1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。folin酚法測定蛋白質(zhì)含量-生物化學(xué)實驗報告姓名：學(xué)號：專業(yè)年級：組別：第一實驗室生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗教學(xué)中心一、實驗室規(guī)則1實驗前應(yīng)認(rèn)真預(yù)習(xí)實驗指導(dǎo)，明確實驗?zāi)康暮鸵?，寫出預(yù)實驗報告。2進入實驗室必須穿白大衣。嚴(yán)格遵守實驗課紀(jì)律，不得無故遲到或早退。不得高聲說話。嚴(yán)禁拿實驗器具開玩笑。實驗室內(nèi)禁止吸煙、用餐。3嚴(yán)格按操作規(guī)程進行實驗。實驗過程中自己不能解決或決定的問題，切勿盲目處理，應(yīng)及時請教指導(dǎo)老師。4嚴(yán)格按操作規(guī)程使用儀器，凡不熟悉操作方法的儀器不得隨意動用，對貴重的精密儀器必須先熟知使用

2、方法，才能開始使用；儀器發(fā)生故障，應(yīng)立即關(guān)閉電源并報告老師，不得擅自拆修。5取用試劑時必須“隨開隨蓋”，“蓋隨瓶走”，即用畢立即蓋好放回原處，切忌“張冠李戴”，避免污染。6愛護公物，節(jié)約水、電、試劑，遵守?fù)p壞儀器報告、登記、賠償制度。7注意水、電、試劑的使用安全。使用易燃易爆物品時應(yīng)遠(yuǎn)離火源。用試管加熱時，管口不準(zhǔn)對人。嚴(yán)防強酸強堿及有毒物質(zhì)吸入口內(nèi)或濺到別人身上。任何時候不得將強酸、強堿、高溫、有毒物質(zhì)拋灑在實驗臺上。8廢紙及其它固體廢物嚴(yán)禁倒入水槽，應(yīng)倒到垃圾桶內(nèi)。廢棄液體如為強酸強堿，必須事先用水稀釋，方可倒入水槽內(nèi)，并放水沖走。9以實事求是的科學(xué)態(tài)度如實記錄實驗結(jié)果，仔細(xì)分析，做出客觀

3、結(jié)論。實驗失敗，須認(rèn)真查找原因，而不能任意涂改實驗結(jié)果。實驗完畢，認(rèn)真書寫實驗報告，按時上交。10實驗完畢，個人應(yīng)將試劑、儀器器材擺放整齊，用過的玻璃器皿應(yīng)刷洗干凈歸置好，方可離開實驗室。值日生則要認(rèn)真負(fù)責(zé)整個實驗室的清潔和整理，保持實驗整潔衛(wèi)生。離開實驗室前檢查電源、水源和門窗的安全等，并嚴(yán)格執(zhí)行值日生登記制度。實驗名稱(TitleofExperimetn)FORMTEXTFolin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量實驗日期(DateofExperiment)實驗地點(LabNo.)合作者(Partner)指導(dǎo)老師(Instructor)總分(TotalScore)教師簽名(Signature)批改日

4、期(Date)【實驗報告第一部分（預(yù)習(xí)報告內(nèi)容）：=1*GB3實驗原理、=2*GB3實驗材料（包括實驗樣品、主要試劑、主要儀器與器材）、=3*GB3實驗步驟（包括實驗流程、操作步驟和注意事項）；評分（滿分30分）：】一、實驗原理1921年，F(xiàn)olin首創(chuàng)Folin-酚試劑法，利用蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基（酚基）還原酚試劑（磷鎢酸-磷鉬酸）起藍(lán)色反應(yīng)；1951年，Lowry對此法進行了改進，先于標(biāo)本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應(yīng)，提高了靈敏度。Folin-酚試劑法主要包括兩步：第一步雙縮脲反應(yīng)在堿性溶液中，雙縮脲（H2NOCNHCONH2）能與Cu2+作用,形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物，這個反

