1、 HYPERLINK /s?wd=%E5%9F%BA%E5%9B%A0%E6%95%B2%E9%99%A4&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 基因(jyn)敲除：是通過一定的途徑(tjng)使機(jī)體特定的 HYPERLINK /s?wd=%E5%9F%BA%E5%9B%A0%E5%A4%B1%E6%B4%BB&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 基因(jyn)失活或缺失的技術(shù)。通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA HYPERLINK /s?wd=%E5%90%8C%E

2、6%BA%90%E9%87%8D%E7%BB%84&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 同源重組原理，用設(shè)計的同源片段替代靶 HYPERLINK /s?wd=%E5%9F%BA%E5%9B%A0%E7%89%87%E6%AE%B5&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 基因片段，從而達(dá)到基因敲除的目的。隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，除了 HYPERLINK /s?wd=%E5%90%8C%E6%BA%90%E9%87%8D%E7%BB%84&hl_tag=textlink&t

3、n=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 同源重組外，新的原理和技術(shù)也逐漸被應(yīng)用，比較成功的有基因的 HYPERLINK /s?wd=%E6%8F%92%E5%85%A5%E7%AA%81%E5%8F%98&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 插入突變和iRNA，它們同樣可以達(dá)到基因敲除的目的。 HYPERLINK /s?wd=RNA%E5%B9%B2%E6%89%B0&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank RNA干擾是與 HYPERLINK /

4、s?wd=%E9%9D%B6%E5%9F%BA%E5%9B%A0&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 靶基因同源的雙鏈RNA誘導(dǎo)的特異 HYPERLINK /s?wd=%E8%BD%AC%E5%BD%95%E5%90%8E%E5%9F%BA%E5%9B%A0%E6%B2%89%E9%BB%98&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。其作用機(jī)制是雙鏈RNA被特異的 HYPERLINK /s?wd=%E6%A0%B8%E9%85%B8%E9%85%B6&

5、hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 核酸酶降解，產(chǎn)生干擾小RNA(siRNA)，這些siRNA與同源的靶RNA互補(bǔ)結(jié)合，特異性酶降解靶RNA，從而抑制、下調(diào) HYPERLINK /s?wd=%E5%9F%BA%E5%9B%A0%E8%A1%A8%E8%BE%BE&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 基因表達(dá)。已經(jīng)發(fā)展成為 HYPERLINK /s?wd=%E5%9F%BA%E5%9B%A0%E6%B2%BB%E7%96%97&hl_tag=textlink&tn=SE

6、_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 基因治療、 HYPERLINK /s?wd=%E5%9F%BA%E5%9B%A0%E7%BB%93%E6%9E%84&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 基因結(jié)構(gòu)功能研究的快速而有效的方法。RNA干擾技術(shù)的原理和應(yīng)用馬鵬鵬 薛社普 韓代書(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞 HYPERLINK t _blank 生物學(xué)系, 北京100005)RNAi是由雙鏈RNA 所引起(ynq)的序列特異性基因沉默。RNAi 首先(shuxin)由Fire 等

7、發(fā)現(xiàn)(fxin)于秀麗隱桿線蟲(C. elegans) 中, 他們發(fā)現(xiàn)將dsRNA 注入線蟲體內(nèi)后可抑制序列同源基因的表達(dá), 并證實這種抑制主要作用于轉(zhuǎn)錄之后, 所以又稱RNAi 為轉(zhuǎn)錄后基因沉默( postt ranscriptional gene silencing ,PTGS) 。隨后人們陸續(xù)在果蠅(Drosophila) 、錐蟲( Trypanosomes) 、渦蟲( Planaria) 、斑馬魚( Zebrafish) 、擬南芥(Arabidopsis thaliana) 、大小鼠和人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了RNAi 現(xiàn)象, 遺傳學(xué)研究表明RNAi 是真核 HYPERLINK t _blank 生

