1、第二章 核酸Nucleic Acids第一節 概 述核酸(nucleic acid) 以核苷酸為基本組成單位的生物大分子，攜帶和傳遞遺傳信息。 DNA（Deoxyribonucleic acid)脫氧核糖核酸 RNA（Ribonucleic acid) 核糖核酸1868年 Fridrich Miescher從膿細胞中提取“核素” 1944年 Avery等人證實DNA是遺傳物質1953年 Watson和Crick發現DNA的雙螺旋結構1968年 Nirenberg發現遺傳密碼1975年 Temin和Baltimore發現逆轉錄酶1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 測序方法1985

2、年 Mullis發明PCR 技術1990年 美國啟動人類基因組計劃(HGP) 1994年 中國人類基因組計劃啟動2001年 美、英等國完成人類基因組計劃基本框架一、核酸的發現和研究工作進展 二、核酸的分類及分布、功能(deoxyribonucleic acid, DNA)(ribonucleic acid, RNA)脫氧核糖核酸 核糖核酸 90%以上分布于細胞核，其余分布于核外如線粒體，葉綠體，質粒等。分布于胞核、胞液。攜帶遺傳信息，決定細胞和個體的基因型(genotype)。參與細胞內DNA遺傳信息的表達。某些病毒RNA也可作為遺傳信息的載體。三、元素組成主要元素組成： C、H、O、N、P(

3、911%)與蛋白質比較，核酸一般不含S，而P的含量較為穩定，占9-11%。 四、基本構成單位：核苷酸(nucleotide)核苷酸由戊糖、磷酸和含氮堿三部分構成第二節 核酸的分子組成戊 糖堿 基先將嘌呤和嘧啶的結構式記住，然后再記住下面口訣胸前一灘尿：U + 一碳基團（甲基） T尿里兩泡泡：嘧啶中有兩個O U上面一個是氨氣包：U靠上面的一個O換成-NH2 =C鳥兒張嘴吸氨氣：張嘴即O，嘌呤有O又有-NH2 G腺兒將鳥嘴來系，注意換氣（氨氣）：系嘴即去掉O，G去掉O再把-NH2換個位置 A 胺式亞胺式互變異構酮式烯醇式互變異構堿基的結構特征嘌呤堿和嘧啶堿分子中都含有共軛雙鍵體系，在紫外區有吸收（

4、260 nm左右）。核苷 nucleoside糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵。核糖核苷：AR, GR, UR, CR脫氧核苷：dAR, dGR, dTR, dCR核苷酸(ribonucleotide)的結構與命名核苷和磷酸以磷酸酯鍵連接稀有核苷酸修飾成分核酸中也存在一些不常見的稀有堿基。稀有堿基的種類很多，大部分是上述堿基的甲基化產物。 2、稀有核苷酸：稀有堿基/核苷/核苷酸 3、核苷酸的其他形式多磷酸核苷（NDP、NTP)環化核苷酸（cAMP、cGMP等）輔酶或輔基（NAD、NADP、FAD、CoA等，均含有AMP），活性代謝物（UDPG、CDP-膽堿，等） 1、核苷酸的組成：含氮

5、堿基、戊糖和磷酸。ATP的性質ATP 分子的最顯著特點是含有兩個高能磷酸鍵。ATP水解時, 可以釋放出大量自由能。ATP 是生物體內最重要的能量轉換中間體。ATP 水解釋放出來的能量用于推動生物體內各種需能的生化反應。ATP 也是一種很好的磷酰化劑。磷酰化反應的底物可以是普通的有機分子，也可以是酶。磷酰化的底物分子具有較高的能量（活化分子），是許多生物化學反應的激活步驟。cAMP和cGMPcAMP(3,5-環化腺苷酸)和cGMP(3,5-環化鳥苷酸)的主要功能是作為細胞的第二信使。cAMP和cGMP的環狀磷酯鍵是一個高能鍵。在pH7.4, cAMP和cGMP的水解能約為43.9 KJ/mol，

6、比ATP水解能高得多。腺苷酸也是一些輔酶的結構成分第三節 核酸的分子結構一、一級結構（primary structure）一級結構是指核酸分子中核苷酸的排列順序及連接方式。核苷酸的排列順序代表了遺傳信息。1、核苷酸的連接方式： 3, 5磷酸二酯鍵2、核酸的基本結構形式：多核苷酸鏈信息量：4n末端： 5 端、 3端多核苷酸鏈的方向： 5端3端(由左至右)3、表示方法：結構式、線條式、文字縮寫 堿基組成分析Chargaff 規則：A = T；G C 堿基的理化數據分析：A-T、G-C以氫鍵配對較合理 DNA纖維的X-線衍射圖譜分析 DNA雙螺旋結構的研究背景 二、DNA的空間結構（一）DNA的二級