5、應(yīng)叫做雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)分子中含有與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的多個肽鍵,因此有雙縮脲反應(yīng)。即在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的Cu2+作用生成紫紅色的蛋白質(zhì)-Cu2+復(fù)合物。第二步Folin-酚顯色反應(yīng)Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，其磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物）。由于蛋白質(zhì)中含有帶酚羥基的酪氨酸(Tyr)，故有此顯色反應(yīng)。即蛋白質(zhì)-Cu2+復(fù)合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，故與同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液比色即可求出樣品中蛋白質(zhì)的含量。另外，

6、可以根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測樣品中蛋白質(zhì)的含量。二、實驗材料（一）樣品健康人血清（稀釋300倍）（二）試劑1牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（200g/ml）準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白粉末50.0mg，用0.1mol/LNaOH溶液潤濕溶解，加蒸餾水到250ml。2堿性硫酸銅溶液堿溶液：Na2CO32g溶于100ml0.1mol/LNaOH中。硫酸銅溶液：CuSO45H2O0.5g溶于100ml35mmol/L(1%)酒石酸鉀鈉中。使用前將與按50:1混合即成堿性硫酸銅溶液。使用時新鮮配制。3Folin-酚試劑在2L磨口回流裝置內(nèi)加鎢酸鈉（Na2WO42H2O）100g，鉬酸鈉（Na2MoO42H2O）25

7、g，蒸餾水700ml，14.68mol/L（85%）磷酸50ml，濃鹽酸100ml，充分混合后用小火回流10h。冷卻后，再加硫酸鋰（Li2SO4H2O）150g，水50ml，數(shù)滴（23滴）液體溴（也可用30%H2O268滴代替），然后開口沸騰15min，驅(qū)除過量的溴（因溴氣甚毒，這一步應(yīng)在通風(fēng)櫥中進行），冷卻后加水至1000ml，過濾，溶液呈黃色（如帶綠色則不能用），保存于棕色瓶中置冷暗處備用（如配制時間較長，試劑轉(zhuǎn)呈綠色），可再加液體溴數(shù)滴，煮沸15min，若能恢復(fù)原有的黃色或金黃色仍可繼續(xù)使用）。（三）儀器及器材1V-1100分光光度計2恒溫水浴箱3試管6支、試管架4加樣槍、加樣槍架5坐標(biāo)

8、紙三、實驗步驟1反應(yīng)體系設(shè)置取6支試管編號，按下表加入試劑，混勻。試劑（ml）空白管標(biāo)管樣品管123456牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0.20.40.60.8樣品液0.5蒸餾水1.00.80.60.40.20.52雙縮脲反應(yīng)向各管內(nèi)分別加入堿性硫酸銅溶液2ml，混勻，室溫放置10min3Folin-酚反應(yīng)再加入Folin-酚試劑0.20ml,2s內(nèi)迅速混勻a！40水浴10min后，冷卻至室溫。a.當(dāng)Folin-酚試劑加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中后，必須立即混勻（加一管混勻一管），使還原反應(yīng)發(fā)生在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前。4比色測定以500nm波長比色，用1號管作空白，讀取各管吸光度值A(chǔ)500b。b.每

9、管重復(fù)測三次A500值，求平均值用于繪標(biāo)準(zhǔn)曲線?！緦嶒瀳蟾娴诙糠郑▽嶒炗涗洠?1*GB3主要實驗條件（如材料的來源、質(zhì)量；試劑的規(guī)格、用量、濃度；實驗時間、操作要點中的技巧、失誤等，以便總結(jié)實驗時進行核對和作為查找成敗原因的參考依據(jù)）；=2*GB3實驗中觀察到的現(xiàn)象（如加入試劑后溶液顏色的變化）；=3*GB3原始實驗數(shù)據(jù)。評分（滿分20分）：FORMTEXTXX】主要實驗條件實驗條件見第一部分。注意事項1干擾物質(zhì)此法是在Folin-酚法的基礎(chǔ)上引入雙縮脲試劑，因此凡干擾雙縮脲反應(yīng)的基團，如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2以及在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖劑，如Tris緩沖劑以及

