1、目錄微生物酶制劑的簡介微生物酶制劑的生產技術微生物酶制劑在食品工業中的應用一、簡介1、定義 酶制劑是指從生物中提取的具有酶特性的一類物質，酶制劑主要作用是催化食品加工過程中各種化學反響，改進食品加工方法。是一類從動物、植物、微生物中提取具有生物催化能力的蛋白質。微生物酶制劑就是從微生物中提取的蛋白質。 2、微生物酶生產開展概況1894年，日本科學家首次從米曲霉中提煉出淀粉酶，并將淀粉酶用作治療消化不良的藥物，從而開創了人類有目的地生產和應用酶制劑的先例。1911年，美國科學家從木瓜中提取出木瓜蛋白酶，并將木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白質渾濁物。此后，酶制劑 的生產和應用就逐步開展起1949年，

2、科學家成功地用液體深層發酵法 生產出了細菌淀粉酶，從此揭開了近代酶工業的序幕。1971年，第一次國際酶工程學術會議在美國召開，會議的主題就是固定化酶的研制和應用。20世紀70年代后期，酶工程領域又出現了固定化細胞技術。1986年，我國科學家利用固定化原生質體發酵生產堿性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相繼獲得成功，為酶工程的進一步開展開辟了新的途徑。近20年來，隨著基因工程的滲入，使酶的定向改造成為可能，所以在固定化酶、固定化細胞和固定化原生質體開展的同時，酶分子修飾技術、酶的化學合成以及酶的人工合成等方面的研究，也在積極地開展中，從而使酶工程更加顯示出廣闊而誘人的前景。 3、利用微生物提取酶制劑的意義

3、及其優點 酶是一種生物催化劑，催化效率高、反響條件溫和和專一性強等特點，已經日益受到人們的重視，應用也越來越廣泛。生物界中已發現有多種生物酶，在生產中廣泛應用的僅有淀粉酶、蛋白酶、果膠酶、脂肪酶、纖維素酶、葡萄糖異構酶、葡萄糖氧化酶等十幾種。利用微生物生產生物酶制劑要比從植物瓜果、種子、動物組織中獲得更容易。因為動、植物來源有限，且受季節、氣候和地域的限制，而微生物不僅不受這些因素的影響，而且種類繁多、生長速度快、加工提純容易、加工本錢相比照較低，充分顯示了微生物生產酶制劑的優越性。 利用微生物產酶的優點是：(1) 微生物種類多、酶種豐富，且菌株易誘變，菌種多樣。(2) 微生物生長繁殖快，易提

4、取酶，特別是胞外酶。(3) 微生物培養基來源廣泛、價格廉價。(4) 可以采用微電腦等新技術，控制酶發酵生產過程，生產可連續化、自動化，經濟效益高。(5) 可以利用以基因工程為主的現代分子生物學技術，選育菌種、增加酶產率和開發新酶種。二、微生物酶的生產技術二級種子一級種子三角瓶種子斜面菌種培養基滅菌接種固體發酵液體發酵空氣壓縮過濾濃縮酶液枯燥酶粉提取酶液圖 1. 微生物酶制劑的生產工藝一、產酶微生物 生產酶制劑的微生物有絲狀真菌、酵母、細菌 3大類群，主要是用好氣菌。幾種主要工業酶的菌種和使用情況如下： 淀粉酶類、蛋白酶、葡糖異構酶、其他重要工業用酶二、酶的生產方法 酶的生產是指經過預先設計，并

5、且通過人工控制而獲得所需要的酶的過程。概括地說，酶的生產方法有提取法、發酵法和化學合成法三種。提取法是最早采用并且一直沿用至今的一種方法。它采用各種技術，直接從動植物或微生物的細胞或組織中將酶提取出來。提取法雖簡單易行，但必須要有充足的原材料，這就使提取法的廣泛應用受到了限制。發酵法是20世紀50年代以來生產酶的主要方法。它主要通過微生物發酵來獲得人們所需要的酶。發酵法一般包括固體發酵、液體深層發酵、固定化細胞發酵和原生質體發酵等多種方式?；瘜W合成法是20世紀60年代末出現的一種生產酶的新技術，目前仍然停留在實驗室內合成的階段。1.菌種選擇 微生物發酵生產酶的方法同其他發酵行業類似，首先必須選