7、結構（secondary structure）1、堿基組成規則(Chargaff規則)A=T，G=C； A+G=T+C(嘌呤與嘧啶的總數相等)有種屬特異性無組織、器官特異性不受年齡、營養、性別及其他環境等影響 DNA分子由兩條DNA單鏈組成。DNA的雙螺旋結構是分子中兩條DNA單鏈之間基團相互識別和作用的結果。雙螺旋結構是DNA二級結構的最基本形式。DNA雙螺旋結構的特點double helix modelDNA雙螺旋結構的要點（1）DNA分子由兩條多聚脫氧核糖核苷酸鏈(簡稱DNA單鏈)組成。兩條鏈沿著同一根軸平行盤繞，形成右手雙螺旋結構。螺旋中的兩條鏈方向相反，即其中一條鏈的方向為5端3端，

8、而另一條鏈的方向為3端5端。（2）嘌呤和嘧啶堿基位于螺旋的內側，磷酸和脫氧核糖基位于螺旋外側。堿基環平面與螺旋軸垂直，糖基環平面與堿基環平面成90角。（3）螺旋橫截面的直徑約為2nm，每條鏈相鄰兩個堿基平面之間的距離為0.34 nm，每10個核苷酸形成一個螺旋，其螺矩（即螺旋旋轉一圈的高度）為3.4 nm。（4）維持兩條DNA鏈相互結合的力是鏈間堿基對形成的氫鍵。堿基結合具有嚴格的配對規律:A與T結合，G與C結合，這種配對關系，稱為堿基互補。A和T之間形成兩個氫鍵，G與C之間形成三個氫鍵。在DNA分子中，嘌呤堿基的總數與嘧啶堿基的總數相等。（5）螺旋表面形成大溝(major groove)及小

9、溝(minor groove)，彼此相間排列。小溝較淺；大溝較深，是蛋白質識別DNA堿基序列的基礎。（6）氫鍵維持雙鏈橫向穩定性，堿基堆積力維持雙鏈縱向穩定性。（二）二級結構： 雙螺旋結構模型(double helix model)1、Watson-Crick雙螺旋結構模型(B-DNA) （1）反平行雙鏈：脫氧核糖-磷酸骨架位于外側，堿基對位于內側 （2）堿基互補配對：AT配對（兩個氫鍵），GC配對（三個氫鍵）；堿基對平面垂直縱軸（3）右手雙螺旋：螺距為3.4 nm，直徑為2.0 nm，10bp/圈（4）表面功能區：小溝較淺；大溝較深，是蛋白質識別DNA堿基序列的基礎 （5）維持結構穩定的力量

10、：氫鍵維持雙鏈橫向穩定，堿基堆積力維持螺旋縱向穩定2、其他螺旋形式 Z-DNA（左手雙螺旋） A-DNA DNA double helix類型 helix type bp/turn rotation/bp vertical rise/bp helical d A 11 +34.7 2.56A 23A B 10 +34.0 3.38A 19A C 9.33 +38.6 3.32A 19A Z 12 -30.0 5.71A 18ADNA雙螺旋的穩定性DNA雙螺旋結構在生理條件下很穩定。維持這種穩定性的因素包括：兩條DNA鏈之間形成的氫鍵，堿基堆積力。雙螺旋結構內部形成的疏水區，消除了介質中水分子對

11、堿基之間氫鍵的影響；介質中的陽離子（如Na+、K+和Mg2+）中和了磷酸基團的負電荷，降低了DNA鏈之間的排斥力等。改變介質條件和環境溫度，將影響雙螺旋的穩定性。 天然存在的DNA分子最顯著的特點是很長，分子質量很大，一般在1061010。大腸桿菌染色體由400萬堿基對(basepair，bp)組成的雙螺旋DNA單分子。其長度為1.4106nm，相當于1.4mm，而直徑為20nm，相當原子的大小。黑腹果蠅最大染色體由6.2107bp組成，長2.1cm多瘤病毒的DNA由5100bp組成 ，長1.7mm（二）DNA的三級結構雙螺旋進一步扭曲,形成一種比雙螺旋更高層次的空間構象。包括：線狀DNA形成

