1、 驗證(ynzhng)文件大豆磷脂微生物限度(xind)檢測方法驗證(ynzhng)起 草 人 起草日期 審 核 人 審核日期 批 準 人 批準日期 文件編號 目 錄 TOC o 1-2 h z u HYPERLINK l _Toc377524902 1適用范圍 PAGEREF _Toc377524902 h - 1 - HYPERLINK l _Toc377524903 2目的(md) PAGEREF _Toc377524903 h - 1 - HYPERLINK l _Toc377524904 3概述(i sh) PAGEREF _Toc377524904 h - 1 - HYPERLIN

2、K l _Toc377524905 4驗證(ynzhng)所需要的儀器設備及文件 PAGEREF _Toc377524905 h - 1 - HYPERLINK l _Toc377524906 5可接受的限度范圍標準 PAGEREF _Toc377524906 h - 2 - HYPERLINK l _Toc377524907 6測試方法 PAGEREF _Toc377524907 h - 5 - HYPERLINK l _Toc377524908 7異常情況處理 PAGEREF _Toc377524908 h - 15 - HYPERLINK l _Toc377524909 8測試結果 PA

3、GEREF _Toc377524909 h - 16 - HYPERLINK l _Toc377524910 9結論 PAGEREF _Toc377524910 h - 16 - HYPERLINK l _Toc377524911 10再驗證周期 PAGEREF _Toc377524911 h - 16 - HYPERLINK l _Toc377524912 11附表 PAGEREF _Toc377524912 h - 16 - PAGE - 8 -1適用范圍本驗證方案(fng n)適用于大豆磷脂微生物限度(xind)檢查法的驗證(ynzhng)。2目的建立該產品的微生物限度檢查方法，并對其有

4、效性進行評價，確保試驗方法的完整性，保證檢驗結果的可靠性。3概述3.1按中國藥典2010年版附錄 J微生物限度檢查法方法的“供試品的制備”項下制備方法2（固體、半固體或黏稠液供試品，取供試品10g，加PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻,作為供試液。必要時加適量的無菌聚山梨酯80，并置水浴中適當加溫使供試品分散均勻）制備。 按“細菌，霉菌，酵母菌計數”項下檢查法1平皿法進行細菌，霉菌及酵母菌的計數方法驗證。按控制菌的檢查法進行控制菌檢查法驗證。驗證試驗使用一批產品進行三次獨立平行試驗。3.2驗證時間： 年 月 日 到 年 月 日3.3驗證產品批號： 4

5、驗證所需要的儀器設備及文件4.1驗證需用儀器設備器具名稱規格型號檢定日期檢定單位有效期霉菌培養箱SHH-150JS 年 月 日 年生化培養箱SHH-150L 年 月 日 年手提式壓力蒸汽滅菌器XFS-280A 年 月 日 年4.2驗證所需要的文件及存放地方資料名稱存放地點SHH-150JS霉菌培養箱操作維護保養SOPSHH-150L 生化培養箱操作維護保養SOPXFS-280A 手提式壓力蒸汽滅菌器操作維護保養SOP微生物限度檢查法SOP5可接受的限度(xind)范圍標準5.1大豆磷脂微生物限度(xind)檢查質量標準項目標準規定細菌總數100個/g霉菌、酵母菌100個/g大腸埃希菌不得檢出沙

6、門菌不得檢出銅綠假單胞菌不得檢出金黃色葡萄球菌不得檢出5.2細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證結果(ji gu)判斷在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率應不低于70%。若試驗組的菌回收率均不低于70%，照該供試液制備方法和計數法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌；若任一次試驗中實驗組的菌回收率低于70%，應采用其他方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。5.3控制菌檢查方法驗證結果判斷若試驗組檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查；若試驗組未檢出試驗菌，應采用其他方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行驗證。5.4大腸埃希菌檢查結果判斷如MUG陽性、靛基質陽性，

7、判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰性、靛基質陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG陽性、靛基質陰性，或MUG陰性、靛基質陽性，則應取膽鹽乳糖培養基的培養物劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂或麥康凱瓊脂培養基的平板上，培養1824h。若平板上無菌落生長、或生長的菌落與下表所列的菌落形態特征不符，判定供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長的菌落與下表所列的菌落形態特征相符或疑似，應進行分離、純化、染色鏡檢和適宜的生化試驗，確認是否為大腸埃希菌。培養基大腸埃希菌落形態曙紅亞甲藍瓊脂紫黑色、淺紫色、藍紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，常有金屬光澤麥康凱瓊脂鮮

