交原理等設計的一類新的核酸。反義核酸技術主要包括反義RNA （asRNA）和反義DNA（asDNA）等兩種類型，反義核酸可用化學方法合成，也可以利用載體來攜帶編碼的反義RNA，再將表達載體導入細胞內。該技術可以根據已知序列基因設計出特異性的干擾其表達的藥物，在抗病毒和抗腫瘤藥物研究方面具有重要的意義。 2022/7/18精選ppt其中asRNA是能與靶分子mRNA序列互補的RNA片斷，通過堿基對間氫鍵的作用與靶mRNA形成雙鏈復合物而影響基因的轉錄、翻譯和加工過程，從而調控基因的表達。從作用機制來看，asRNA屬于負調控機

51、制，可在生物體內進行多層次的控制，如抑制質粒的復制、調節細菌內質粒的拷貝數、在轉錄和翻譯水平上調控基因的表達， 2022/7/18精選pptasDNA是一段人工合成的能與特定基因某一區域互補的正常或經過修飾的寡聚脫氧核苷酸（oligo deoxy nucleotide， ODN)或其化學修飾物，長度一般在20個堿基左右，能夠封閉或抑制該基因的表達。2022/7/18精選ppt核酸的雜交熱變性的DNA單鏈，在復性時并不一定與同源DNA互補鏈形成雙螺旋結構，它也可以與在某些區域有互補序列的異源DNA單鏈形成雙螺旋結構。這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。DNA單鏈與互補的RNA鏈之間也可以發生雜交

52、。核酸的雜交在分子生物學和遺傳學的研究中具有重要意義。2022/7/18精選ppt核酸的雜交2022/7/18精選ppt反義核酸的研究對于發展基因水平治療藥物，具有高度特異性（通過特異的堿基互補配對作用于靶點），高效性（直接阻止靶基因的轉錄和翻譯），最優化的藥物設計（針對靶基因的序列進行理性化的設計），低毒、安全（易被降解清除），合成相對較容易等一系列的優點。對于針對靶點進行高特異性、強選擇性藥物設計具有重要的指導意義。2022/7/18精選ppt、酶性核酸（核酶） 1982年Cech T等首先發現具有催化作用的RNA，并于1989年與Altman（1984年發現另一個核酶）獲得諾貝爾獎。因此

53、就把這種具有核酸結構但可以發揮酶的功效，既能儲存和轉運遺傳信息，又能發揮生物催化功能的RNA分子，稱為酶性核酸（簡稱核酶，Ribozyme）。2022/7/18精選ppt天然核酶的分類 根據催化反應類型剪切性核酶錘頭型核酶發夾型核酶丁型肝炎病毒核酶（斧頭型）PNaseP1340bp50bp60bp290400bp自體剪切自體剪切自體剪切、自體催化異體剪接、異體催化剪接型核酶I型內含子II型內含子2001000bp1000bp自體剪接、自體催化自體剪接2022/7/18精選ppt核酶具有的特性： . 可以通過識別特定位點而抑制目標基因的表達，抑制效率高，專一性強。. 免疫源性低，很少引起免疫反應

54、。. 針對錘頭核酶而言，催化結構域小，既可作為轉基因表達產物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在體內轉運，導致其在醫學、生物化學等方面的得到廣泛的重視。2022/7/18精選ppt在醫學、農學等方面的應用已引起人們的重視，在病毒性肝炎、HIV病毒、腫瘤等方面已有了長足的進展。 1998年，美國加利福尼亞大學Wong-Staal等利用發夾核酶抑制HIV-基因表達，并率先進入臨床期。核酶能在特定位點準確有效地識別和切割腫瘤細胞的mRNA，抑制腫瘤基因的表達，達到治療腫瘤的目的 2022/7/18精選ppt、作用于核酸的小分子藥物小藥物分子對包括核酸在內的生物大分子的選擇性作用與其對生物靶分子的識

55、別密切相關，這種識別作用不僅包括對于生物靶分子的整體識別，也包括對于對生物靶分子某一特定部位特定結構的識別（包括對一級結構、二級結構及相應高級結構的識別）。識別過程包括選擇過程和鍵合過程，互補性規則是關鍵空間結構的互補、電性的互補以及能量的互補等，空間結構的互補包括靜態的、動態的和誘導契合過程，即構象的重組織。電性特征的互補是指氫鍵的形成、靜電作用、鍵的堆積及疏水作用中鍵合位點上電荷分布的最佳匹配等。2022/7/18精選ppt為了達到較好的效果，識別雙方應盡可能滿足相應的條件：靶分子的識別位點附近具有足夠的空間，以增加識別雙方的接觸面積，從而產生更多的非鍵和有鍵相互作用。生物大分子功能（如基