6、擇適宜的產酶菌株，然后采用適當的培養基和培養方式進行發酵，使微生物生長繁殖并合成大量所需的酶，最后將酶別離純化制成一定的酶制劑。 三、微生物酶制劑生產 任何生物都能在一定的條件下合成某些酶。但并不是所有的細胞都能用于酶的發酵生產。一般說來，能用于酶發酵生產的細胞必須具備如下幾個條件： 酶的產量高 優良的產酶細胞首先具有高產的特性，才有較好的開發應用價值。高產細胞可以通過篩選、誘變、或采用基因工程、細胞工程等技術而獲得；容易培養和管理，要求產酶細胞容易生長繁殖，并且適應性較強，易于控制，便于管理。 產酶穩定性好 在通常的生產條件下，能夠穩定地 用于生產，不易退化。一旦細胞退化，要經過復壯處理，使

7、其恢復產酶性能。利于酶的別離純化 發酵完成后，需經別離純化過程，才能得到所需的酶，這就要求產酶細胞本身及其它雜質易于和酶別離。平安可靠 要使用的細胞及其代謝物平安無毒，不會影響生產人員和環境，也不會對酶的應用產生其它不良的影響。2、產酶培養 酶的發酵生產是以獲得大量所需的酶為目的。為此，除了選擇性能優良的產酶細胞以外，還必須滿足細胞生長、繁殖和發酵產酶的各種工藝條件，并要根據發酵過程的變化進行優化控制。 1) 固體培養法 固體培養是以麩皮或米糠為主要原料，另外添加谷糠、豆餅等為輔助原料。經過對原料發酵前處理，在一定的培養條件下微生物進行生長繁殖代謝產酶。固體培養法比液體培養法產酶量高。同時還具

8、有原料簡單、不易污染、操作簡便、酶提取容易、節省能源等優點。 缺點是不便自動化和連續化作業，占地多、勞動強度大、生產周期長。 2) 液體培養法 液體培養法的優點是：占地少、生產量大、適合機械化作業、發酵條件容易控制、不易污染，還可大大減輕勞動強度。其培養方法有分批培養、流加培養和連續培養三種，其中前兩種培養法廣為應用，后者因污染和變異等關鍵性技術問題尚未解決，應用受到限制。 3) 產酶條件的控制 1培養基 培養基的營養成分是微生物發酵產酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是無機鹽、生長因子和產酶促進劑等。 碳源碳素是構成菌體成分的主要元素，也是細胞貯藏物質和生產各種代謝產物的骨架，還是菌體生命活動

9、的能量的主要來源。當前酶制劑生產上使用的菌種大都是只能利用有機碳的異養型微生物。有機碳的主要來源有：一是農副產品中如甘薯、麩皮、玉米、米糠等淀粉質原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉質原料。 不同的細胞對各種碳源的利用差異很大，所以在配制培養基時應根據不同細胞的不同要求而選擇適宜的碳源。另外，選擇碳源除考慮營養要求外，還要考慮酶生物合成的誘導作用和是否存在分解代謝物阻遏作用。盡量選用具有誘導作用的碳源，盡量不用或少用有分解代謝物阻遏作用的碳源。例如，淀粉酶的發酵生產中，應該選用有誘導作用的淀粉作為碳源，而不用對該酶有分解代謝物阻遏作用的果糖作為碳源。 氮源氮是生物體內各種含氮物質，如氨基

10、酸、蛋白質、核苷酸、核酸等的組成成分。酶制劑生產中的氮源主要有有機氮源和無機氮源兩種，常用的有機氮源有：豆餅、花生餅、菜籽餅、魚粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；無機氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3P04、尿素等。不同的細胞對各種氮源的要求各不相同，應根據要求進行選擇和配制。一般來說，動物細胞要求有機氮，植物細胞主要要求無機氮。多數情況下將有機氮源和無機氮源配合使用才能取得較好的效果。例如黑曲霉酸性蛋白酶生產，只用銨鹽或硝酸鹽為氮源時，酶產量僅為有胨時的30%。只用有機氮源而不用無機氮源時產量也低，故一般除使用高濃度有機氮源外尚需添加1%3%的無機氮