8、桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤當陰性對照(duzho)試驗呈陰性，陽性對照試驗M U G 呈陽性(yngxng)，供試品M U G 陽性(yngxng)、靛基質陽性，報告lg或l m l供試品檢出大腸埃希菌。M U G 陰性、靛基質陰性，報告lg或l m l供試品未檢出大腸埃希菌。M U G 陽性、靛基質陰性、I M V i C試驗為一+ 、革蘭陰性桿菌，報告lg或l m l供試品檢出大腸埃希菌;M U G 陰性、靛基質陽性、I M V i C試驗為+ + 、革蘭陰性桿菌，報告l g或l m l供試品檢出大腸埃希菌。供試品培養物檢查不符合二項中的任一項

9、，報告l g或l m l供試品未檢出大腸埃希菌。當陰性對照有菌生長或陽性對照未生長或生長菌落不是大腸埃希菌，不能做出檢驗報告。5.5沙門菌檢查結果判斷供試品培養物為革蘭陰性桿菌，三糖鐵瓊脂反應及生化反應符合沙門菌屬反應，沙門菌屬0 多價1 血清凝集試驗陽性反應(含待檢培養物經10030min處理后凝集試驗為陽性反應），報告10g或10ml供試品檢出沙門菌。供試品培養物三糖鐵瓊脂反應或生化反應不符合沙門菌屬反應及沙門菌屬0 多價1 血清凝集試驗為陰性反應(含待檢培養物經10030min處理后凝集試驗為陰性反應），報告lg或lml供試品未檢出沙門菌。 供試品培養物出現下列情況應繼續鑒定或保留菌種送

10、交有關單位進一步鑒定后，再作報告。 供試品培養物生化反應符合沙門菌屬反應，沙門菌屬0 多價1 血清凝集試驗陰性反應。供試品培養物生化反應不符合沙門菌屬反應，沙門菌屬0 多價1 血清凝集反應呈陽性反應。 對已檢出沙門菌的供試品分離(fnl)菌種，有條件者，應進一步作菌型鑒定。根據檢出菌的特性,推斷(tudun)可能菌型，增加生化試驗項目及沙門菌單因子血清“0”及“H”凝集(nngj)試驗進行鑒定。培養基沙門菌落形態膽鹽硫乳瓊脂（DHL)無色至淺橙色,半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無黑色沙門菌屬志賀菌屬瓊脂(S.S )無色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時帶黑褐色曙紅亞甲藍瓊脂（EMB)無

11、色至淺橙色，透明或半透明，光滑濕潤的圓形菌落麥康凱瓊脂（MacC)無色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時為暗5.6銅綠假單胞菌檢查結果判斷供試品培養物經證實為革蘭陰性桿菌，氧化酶試驗及綠膿菌素試驗皆為陽性者，即報告lg或lml供試品檢出銅綠假單胞菌。 供試品培養物氧化酶試驗陽性，鏡檢為革蘭陰性桿菌的培養物，綠膿菌素試驗陰性時，其硝酸鹽還原產氣試驗、42生長試驗及明膠液化試驗皆為陽性時，亦報告lg或lml供試品檢出銅綠假單胞菌。凡與以上兩種結果不符時，報告lg或lml供試品未檢出銅綠假單胞菌。5.7金黃色葡萄球菌檢查結果判斷如果革蘭染色鏡檢結果清晰可靠(必要時加做已知革蘭染色鏡檢結果的細菌進行

12、染色質量控制），凝固酶試驗陰性對照試驗呈陰性，陽性對照試驗呈陽性結果，供試品培養物按下列情況報告或處理：疑似菌革蘭染色鏡檢呈陽性球菌,血漿凝固酶試驗陽性反應者，報告lg或lml供試品檢出金黃色葡萄球菌(少許菌株可能不是金黃色葡萄球菌而是葡萄球菌屬的其他菌種）。 革蘭染色鏡檢鏡檢不是革蘭陽性球菌,或血漿凝固酶試驗陰性反應，報告lg或lml供試品禾檢出金黃色葡萄球菌。陰性對照有菌生長，試驗結果無效。陽性對照試驗呈陰性結果，應當加做驗證試驗，考察檢品是否有抑菌活性。培養基金黃色葡萄球菌落形態卵黃氯化納瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，光滑濕潤，外周有分解卵磷脂后產生的乳濁圈，菌落直徑12mm甘露醇氯化