56、因的轉錄、表達、調控等）的發揮取決于依賴于非鍵作用而產生的空間構象，為此識別雙方應該盡可能的滿足空間互補和電性互補等必需條件。生物大分子結構的穩定性需要剛性的分子結構，而識別過程中構象的轉換，變構過程、調控、協同作用都需要一定的柔性。柔性是分子動態性質的表現，有柔性才有大分子的構象重組，才會有大分子和小分子的完美結合，因此分子識別要考慮剛性與柔性的平衡，兼顧動態和靜態的性質，。2022/7/18精選ppt1、小分子藥物與DNA的識別與作用方式小分子藥物與DNA結合常常誘發許多生物效應，這種結合包括共價結合和非鍵結合。共價結合包括與親核（或親電）試劑作用，DNA的烷基化、DNA的鏈內交聯、鏈間交

57、聯等；非鍵結合包括外部靜電作用、嵌插結合、溝區（大溝區、小溝區）結合等三種2022/7/18精選ppt 共價結合 早期的抗癌藥物僅具有簡單的DNA烷基化功能，如氮芥類（nitrogen mustards），亞硝基脲類（nitrosoureas）等，選擇性較差，毒副作用較大。某些具有抗腫瘤作用的天然化合物（抗生素類）先與DNA形成非共價鍵復合物，然后再與之共價結合。 2022/7/18精選ppt金屬配合物多數是外源性物質，進入人體內后, 占據或競爭生物配體, 當其占據必需金屬的結合部位時, 會引起必需金屬平衡失調; 當與關鍵性生物分子如DNA結合時變會引起某一方面的異常而產生毒性。當有毒物質接觸

58、異常細胞, 從而使異常細胞死亡或受到抑制, 阻止它繁殖下去, 則細胞毒性便轉化為治療作用。用細胞毒性物質治療腫瘤、病毒感染, 牛皮癬等病的指導思想就是 以毒攻毒，殺傷異常細胞 2022/7/18精選ppt2022/7/18精選ppt 非共價結合 外部靜電作用 核酸可被認為是高度帶電的聚合電解質，其陰離子磷酸根部分對于DNA的構象和反應具有明顯的影響。這種帶電荷的高聚物的構象需要小分子沿著螺旋外部產生的靜電相互作用的協同作用才能穩定存在這種作用是非特異性的。2022/7/18精選ppt 溝區結合由于DNA的螺旋結構產生的大小溝區在電勢能、氫鍵特征、立體效應、水合作用等方面都有很大的不同，小溝區是

59、AT富集區，大溝區是GC富集區。一般蛋白質和DNA的特異性結合都是發生在DNA的大溝區。而GC富集的大溝區比較分散，藥物小分子結合時特異性較差，因此藥物一般是在小溝區作用，特別是含有呋喃環、吡咯或苯環等芳香雜環結構的小分子藥物更是如此。芳香環間以旋轉自由的鍵連接，可產生相應的構象以配合小溝區的螺旋曲線，取代小溝中的水分子并可與雙螺旋鏈中溝區的堿基對邊沿通過范德華力相結合。 2022/7/18精選ppt藥物小分子通過與胸腺嘧啶堿基C2上的羰基氧或腺嘌呤堿基N3位上的N形成氫鍵而結合，同時AT小溝區負的靜電勢大于GC 富集區，有利于與藥物結合。因此藥物小分子選擇性的作用于DNA雙鏈的AT豐富區域，

60、通過氫鍵及范德華力作用，非嵌入性作用于DNA，阻止DNA的模版復制，從而起到抗病毒、抗腫瘤作用2022/7/18精選pptDNA的大溝與小溝小溝區大溝區2022/7/18精選pptDNA是結構上最有特征的生物聚合體靶點，一些新藥具有選擇性識別確定核苷序列的能力，在特定基因水平上發揮抗癌活性，抗病毒藥物紡錘霉素（netropsin）屬于DNA小溝結合配基，與DNA雙螺旋的AATT中心（小溝區）結合，取代了該區中寡聚核苷酸水合骨架部分，netropsin在構象上適合DNA小溝的螺旋形狀，具序列選擇性，又稱為序列讀碼分子。與DNA小溝結合后，會損傷DNA并使細胞死亡 2022/7/18精選ppt 嵌