12、的紐結、超螺旋和多重螺旋、環狀DNA形成的結、超螺旋和連環等大多數原核生物 ：1）共價封閉的環狀雙螺旋分子2）超螺旋結構：雙螺旋基礎上的螺旋化正超螺旋(positive supercoil):盤繞方向與雙螺旋方同相同負超螺旋(negative supercoil):盤繞方向與雙螺旋方向相反 （三）DNA在真核生物細胞核內的組裝核小體(nucleosome)： 由DNA和組蛋白構成。DNA：以負超螺旋纏繞在組蛋白上組蛋白核心：H2B ,H2A ,H3 ,H4H1組蛋白在核小體之間（三）DNA的功能DNA的基本功能是以基因的形式荷載遺傳信息，并作為基因復制和轉錄的模板。它是生命遺傳的物質基礎，也是

13、個體生命活動的信息基礎。基因從結構上定義，是指DNA分子中的特定區段，其中的核苷酸排列順序決定了基因的功能。 三、RNA的分子結構Mitochondrial RNARNA的結構特點RNA是單鏈分子，因此在RNA分子中，嘌呤的總數不一定等于嘧啶的總數。RNA分子中，部分區域也能形成雙螺旋結構，不能形成雙螺旋的部分，則形成單鏈突環。這種結構稱為“發夾型”結構。在RNA的雙螺旋結構中，堿基的配對情況不象DNA中嚴格。G 除了可以和C 配對外，也可以和U 配對。G-U 配對形成的氫鍵較弱。不同類型的RNA, 其二級結構有明顯的差異。tRNA中除了常見的堿基外，還存在一些稀有堿基，這類堿基大部分位于突環

14、部分.（一）信使RNA的結構與功能* 真核生物mRNA的結構特點1. 大多數真核mRNA的5末端均在轉錄后加上一個7-甲基鳥苷，同時第一個核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子結構：m7GpppNm-。2. 大多數真核mRNA的3末端有一個多聚腺苷酸(polyA)結構，稱為多聚A尾。mRNA核內向胞質的轉位mRNA的穩定性維系翻譯起始的調控 帽子結構和多聚A尾的功能* mRNA的功能 把DNA所攜帶的遺傳信息，按堿基互補配對原則，抄錄并傳送至核糖體，用以決定其合成蛋白質的氨基酸排列順序。DNAmRNA蛋白轉錄翻譯原核細胞 細胞質細胞核DNA內含子外顯子轉錄轉錄后剪接轉運mRNAhnRNA翻譯蛋白真核

15、細胞 （二）tRNA的結構與功能* tRNA的一級結構特點 含 1020% 稀有堿基，如 DHU 3末端為 - CCA-OH 5末端大多數為G 具有 TC 雙氫尿嘧啶(DHU)假尿嘧啶()次黃嘌呤(I)* tRNA的二級結構三葉草形 氨基酸臂 DHU環 反密碼環 額外環 TC環氨基酸臂額外環* tRNA的功能：活化、搬運氨基酸到核糖體，參與蛋白質的翻譯。1、分子較小，含較多的稀有堿基和非標準堿基配對2、5端一般為鳥嘌呤核苷酸，3端為CCA-OH3。3、二級結構為“三葉草”型（cloverleaf pattern）小結反密碼環：反密碼環中部的三個堿基可以與mRNA的三聯體密碼形成堿基互補配對，解

16、讀遺傳密碼，稱為反密碼子（anticodon）。ACCDHU環T環反密碼環5額外環氨基酸臂：3末端的CCA-OH3單鏈用于連接該tRNA轉運的氨基酸。 二氫尿嘧啶環（DHU）：識別氨酰-tRNA合成酶TC環：識別核蛋白體（核糖體）4、“倒L”型三級結構（三）rRNA的結構與功能原核生物（以大腸桿菌為例）真核生物（以小鼠肝為例）小亞基30S40SrRNA16S1542個核苷酸18S1874個核苷酸蛋白質21種占總重量的40%33種占總重量的50%大亞基50S60SrRNA23S5S2940個核苷酸120個核苷酸28S5.85S5S4718個核苷酸160個核苷酸120個核苷酸蛋白質31種占總重量的

17、30%49種占總重量的35%核蛋白體的組成* rRNA的功能:組成核蛋白體，作為蛋白質合成的場所。（四）其他小分子RNA及RNA組學除了上述三種RNA外，細胞的不同部位存在的許多其他種類的小分子RNA，統稱為非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs),或非編碼蛋白質的RNA(non-coding RNA, ncRNA) 。 種類：核內小RNA；核仁小RNA；胞質小RNA；催化性小RNA；小片段干涉 RNA功能：參與hnRNA和rRNA的加工和轉運。ncRNA在在基因表達以及應激信號傳導等方面起著重要的調節作用。因此，有人也將其稱為調節RNA（reg