13、納瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，光滑濕潤，外周有黃色環，菌落直徑0.71mm6測試方法6.1供試品大豆磷脂，批號(p ho) 。6.2培養基及菌種6.2.1采用符合中國藥典(yodin)規定的干燥培養基，中國藥品生物制品檢定所制。6.2.2 枯草(k co)芽孢桿菌CMCC(B)63501、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、大腸埃希菌CMCC(B)44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、 黑曲霉CMCC(F)98003、乙型副傷寒沙門菌CMCC(B)50094、銅綠假單胞菌CMCC(B)101046.3菌液制備6.3.1細菌、霉菌及酵母菌檢查的菌液制備6.3.1.1取新鮮的金黃

14、色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的培養物至營養肉湯培養基或營養瓊脂培養基中，經3035培養1824h，用0.9無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數為50100cfu的菌懸液，做活菌計數備用。6.3.1.2取新鮮的白色念珠菌的培養物至改良馬丁培養基或改良馬丁瓊脂培養基中，經2328培養2448h，用0.9無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數為50100cfu的菌懸液，做活菌計數備用。6.3.1.3取新鮮的黑曲霉培養物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養基，經2328培養57d，加入35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9無菌氯化鈉溶液，將霉菌孢子洗脫。然后吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無菌棉花或紗

15、布能過濾菌絲的無菌毛細吸管）至無菌試管內，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數為50100cfu的菌懸液，做活菌計數備用。6.3.2控制菌檢查的菌液的制備取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌培養物少許，接種至10 ml營養肉湯培養基內，置3035培養1824h，取均勻培養物lml,用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每lml含菌10lOOcfu的菌懸液，其菌數在做對照試驗的同時用營養瓊脂注皿或平板涂布，經培養后計數確定。6.3.3供試品制備(zhbi)取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白(dnbi)胨緩沖液至100ml，制成

16、1：10的供試液。6.4驗證試驗(shyn)方法細菌、霉菌及酵母菌檢驗方法驗證采用上述供試品，進行3次平行試驗，分別人工污染上述5種代表試驗菌株?？刂凭鷻z驗方法驗證采用上述批供試品進行實驗。6.4.1細菌、霉菌及酵母菌的計數方法驗證試驗6.4.1.1試驗分組6.4.1.1.1供試品對照組：取上述供試液1ml，按菌落計數方法測定供試品本底細菌數；取上述供試液1ml，按菌落計數方法測定供試品本底霉菌和酵母菌數；6.4.1.1.2菌液組：分別取上述5種試驗菌懸液1ml，按菌落計數方法測定所加試驗菌數。6.4.1.1.3試驗組：取1：10供試液1ml注入無菌平皿，分別加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯

17、草芽孢桿菌試驗菌懸液各1ml，按平皿法測定其菌數。取1：10供試液1ml注入無菌平皿，分別加入白色念珠菌和黑曲霉懸液各1ml，按平皿法測定霉菌數。6.4.1.1.4稀釋劑對照組：取實驗用的稀釋液1ml代替供試品，加入實驗菌，按菌落計數方法測定所加的試驗菌數。6.4.1.2驗證試驗操作6.4.1.2.1取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，制成1：10的供試液。取上述供試液1ml，注入無菌平皿中，注入1520ml不超過45的溶化的營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基，混勻，凝固，倒置培養。6.4.1.2.2陰性對照試驗取實驗(shyn)用的

18、稀釋液1ml，注入(zh r)無菌平皿中，注入1520ml不超過(chogu)45的溶化的營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基，混勻，凝固，倒置培養，均不得有菌生長。6.4.1.2.3培養和計數 細菌培養3天，霉菌、酵母菌培養5天，逐日觀察菌落生長情況，點計菌落數，必要時，可適當延長培養時間至57天進行菌落計數報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數。點計菌落數后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數，按菌數報告規則報告菌數。若同稀釋級別兩個平板的菌落平均數不小于15，則兩個平板的菌落數不能相差1倍或以上。一般營養瓊脂培養基用于細菌計數，玫瑰紅鈉培養基用于霉菌及酵母菌計數；酵