8、物中一種普遍存在且非常保守的機(jī)制, 與真核細(xì)胞中許多重要生物學(xué)過程密切相通過對RNAi 現(xiàn)象的遺傳學(xué)與生物化學(xué)研究,其作用機(jī)制已日漸清晰(見圖1) 。Zamore 等利用果蠅胚胎提取物建立的體外系統(tǒng), 證實RNAi 是一個依賴ATP 的過程, 在此過程中, dsRNA (外源的或體內(nèi)產(chǎn)生的) 首先被降解為具52單磷酸、長2123bp 的小分子雙鏈RNA , 這種RNA 分子稱為小干擾RNA , siRNA 通過堿基互補(bǔ)配對識別具同源序列的mRNA , 并介導(dǎo)其降解。研究表明在生物體中siRNA 具相似的結(jié)構(gòu)特征: 為長約2123bp 的雙鏈RNA , 具5單磷酸和3羥基末端, 互補(bǔ)雙鏈的3端均

9、有一個23nt 的單鏈突出。在RNAi 過程中一種稱為Dicer 的核酸酶負(fù)責(zé)將dsRNA 轉(zhuǎn)化為siRNA , 它屬于RNase 家族,具有兩個催化結(jié)構(gòu)域、一個解旋酶( helicase) 結(jié)構(gòu)域和一個PAZ ( Piwi/ Argonaute/ Zwille ) 結(jié)構(gòu)域, Dicer 在催化過程中以二聚體的形式出現(xiàn), 其催化結(jié)構(gòu)域在dsRNA 上反平行排列, 形成四個活性位點, 但只有兩側(cè)的兩個位點有內(nèi)切核酸酶活性, 這兩個位點在相距約22bp 的距離切斷dsRNA , 各種生物體內(nèi)Dicer 結(jié)構(gòu)略有不同, 致使siRNA 長度存在微小差別。siRNA 形成之后, 與一系列特異性蛋白結(jié)合

10、形成siRNA 誘導(dǎo)干擾復(fù)合體( siRNA induced interference complex , RISC) , 此復(fù)合物通過堿基互補(bǔ)配對識別靶mRNA 并使其降解, 從而導(dǎo)致特定基因沉默。在RISC 中, 起靶序列識別作用的是siRNA的反義鏈 , Zamore 等發(fā)現(xiàn)在RNAi 過程中,首先產(chǎn)生的是RISC 無活性前體, 分子量250kD ,當(dāng)加入ATP 后可形成100kD 的活性復(fù)合體。由無活性前體向活性酶復(fù)合物的轉(zhuǎn)換類似蛋白酶原的激要求結(jié)合于其上的siRNA 雙鏈的解開。在ATP 存在時, 依賴于ATP 的解旋酶解開siRNA 的雙鏈并將其正義鏈與靶mRNA 置換, mRNA

11、 取代正義鏈與反義鏈互補(bǔ), 然后由活化的RISC 在互補(bǔ)區(qū)的中間, 距離siRNA 反義鏈3末端約12bp 處切斷靶mRNA 序列。RNAi 效應(yīng)具有兩個明顯的特征, 特異性和高效性。干擾的高效性提示在機(jī)制中存在信號放大的步驟。Fire 等早在1998 年便發(fā)現(xiàn)少量的dsRNA就能夠?qū)е戮€蟲大量的靶mRNA 降解, 但單憑少量dsRNA 被Dicer 降解為幾十個siRNA 并不能解釋這種高效性。許多研究顯示RNAi 過程中有新的dsRNA 分子的合成, 當(dāng)siRNA 反義鏈識別并結(jié)合靶mRNA 后, siRNA 反義鏈可作為引物, 以靶mRNA 為模板在依賴于RNA 的RNA 聚合酶(RNA2dependent RNA polymerase , RdRP) 催化下合成新的dsRNA , 然后由Dicer 切割產(chǎn)生新的siRNA , 新siRNA 再去識別新一組mRNA , 又產(chǎn)生新的siRNA , 經(jīng)過若干次合成切割循環(huán), 沉默信號就會不斷放大(圖1) 。正是這種稱為靶序列指導(dǎo)的擴(kuò)增( target2directed amplification) 機(jī)制賦予了RNAi 的高效性和持久性。四大基因沉默技術(shù)(jsh)是什么？ HYPERLINK /s?wd=%E5%9F%BA%E5%9B%A0%E6%95%B2%E9%99%A4&hl_tag=textli