11、源。 碳氮比在微生物酶生產培養基中碳源與氮源的比例是隨生產的酶類、生產菌株的性質和培養階段的不同而改變的。一般蛋白酶 (包括酸性、中性和堿性蛋白酶) 生產采用碳氮比低的培養基比較有利，例如黑曲霉3.350酸性蛋白酶生產采用由豆餅粉3.75 %、玉米粉0.625%、魚粉0.625%。NH4Cl 1%、CaCl2 0.5%、Na2HP04 0.2%、豆餅石灰水解液10%組成的培養基； 淀粉酶(包括淀粉酶、糖化酶、淀粉酶等)生產的碳氮比一般比蛋白酶生產略高，例如枯草桿菌TUD127淀粉酶生產采用由豆餅粉4 %、玉米粉8 %、Na2HP04 0.8%、 (NH4)2SO4 0.4%、CaCl2 0.2

12、%組成的培養基。而在淀粉酶生產中糖化酶生產培養基的碳氮比是最高的。 以上是蛋白酶和淀粉酶生產培養基碳氮比的一般規律，但是由于菌種很多而其性質各異。很難說都是符合上述規律的。在微生物酶生產過程中，培養基的碳氮比也因培養過程不同而異。例如種子培養時，為了適應菌體生長繁殖的需要，要求提供合成細胞蛋白質的氮多些，容易利用的氮源的比例大些，種子培養基的碳氮比一般要比發酵培養基低些。發酵時，不同發酵階段要求的碳氮比也是不同的。例如在枯草桿菌BF7658生產淀粉酶的發酵過程中，發酵前期要求培養基的碳氮比適當降低，以利菌體生長繁殖，發酵中后期要求培養基的碳氮比適當提高，以促進淀粉酶的生成。 無機鹽微生物酶生產

13、和其他微生物產品生產一樣，培養基中需要有磷酸鹽及硫、鉀、鈉、鈣、鎂等元素存在。在酶生產中常以磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等磷酸鹽作為磷源，以硫酸鎂為硫源和鎂源。鈣離子對淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多種酶的活性有十分重要的穩定作用，例如在無Ca2+存在時灰色鏈霉菌中性蛋白酶只在pH7-7.5很小范圍內穩定，當有Ca2+存在時穩定pH范圍可以擴大到5-7。鈉離子有控制細胞滲透壓使酶產量增加的作用，酶生產的培養基中有時以磷酸氫二鈉及硝酸鈉等形式參加，例如米曲霉淀粉酶生產，添加適量的硝酸鈉以促進酶生產。在天然培養基中，一般微量元素不必另外參加，但也有一些例外。如玉米粉、豆粉為碳源時，添加100 ppm Co2+

14、和Zn2+，放線菌166蛋白酶活力可增加70%-80%。 生長因子 微生物還需一些微量的像維生素一類的物質，才能正常生長發育，這類物質統稱生長因子(或生長素)。其中包括某些氨基酸、維生素、嘌呤或嘧啶等。酶制劑生產中所需的生長因子，大多是由天然原料提供，如玉米漿、麥芽汁、豆芽汁、酵母膏、麩皮、米糠等。玉米漿中一般含有生長素32-128mg / mL。 產酶促進劑 產酶促進劑是指在培養基中添加某種少量物質，能顯著提高酶的產率，這類物質稱為產酶促進劑。產酶促進劑大體上分為兩種：一是誘導物，二是外表活性劑。外表活性劑，如吐溫80的濃度為0.1 %時能增加許多酶的產量。外表活性劑能增加細胞的通透性，處在

15、氣液界面改善了氧的傳遞速度，還可以保護酶的活性。生產上常采用非離子型外表活性劑，如聚乙二醇、聚乙烯醇衍生物、植酸類、焦糖、羧甲基纖維素、苯乙醇等。離子型的外表活性劑對微生物有害。用于食品、醫藥的酶 的生產中所用的外表活性劑還須對人、畜無害。此外各種產酶促進劑的效果還受到菌種，種齡、培養基組成的影響。酶的發酵生產中發酵效果除了受到菌種產酶性能的影響外，還受到發酵溫度、pH、溶氧量等條件的影響。(2) 培養條件發酵溫度發酵溫度的變化主要隨著微生物代謝反響、發酵中通風、攪拌速度的變化而變化的。微生物在生長發育中，不斷地吸收培養基營養成分來合成菌體的細胞物質和酶時的生化反響都是吸熱反響；培養基中的營養