19、母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基用于酵母菌計數。在特殊情況下，若營養瓊脂培養基上長有霉菌和酵母菌，玫瑰紅鈉瓊脂培養基上長有細菌，則應分別點計霉菌和酵母菌，細菌菌落數。然后將營養瓊脂上的霉菌和酵母菌或玫瑰紅鈉瓊脂培養基上細菌數與玫瑰紅鈉瓊脂培養基上的霉菌和酵母菌或營養瓊脂培養基上的細菌數進行比較，以菌落數高的培養基中的菌落數為計數結果。6.4.1.3菌數報告規則以相當于1g供試品的菌落數報告菌數；若無菌落生長，以1報告菌數，或 9 0 % ; 產堿(紅色），陰性，陰性率， 9 0 % ; + / 多數陽性、少數陰性；+ S 產生少量氣體; + 陽性，陽性率, 9 0 % 廣陰性，陰性率， 9 0 %

20、; + / - 多數陽性、少數陰性，一/ + 多數陰性、少數陽性（本表依據何曉青衛生防疫細菌檢驗，參考第八版美國臨床微生物手冊）；反應序號1 除典型反應外，脲酶、氰化鉀試驗、賴氨酸脫羧酶試驗三項中有一項異常；反應序號2僅靛基質陽性;可結合血清學凝集試驗，或加做部分生化試驗,判定是否為沙門菌,其他情況可排除沙門菌。血清學凝集(nngj)試驗準備(zhnbi)1 片潔凈的滅菌(mi jn)載玻片，在近中央的一端，以直徑3mm接種環沾取沙門菌屬0 多價1 血清23 環制成與玻片橫徑相垂直的條形涂抹，長約1.5cm，寬約0.5cm。另一端用生理鹽水代替血清同法操作，作為陰性對照。用接種環分別挑取三糖鐵

21、瓊脂斜面或營養瓊脂斜面的新鮮培養物少許，在血清和鹽水中混勻。菌量要適當，勿過濃。將玻片前后傾斜數次，以暗色背景襯底，在良好的照明條件下進行觀察，陰性對照不出現凝集現象，試驗組任何程度的凝集現象都是陽性反應。陽性反應通常在3min 內發生。有時因血清效價低、反應遲緩時，應將玻片置培養皿內，并放一個濕棉球在旁邊，蓋上皿蓋，經約20min，再觀察結果。如果仍然沒有出現凝集，應取斜面培養物，置含少量生理鹽水的試管中，制成濃菌懸液，在100C水浴中保溫30min，以除去可能存在的V i抗原，待冷，再做凝集試驗，如出現(chxin)凝集,仍判為陽性反應;如不出現(chxin)凝集現象，則為陰性反應。如對照

22、試驗出現(chxin)凝集現象為非特異反應，須對該菌株培養物進行處理后再作凝集試驗。6.4.2.3銅綠假單胞菌試驗組：取1：10供試液10ml和銅綠假單胞菌懸液1ml，接種至100ml膽鹽乳糖培養基中。供試品組：取1：10供試液10ml，接種至100ml膽鹽乳糖培養基中。陽性對照試驗：取銅綠假單胞菌懸液1ml，同供試品的控制菌檢查法檢查。陽性對照試驗應檢出銅綠假單胞菌。陰性對照試驗：取稀釋液10ml，照相應控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應無菌生長。銅綠假單胞菌的試驗：按上述分組，于3035培養1824h(必要時可延至48h)。陰性對照菌應無菌生長。輕輕搖動上述增菌培養液，以接種環取1

