1、PI染色法測細胞周期一） 細胞DNA含量檢測細胞固定后用PI （Propidium iodide碘化丙啶），染色，因為PI特異性結(jié)合于細胞DNA，熒光強度與PI的結(jié)合量呈良好的線性關系，根據(jù)這個原理，可測出細胞的DNA含量。用于細胞周期、細胞倍體以及凋亡的檢測。 單參數(shù)直方圖圖中2N代表G0/G1期細胞，4N代表G2/M期細胞，兩者中間代表S期細胞。這是以2倍體和4倍體細胞為主的流式DNA圖 DNA細胞周期分析細胞周期G2MG0G1s 200 400 600 8001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量細胞數(shù)量2N4N2倍體異倍體4倍體腫瘤組織中的各種DNA倍體含量與凋亡關系DNA亞G1

2、峰的檢測：利用PI染色，檢測具有亞G1期DNA含量的細胞比例，代表凋亡細胞數(shù)。凋亡過程中，細胞內(nèi)核酸酶的釋放，將DNA降解，分解成小的片段，在標本制備中的固定處理時，細胞膜的完整性被破壞，使細胞內(nèi)降解的DNA片段從細胞內(nèi)流出，造成總體DNA含量減少，成為亞2倍體。2. 凋亡研究在G0/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰，即凋亡峰。檢測調(diào)亡，可進行抗腫瘤藥物研究和某些因素對細胞的損傷機理的研究。Annexin V Assay圖 Annexin V/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死Date acquired: 14-Jan-03File: 7Gy 4hr.001Source: dongboDIPLOID: 1

3、00.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04Apoptosis: 13.66 % Mean: 27.48 圖 FCM測試細胞周 期分布和凋亡根據(jù)凋亡細胞的特點來檢測在形態(tài)上，早期細胞核固縮，染色體邊集在核膜內(nèi)側(cè)顯新月體形、核碎裂；細胞漿和細胞器密度增高、細胞體積變小；細胞膜皺折卷曲，但早期細胞膜的完整性未受到破壞凋亡細胞的FSC ？SSC ？細胞壞死時，細胞腫脹，F(xiàn)SC ？，SSC ？正常人靜止體細胞有46條染色體，相當于7.10-12

4、 pg DNA/細胞核，我們稱之為二倍體細胞，而正常增殖細胞則存在不同的DNA含量。在細胞周期(G0，G1，S，G2 ，M)的各個時期，DNA含量隨各時相呈現(xiàn)出周期性的變化：在G1期，細胞開始RNA和蛋白質(zhì)的合成，但DNA含量仍保持二倍體；進入S期后，DNA開始合成，這時細胞核內(nèi)DNA的含量介于G1和G2期之間；當DNA復制結(jié)束成為4倍體時，細胞進入G2期，G2期細胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質(zhì)，直到進入M期，因此，單純從DNA含量無法區(qū)分G2期和M期；一旦有絲分裂發(fā)生，細胞分裂成兩個子細胞，這兩個子細胞或者進入下一個細胞周期，或者進入靜止期(G0期)，而G0期從DNA含量上同樣無法與G1期區(qū)分。因

5、此，整個復制周期可以描述為G0/G1，S，G2/M期。通過核酸染料標記DNA，并由流式細胞儀進行分析，可以得到細胞各個時期的分布狀態(tài)，計算出G0/G1，S及G2/M的百分含量，了解細胞的增殖能力；結(jié)合DNA指數(shù)分析，還可進行凋亡、異倍體等檢測。G2MG0G1s0 200 400 600 8001000G0G1sG2MDNA AnalysisDNA contentCount2N4NNormal Cell Cycle 細胞濃度及質(zhì)量要求單細胞和核的上機濃度應約106/ml。濃度太低，上機時樣本的流速不得不提高，這樣就會影響檢測的CV。濃度太高，則可能導致染料的相對不足，最終使染色不飽和，同樣影響C

6、V和檢測結(jié)果。制備完成后的標本應用光學顯微鏡檢查其質(zhì)量：細胞是否聚集或過多的碎片。染料的選擇取決于流式激光的配置。488nm的激光下應用PI(碘化丙啶)，由于PI也與RNA結(jié)合，所以分析前樣本應用Rnase處理.。重要的是染料要足夠，以保證飽和結(jié)合。PI的推薦濃度是至少20ug/106 個細胞。其最佳濃度為50ug/106 個細胞。操作步驟 取一瓶生長期的A549細胞，倒掉瓶中舊的培養(yǎng)液，加入3mlPBS，細胞生長面在下輕輕晃動細胞瓶，然后去掉液體，加入1ml胰蛋白酶消化15分鐘（以鏡下觀察決定）加入5mlPBS輕輕吹打細胞生長面，制成細胞懸液，將細胞懸液移至15ml離心管中1500rpm離心5min，去上清。加入500ulPBS輕輕吹打細胞團成細胞懸液，在旋渦狀態(tài)下逐滴加入2ml-2095%冷乙醇，混勻后固定30min。加入5mlPBS，1500rpm離心5min，去上清液。加入5mlPBS重懸細胞，1500rpm離心5min，去上清液。加入800ulPI染液，用槍輕輕吹打細胞團，混勻，室溫避光染色30min上機檢測。影響熒光染色的因素 溫度：溫度高于20時，即出現(xiàn)溫度淬滅。2、P