16、物質被大量分解時的生化反響都是放熱反響。發酵初期合成反響吸收的熱量大于分解反響放出的熱量，發酵液需要升溫。當菌體繁殖旺盛時，情況那么相反，發酵液溫度就自行上升，加上通風攪拌所帶來的熱量，這時，發酵液必須降溫，以保持微生物生長繁殖和產酶所需的適宜溫度。微生物生長繁殖和產酶的最適溫度隨著菌種和酶的性質不同而異，生長繁殖和產酶的最適溫度往往不一致。一般細菌為37 ，霉菌和放線菌為28-30 ，一些嗜熱微生物需在4050 下生長繁殖，如紅曲霉生長溫度35-37，而生產糖化酶的最適溫度為37-40 。在酶生產中，為了有利于菌體生長和酶的合成，也有進行變溫生產的。例如以枯草桿菌ASl.398進行中性蛋白酶

17、生產時，培養溫度必須從31 逐漸升溫至40 ，然后再降溫到31進行培養，蛋白酶產量比不升溫者高66%。據報道，酶生產的溫度對酶活力的穩定性有影響，例如用嗜熱芽孢桿菌進行淀粉酶生產時，在55 培養所產生的酶的穩定性比35 好。種子培養基和發酵培養基的pH直接影響酶的產量和質量。在發酵過程中，微生物不斷分解和同化營養物質，同時排出代謝產物。由于這些產物都與pH有直接關系，因此發酵液pH在不斷發生變化。生產上根據pH的變化情況常作為生產控制的根據。一般來說，培養基成分中碳/氮(C/N)比高，發酵液傾向于酸性，pH低；C/N低，發酵液傾向于堿性，pH高。pH的這些變化情況，常常引起細胞生長和產酶環境的

18、變化，對產酶帶來不利的影響。因此生產中常采用一些控制pH的方法，通常有：添加緩沖液維持一定的pH；調節通風量維持發酵液的氧化復原電位于一定范圍；調節培養基的初始pH，保持一定的C / N比；當發酵液pH過高時用糖或淀粉來調節，pH過低時，通過氮調節。 pH對產酶的影響通風量對產酶的影響其實通風量的多少應根據培養基中的溶解氧而定。一般來說，在發酵初期，雖然幼細胞呼吸強度大，耗氧多，但由于菌體少，相對通風量可以少些；菌體生長繁殖旺盛期時，耗氧多，要求通風量大些；產酶旺盛時的通風量因菌種和酶種而異，一般需要強烈通風；但也有例外，通風量過多反而抑制酶的生成。因此，菌種、酶種、培養時期、培養基和設備性能

19、都能影響通風量，從而影響酶的產量。目前用于酶制劑生產的微生物都為好氣性微生物，生產上普遍采用自動測定和記錄溶解氧的儀表。攪拌的影響對于好氣性微生物的深層發酵，除了需要通氣外，還需要攪拌。攪拌有利于熱交換、營養物質與菌體均勻接觸，降低細胞周圍的代謝產物，從而有利于新陳代謝。同時可打破空氣氣泡，使發酵液形成湍流，增加湍流速度，從而提高溶氧量，增加空氣利用。但攪拌速度主要因菌體大小而異，由于攪拌產生剪切力，易使細胞受損。同時攪拌也帶來一定機械熱，易使發酵液溫度發生變化。攪拌速度還與發酵液黏度有關。 泡沫的影響發酵中往往產生較多的泡沫。泡沫的存在阻礙了CO2的排除，影響溶氧量，同時泡沫過多影響補料，也

20、易使發酵液溢出罐外造成跑料。因此，生產上必須采用消泡措施。一般除了機械消泡外，還可利用消泡劑。消泡劑主要是一些天然的礦物油類、醇類、脂肪酸類、胺類、酰胺類、醚類、硫酸酯類、金屬皂類、聚硅氧烷和聚硅酮，其中以聚甲基硅氧烷最好。我國常用聚氧丙烯甘油醚或泡敵(聚環氧丙環氧乙烷甘油醚)。理想的消泡劑，其外表相互作用力應低，而且應難溶于水，還不能影響氧的傳遞速率和微生物的正常代謝。濕度用固體培養基生產酶制劑時，一般前期濕度低些，培養后期濕度大些，有利于產酶。3、 別離提純 微生物酶的提取方法，因酶的結合狀態與穩定性的不同，應用部門對產品的純度要求不同，而有一定的區別。 1) 鹽析法 鹽析劑中性鹽的選擇：