23、2環培養液（如有菌膜應挑取之），劃線接種于溴代十六烷基三甲胺瓊脂平板，于3035培養1824h。銅綠假單胞菌在該培養基平板上的典型菌落為扁平、圓形或無定形、邊緣不齊，光滑濕潤，呈灰白色，周邊略呈擴散現象,在菌落相鄰處常有融合現象。菌落周圍常有水溶性藍綠色素擴散，使培養基顯藍綠色，但亦有不產色素的菌株。菌落還有粗糙型和黏液型等，應注意挑選。純培養供試品分離平板生長典型菌落或呈疑似菌落時，以接種計輕輕接觸單個菌落的表面中心，沾取培養物，應挑取23 個疑似菌落，分別接種營養瓊脂斜面,培養，作以下檢查。革蘭染色鏡檢銅綠假單胞菌為革蘭陰性、無芽孢桿菌，單個，成對或成短鏈排列。生化試驗可用銅綠(tngl)

24、假單胞菌C M C C (B) 10104做生化試驗的陽性(yngxng)對照株。氧化酶試驗(shyn)取一小塊白色潔凈的濾紙置平皿內，以無菌玻璃棒挑取營養瓊脂斜面培養物少許，涂在濾紙上，隨即滴加1 滴新配制的1 % 二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30S 內，紙片上的培養物出現粉紅色，逐漸變為紫紅色，即為氧化酶試驗陽性反應。若培養物不變色或僅顯粉色為陰性反應。本試驗應注意：( 1 )試驗菌落(苔)必須新鮮，陳舊培養物反應結果不可靠。( 2 )試驗避免與鐵、鎳等金屬接觸，不可用普通接種計（環）（白金材料除外）挑取菌（苔），否則易出現假陽性。宜用玻璃棒或木棒。( 3 )試劑宜新鮮配制，放置過久,二鹽

25、酸二甲基對苯二胺氧化變色不可用。( 4 )反應需在有氧條件下進行，勿滴加試劑過多，以免浸泡培養物使之與空氣隔絕，造成假陰性反應。( 5 )麥康凱、S S培養基等含糖培養基上的菌落不適于做氧化酶試驗，因為糖分解產酸抑制氧化酶活性。綠膿菌素試驗取營養瓊脂斜面培養物接種于綠膿菌素測定用培養基（P D P )斜面上，3035C培、養24h后，觀察斜面有無色素，如有色素,在試管內加三氯甲烷3 5 m l，以無菌玻棒攪碎培養基并充分振搖。使培養物中的色素完全萃取在三氯甲烷內。靜置片刻，待三氯甲烷分層，用吸管將三氯甲烷移至另一試管中，加入鹽酸試液（lmol/L)約1ml，振搖后靜置片刻，如在鹽酸液層內出現粉

26、紅色、即為陽性反應，無粉紅色出現為陰性反應。本試驗可用未接種的P D P 瓊脂培養基斜面作陰性對照，陰性對照試驗應當呈陰性。如培養基斜面無色素產生，應于室溫培養12天再按上法試驗。凡經再次檢驗，綠膿菌素試驗仍為陰性者應繼續以下試驗。硝酸鹽還原產氣試驗(shyn)以接種環沾取少許營養瓊脂斜面(ximin)培養物接種于硝酸鹽胨水培養基中，置3035C培養(piyng)24h，觀察結果。如果在培養基內的小倒管中有氣體產生，即為陽性反應，表明該培養物能還原硝酸鹽,并將亞硝酸鹽分解產生氮氣。小倒管內無氣泡者為陰性反應。42C生長試驗以接種環沾取少許營養瓊脂斜面培養物于0 . 9 %無菌氯化鈉溶液中，制成

27、菌懸液。然后將菌懸液劃線接種于營養瓊脂斜面上，立即置41C士1C的恒溫水浴箱內，務使整個斜面浸沒在水浴中，培養2448h,斜面如有菌苔生長者為陽性反應;無菌苔生長為陰性反應。明膠液化試驗以接種計沾取營養瓊脂斜面培養物少許，穿刺接種于明膠培養基中，穿刺深度應接近培養基的底部，于3035C培養24h。取出放入04C冰箱內1030min。如培養基呈溶液狀，即為明膠液化試驗陽性反應;如明膠呈凝固狀，為陰性反應。本試驗應注意：( 1 )本試驗接種前，培養基應為固態，否則需將培養基置冰箱內使之凝固后，再穿刺接種。( 2 )試驗應同時設未接種細菌的陰性對照管，與試驗管同時培養并觀察結果。6.4.2.3金黃色