18、ulatory RNA）。 小片段干擾RNA （siRNA；又稱“引導RNAs”，guide RNAs）：一些小的雙鏈RNA可以高效、特異的阻斷體內特定基因表達，促使mRNA降解，誘使細胞表現出特定基因缺失的表型，稱為RNA干擾（RNA interference，RNAi，也譯作RNA干預或干涉）。它是體內抵御外在感染的一種重要保護機制。RNAi的作用機制：包括起始階段和效應階段。（1）在起始步驟，生物宿主將外源基因表達的雙鏈RNA進行切割，產生具有特定長度（19-21nt）和序列的小片段RNA；（2）在RNAi效應階段，siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物（RIS

19、C）。激活RISC需要一個ATP依賴的將siRNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉錄本上，并在距離siRNA3端12個堿基的位置切割mRNA。RNA組學研究細胞中snmRNAs的種類、結構和功能。同一生物體內不同種類的細胞、同一細胞在不同時間、不同狀態下snmRNAs的表達具有時間和空間特異性。 RNA組學:第四節 核酸的理化性質 一、酸性化合物 兩性解離，但酸性強 電泳行為泳向正極（pH7-8） 二、高分子性質 粘度 DNARNA 超離心沉降 凝膠過濾 分子大小單位：分子量（道爾頓，D）、堿基對數目（bp）、離心沉降常數（S） 沉淀行為加鹽（中和電荷）；乙醇紫外吸

20、收1. DNA或RNA的定量OD260=1.0相當于50g/ml雙鏈DNA40g/ml單鏈DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品: OD260/OD280 = 1.8RNA純品: OD260/OD280 = 2.0OD260的應用 三、紫外吸收 最大吸收波長：260nm 核酸定量分析 核酸定性分析 四、變性、復性、分子雜交1、DNA變性（DNA denaturation）：DNA變性是指在理化因素作用下，DNA分子中的氫鍵斷裂，堿基堆積力遭到破壞，雙螺旋結構解體，雙鏈分開形成單鏈的過程。 DNA的變性(denaturation)方法：過量酸，堿，加熱，變性試劑如

21、尿素、酰胺以及某些有機溶劑如乙醇、丙酮等。變性后其它理化性質變化：OD260增高；粘度下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸堿滴定曲線改變；生物活性改變DNA變性的本質是雙鏈間氫鍵的斷裂DNA變性增色效應：DNA變性時其溶液OD260增高的現象。當DNA的稀鹽溶液加熱到80-100時，雙螺旋結構即發生解體，兩條鏈彼此分開，形成無規線團。 80 90 100 100%50%OD260（254） Tm 變性溫度范圍融解溫度（melting temperature,Tm）：DNA熱變性過程中，紫外吸收達到最大值的一半時溶液的溫度稱為融解溫度（Tm）或解鏈溫度、變性溫度。 實驗室常用的方法熱變性影響Tm值

22、的因素(1)溶液的性質(2)DNA的性質和組成大腸桿菌DNA在不同濃度KCl溶液下的熔融溫度曲線GC含量越高，Tm越大 （1）變性后理化性質改變DNA溶液的粘度降低浮力密度增加旋光偏振光改變紫外吸收增加（高色效應）高色效應（hyperochromic effect）：DNA變性后，在260nm處的紫外吸收增高，稱為高色效應或增色效應。 （2）變性后的DNA一級結構沒有改變。（3）融解溫度（melting temperature,Tm）：DNA熱變性過程中，紫外吸收達到最大值的一半時溶液的溫度稱為融解溫度（Tm）GC含量越高，Tm越大DNA越長，Tm越大溶液離子強度增高，Tm值增加DNA越純，相

23、變范圍越小 2、DNA復性DNA復性(renaturation)的定義:在適當條件下，變性DNA的兩條互補鏈可恢復天然的雙螺旋構象，這一現象稱為復性。熱變性的DNA經緩慢冷卻后即可復性，這一過程稱為退火(annealing) 。減色效應（hypochromic effect ）:DNA復性時，其溶液OD260降低。DNA復性在DNA變性后的復性過程中，如果將不同種類的DNA單鏈分子或RNA分子放在同一溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對關系，在適宜的條件（溫度及離子強度）下，就可以在不同的分子間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。這種雜化雙鏈可以在不同的DNA與DNA之間形成，也可以在DNA和RNA分子間或者RNA與RNA分子間形成。這種現象稱為核酸分子雜交。核酸分子雜交(hybridization) 核酸的雜交DNA-DNA雜交雙鏈分子變性 復性 不同來源的DNA分子核酸分子雜交的應用:研究基因的位置確定兩種核酸序列的相似性檢測樣品中的特異序列基因芯片技術的基礎 核酸探針（nucleic acid probe）:能特異性的探測帶某一特定序列的DNA或RNA分子的標記核酸分子。3、核酸分子雜交(h