21、 MgS04，(NH4)2S04，Na2SO4，NaH2P04是常用的鹽析用中性鹽。 (NH4)2S04是最多用的鹽析劑，這是因為它的溶解度在較低溫度下也是相當高的 。在無鹽或稀鹽溶液中，溫度低，蛋白質的溶解度也低，但在高濃度鹽溶液中，溫度高那么蛋白質的溶解度反而低。因此一般說來鹽析時不要降低溫度，除非這種酶不耐熱。 2) 有機溶劑沉淀法 有機溶劑沉淀蛋白質的能力隨蛋白質的種類及有機溶劑的種類而不同，對曲霉淀粉酶而言，有機溶劑的沉淀能力，丙酮異丙醇乙醇甲醇。這個順序還受溫度、pH、鹽離子濃度所影響，不是一成不變的。 3) 吸附法 白土及活性氧化鋁吸附法 白土類是以硅酸鋁為主要成分的粘土，隨其種

22、類不同，能吸附酶或蛋白質的種類和數量也不同，一般在弱酸性條件下吸附酶或蛋白質，在中性或弱堿性條件下解吸。白土先用2mol/L鹽酸活化。 活性氧化鋁也是最常用的吸附酶或蛋白質的吸附劑之一?？梢杂妹鞔?、硫酸銨等調制，加熱使之活性化。酶或蛋白質一般在弱酸性條件下吸附，在弱堿性條件下解吸。 淀粉吸附-淀粉酶的方法 一定的酶只作用于特定的基質，這一事實說明兩者之間有一種特別的親和力。因此用基質吸附那種對基質具有特定作用的酶，可以到達很好的效果。但作為吸附劑的基質首先必須是固相物；其次在吸附酶的過程中，這種基質不會被它所吸附而又專門能作用于它的酶所分解，或分解程度極微；第三是單位重量的基質吸附這種特定酶的

23、能力均應該足夠大?，F發現生淀粉對-淀粉酶的吸附是比較接近于上述條件的。 4.酶制劑化和穩定化處理 濃縮的酶液可制成液體或固體酶制劑。酶制劑的出售是以一定體積或重量的酶活計價，所以生產出的酶制劑在出售前往往需要稀釋至一定的標準酶活。同時為改進和提高酶制劑的儲藏穩定性，一般都要在酶制劑中參加一種以上的物質，它們既可作酶活穩定劑，又可作抗菌劑及助濾劑，它們假設制成干粉，那么可起到填料、稀釋劑和抗結塊劑的作用?？捎米髅富罘€定劑的物質很多，如輔基、輔酶、金屬離子、底物、整合劑、蛋白質等，最常用的有多元醇(如甘油、乙二醇、山梨醇、聚乙二醇等)、糖類、食鹽、乙醇及有機鈣。有時用一種穩定劑效果不明顯，那么需要

24、幾種物質合用，如明膠對細菌淀粉酶及蛋白酶有穩定作用，但效果不明顯，假設同時加人些乙醇和甘油，穩定效果就顯著了 四、酶制劑在食品工業中的應用 酶制劑在食品保鮮方面的應用 酶法保鮮技術是利用生物酶的高效的催化作用，防止或消除外界因素對食品的不良影響，從而保持食品原有的優良品質和特性的技術。 主要用于食品保鮮中的酶制劑有葡萄糖氧化酶 Glucose oxidase 和溶菌酶酶制劑在淀粉類食品生產中的應用 淀粉可以通過水解作用生成糊精、低聚糖、麥芽糊精和葡萄糖等產物。這些產物又可進一步轉化為其他產物。在這些產物的生產中，已廣泛應用各種酶。 在淀粉類食品的加工中，多種酶被廣泛地應用，其中主要的有a-淀粉酶、-淀粉酶、糖化酶、支鏈淀粉酶、葡萄糖異構酶等?，F在國內外葡萄糖的生產絕大多數是采用淀粉酶水解的方法。酶法生產葡萄糖是以淀粉為原料，先經a-淀粉酶液化成糊精，再利用糖化酶生成葡萄糖。果葡糖漿是有葡萄糖異構酶催化葡萄糖異構化生成果糖，而得到含有葡萄糖和果糖的混合糖