28、葡萄球菌試驗組：取1：10供試液10ml和金黃色葡萄球菌懸液1ml，接種至100ml營養肉湯培養基中。供試品組：取1：10供試液10ml，接種至100ml營養肉湯培養基中。陽性對照試驗：取金黃色葡萄球菌懸液1ml，同供試品的控制菌檢查法檢查。陽性對照試驗應檢出金黃色葡萄球菌。陰性對照試驗：取稀釋液10ml，照相應控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應無菌生長。金黃色葡萄球菌的試驗：按上述(shngsh)分組，置3035培養(piyng)1824h(必要(byo)時可延至48h)。陰性對照應無菌生長。將上述供試品增菌培養液，以接種環沾取12環培養液，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂平板或甘露醇氯化鈉

29、瓊脂平板上，置3035培養2472h。當供試品分離平板無菌落生長，或有菌落生長但不同于金黃色葡萄球菌特征，可報告為lg或lml供試品未檢出金黃色葡萄球菌。純培養當供試品分離平板生長菌落與表1 所列菌落特征相似或疑似時，應選取2 3 個以上菌落，分別用接種針，輕輕沾取菌落中心表面培養物，接種于營養瓊脂斜面上，于3035C培養1824h，取營養瓊脂斜面培養物作革蘭染色、鏡檢及接種營養瓊脂肉湯于3035C培養182 4 h做血漿凝固酶試驗。革蘭染色、鏡檢金黃色葡萄球菌為革蘭陽性球菌,無芽孢，一般不產生莢膜。排列呈不規則的葡萄狀，亦可呈單個、成雙或短鏈狀排列。血漿凝固酶試驗試管法:取無菌試管（l O

30、m m X 1 0 0 m m ) 3支，各加人血漿和0. 9 % 無菌氯化鈉溶液（1 : 1)0. 5ml, 1 支加入瓊脂斜面培養物菌懸液(或被檢菌的營養肉湯培養液0. 5 m l，其余2 支作對照管：1 支加入金黃色葡萄球菌 C M C C ( B ) 2 6 0 0 3 培養物菌懸液或營養肉湯培養液0. 5 ml作為陽性對照;另一支加入營養肉湯或0. 9 % 無菌氯化鈉溶液0. 5 m l作陰性對照。三管同時置37C水浴或恒溫培養箱，3 h后開始檢查，以后每隔適當時間觀察一次，直至24h。檢査時，輕輕將試管傾斜（動作勿大），仔細觀察，陰性對照管血漿流動自如，陽性對照管血漿呈凝固狀，試驗

31、管呈凝固者為陽性反應;不凝固為陰性反應。陽性對照管和陰性對照管任何一管不符合要求時，應另制備血漿，重新試驗。7異常情況處理(chl)嚴格按照微生物限度檢查法SOP操作，如在檢測中出現不符合要求的情況出現，分析問題原因后，決定是否需對本方案(fng n)中設定的大豆磷脂的微生物限度檢查方法進行修改(xigi)，并重新進行驗證。8測試結果8.1細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證結果見附表1。8.2控制菌的檢查方法驗證結果見附表25。8.3按確定的驗證方法檢驗三批產品微生物限度檢查結果見附表6。9結論9.1按照大豆磷脂檢驗操作規程，我們設定了該產品的微生物限度檢驗方法，對 批次大豆磷脂進行了微生物方法學

32、驗證，結果各項指標 標準規定，證明該標準操作規程 檢驗需要， GMP要求， 使用。9.2通過檢驗，各項指標的回收率均大于70%，說明大豆磷脂用平皿法檢驗無抑菌性，故適用于大豆磷脂的微生物檢驗。確定大豆磷脂微生物限度檢查法如下： 質量負責人： 審核人： 檢驗人10再驗證周期10.1大豆磷脂的處方發生變動或其它因素變更導致大豆磷脂的物料性質改變時，需要對本方案進行調整后作方法學再驗證。10.2國家相關微生物限度檢查標準修改后需要對本方法重新進行再驗證。11附表附表1 細菌、霉菌(mjn)及酵母菌計數方法驗證結果 試驗分類實驗次數大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉菌試驗組123菌液組123稀釋劑對照組123供試品對照組1供試品對照組2供試品對照組3陰性對照組1陰性對照組2陰性對照組3試驗組的菌回收率123結果判定備注：大豆磷脂驗證一批平行三次，批號： 結論：按照大