10、蔗糖，硫酸銨，巰基化合物均可干擾Folin-酚反應(yīng)。此外，所測的蛋白質(zhì)樣品中，若含有酚類及檸檬酸，均對此反應(yīng)有干擾作用。而濃度較低的尿素（約0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸鈉（1%），硝酸鈉（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）對顯色無影響，這些物質(zhì)在所測樣品中含量較高時，則需做校正曲線。若所測的樣品中含硫酸銨，則需增加碳酸鈉氫氧化鈉濃度即可顯色測定。若樣品酸度較高，也需提高碳酸鈉氫氧化鈉濃度12倍，這樣即可糾正顯色后色淺的弊病。2控制時間因Lowry反應(yīng)的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間。即第1支試管加入2.0ml堿性硫酸銅試劑后

11、，開始計時，1分鐘后，第2支試管加入2.0ml堿性硫酸銅試劑，2分鐘后加第3支試管，以此類推。全部試管加完堿性硫酸銅試劑后若已到10分鐘，則第1支試管可立即加入0.20mlFolin-酚試劑，1分鐘后第2支試管加入0.20mlFolin-酚試劑，2分鐘后加第3支試管，以此類推。40水浴10min，冷卻后，每一分鐘測定一管吸光值。操作問題及處理問題解析（1）加入Folin-酚試劑后溶液呈現(xiàn)黃綠色加入Folin-酚試劑后沒有及時混勻或加入的量不準(zhǔn)確，偏多（2）水浴后溶液呈無色Folin-酚試劑在反應(yīng)前已被破壞，原因是加入Folin-酚試劑后沒有及時混勻，或水浴時間過長。實驗現(xiàn)象1、加入Folin-

12、酚試劑后溶液呈現(xiàn)藍(lán)色，其中空白組藍(lán)色較淺，標(biāo)準(zhǔn)管25藍(lán)色依次加深。三、實驗數(shù)據(jù)1數(shù)據(jù)記錄按照下表記錄各管在500nm波長測得的吸光度值。測定次數(shù)各管吸光度值A(chǔ)5002345610.2790.4680.6290.7200.15320.2820.4630.6280.7180.14930.2770.4560.6240.7180.150各管平均值0.2790.4620.6270.7190.1512繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線3結(jié)果計算血清蛋白濃度(g/ml)=樣品蛋白質(zhì)濃度2300線性方程為：y=0.005x，將樣品溶液（即6號試管）的吸光度（0.151）代入方程，就可得出樣品濃度X=18.2g/l即該樣本中人血清蛋

13、白濃度為18.2g/L,低于正常人平均值。（參考：正常人血清蛋白濃度范圍為6080g/L）?！緦嶒瀳蟾娴谌糠郑ńY(jié)果與討論）：=1*GB3結(jié)果（定量實驗包括計算）：應(yīng)把所得的實驗結(jié)果（如觀察現(xiàn)象）和數(shù)據(jù)進行整理、歸納、分析、對比，盡量用圖表的形式概括實驗的結(jié)果；=2*GB3討論：不應(yīng)是實驗結(jié)果的重述，而是以結(jié)果為基礎(chǔ)的邏輯推論。=3*GB3結(jié)論：簡單扼要，說明本次實驗所獲得的結(jié)果。（包括思考題）。評分（滿分45分）：FORMTEXTXX】結(jié)果1.實驗測得的人血清蛋白濃度為18.2g/L，較標(biāo)準(zhǔn)值低。討論本實驗測得樣本人血清蛋白濃度偏低，原因可能有：1、樣本人體較正常人體蛋白濃度偏低2、Foli

14、n-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，試劑被還原影響實驗結(jié)果3、讀數(shù)、試劑加入時間不夠精確4、分光光度計溶液管表面油漬、污穢較多影響對光波長的分析結(jié)論1.實驗測得的人血清蛋白濃度為18.2g/L，較標(biāo)準(zhǔn)值低。課后思考題1、試述Folin-酚試劑法的優(yōu)點？Folin-酚試劑法較雙縮脲反應(yīng)靈敏，可以達(dá)到g級別，操作方便，實驗重復(fù)性好。2、應(yīng)用本方法有哪些干擾作用？為什么？應(yīng)如何注意？酸堿性干擾。Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，而反應(yīng)試劑是堿性的，所以將Folin試劑加入堿性的銅和蛋白質(zhì)溶液中必須立即混勻，此反應(yīng)只在極短時間內(nèi)有效進行，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。專一性較差，HYPERLINK/view