1、1微生物菌種鑒定與保藏微生物菌種鑒定與保藏柳志強柳志強浙江工業大學生物工程研究所浙江工業大學生物工程研究所134861184632內容1.菌種篩選2.菌種鑒定3.菌種保藏3微生物代謝產物的平板檢測方法有機酸有機酸: 檸檬酸:pH指示劑的顏色變化,或摻入瓊脂平板的碳酸鈣的溶解.胞外酶胞外酶:1.淀粉酶:由碘指示的可溶性淀粉的液化2.蛋白酶:酪蛋白的溶解3.脂酶:乳化的三丁酸甘油酯的消化,清除或向橄欖油瓊脂中添加0.05-0.25%的OsO4溶液4.果膠酶:果膠凝膠的液化(1.5%的聚果膠酸鈉),多糖沉淀劑5.彈性蛋白酶:彈性蛋白的溶解6.核酸酶(DNA,RNA):未水解的核酸的沉淀,酸過量時可見

2、混濁.或者氮蒽橙熒光和紫外熒光7.磷酸脂酶C:卵磷脂平板的混濁圈8.磷酸脂酶A:卵磷脂平板的透明圈9.纖維素酶:纖維素平板的透明圈10.酯酶:氯化鈣和Tween20釋放出的月桂酸反應生成月桂酸鈣沉淀.或者7-羥-4甲基香豆素熒光反應. DNA酶:亞甲胺藍的DNA熒光變化 過氧化酶:噴灑對-茴香堿-過氧化氫酶抑制劑酶抑制劑:(用含酶的瓊脂平板上的抑制圈篩選)1.胰蛋白酶抑制劑:2.蛋白酶抑制劑 其他的代謝物其他的代謝物:1.脂類. 酵母的脂類營養缺陷型的生長譜來撿出2 . N A D : 以 豬 流 感 嗜 血 菌 （haemophilus inflluenzae ）的生長譜來撿出3.雌激素:噴

3、灑對硝基苯重氮鹽 （1%在50%乙酸中）形成紅色撿出4.chlorostatin: Euglena gracilis 褪綠圈 4567影印法8顯微鏡 第一代 第二代 第三代9細菌的形態和結構觀察在顯微鏡下觀察細菌個體的形態細菌形態受培養時間、培養基成分、濃度、培養溫度、培養時間等發生變化。10 細菌菌落大多表面光滑濕潤，有光澤，一般菌落較小，質地顏色均勻，同培養基結合不緊密。菌落特征與組成菌落的細胞結構、生長狀況、排列方式、好氣性和運動性直接相關。11 細菌個體微小，較透明，必須染色方可呈現。根據細菌個體形態觀察的不同要求，可將染色分為3種類型：簡單染色、鑒別染色、特殊染色。12 放線菌菌落在

4、培養基上著生牢固，與基質結合緊密，難以用接種針挑取。 放線菌細胞一般呈分枝無隔的絲狀，菌絲體分為在培養基內部的基內菌基內菌絲絲和伸出培養基表面的氣生菌絲氣生菌絲。氣生菌絲上部分化成孢子絲，呈螺旋狀、波浪狀或分枝狀。菌絲呈各種顏色，有的能分泌水溶性色素到培養基內。孢子絲長出孢子，孢子形狀各異。由于孢子的存在使菌落表面呈干粉狀。鏈霉菌13 霉菌是由交織在一起的菌絲體構成。菌絲呈管狀，有的有橫隔將菌絲分割為多細胞（如青霉、曲霉），有的菌絲沒有橫隔（如毛霉、根霉）。菌絲直徑比一般細菌和放線菌菌絲大幾倍到幾十倍。菌落形態較大，質地疏松，顏色各異，有絲狀、絨毛狀或蜘蛛網狀的菌絲體。 將菌絲體放在水中易變形

5、，將其置于乳酸石炭酸溶液中，保持菌絲體原形。14幾類酵母的菌落形態1.釀酒酵母2.產骯假絲酵母3.出芽短梗霉4.多孢絲抱酵母5.莢復膜孢酵母6.解脂復膜孢酵母7.季也蒙有孢漢遜酵母8.碎囊漢遜酵母9.卡氏酵母10.魯氏酵母11.深紅酵母12.玫紅法佛酵母13.大型羅倫隱球酵母14.美極梅奇酵母15.淺紅酵母1516一些鑒別培養基17 來源于不同微生物的抗生素放線菌產生放線菌產生 鏈霉素、紅霉素、四環素、利福霉素鏈霉素、紅霉素、四環素、利福霉素 慶大霉素、麥迪霉素、林可霉素等慶大霉素、麥迪霉素、林可霉素等真菌產生真菌產生 青霉素、頭孢菌素青霉素、頭孢菌素C C等等細菌產生細菌產生 多粘菌素、桿菌

6、肽等多粘菌素、桿菌肽等 目前已篩選出抗生素達目前已篩選出抗生素達90009000種以上，每年還種以上，每年還新增百余種。投入生產的僅百余種。新增百余種。投入生產的僅百余種。菌種菌種發酵工業的核心發酵工業的核心18Current Methods of Identification19BIOLOG自動微生物鑒定系統20檢測原理 BIOLOG以檢測微生物細胞利用不同碳源進行新陳代謝過程中產生的酶與四唑類物質（如TTC、TV）發生顏色反應和濁度差異為基礎，運用獨有的顯型排列技術檢測出每種微生物的特征指紋圖譜，在大量試驗和數學模型基礎上，建立起指紋圖譜與微生物種類相對應的數據庫。檢測時通過智能軟件將待鑒

7、定微生物的圖譜與數據庫參比，即可得出鑒定結果。21鑒定步驟分離純化分離純化平板擴大培養平板擴大培養制備菌懸液制備菌懸液調整濁度調整濁度接種培養接種培養獲取結果獲取結果22The Bacterial Identification ProcessStep 1Step 2Step 3Step 4Step 5Isolate a pure culture on Biolog mediaDo a Gram stain and determine testingprotocolPrepare inoculum at specified cell densityInoculate and incubate M

8、icroPlateRead MicroPlate and determine ID23The Fungi Identification ProcessStep 1 Step 2 Step 3 Step 4 Step 5 Isolate a pure culture on Biolog media Harvest spores from the Fungi Prepare inoculum at specified cell density Inoculate and incubate MicroPlate Read MicroPlate every 24 hours and determine

9、 Identification 24Pure Cultures are ImportantKrieg, Bergeys Manual, 198625用木制接種棒挑用木制接種棒挑取分離良好的單取分離良好的單菌落菌落 26BIOLOG常用消耗品Microlog1Microlog2Microlog3(Microstation)培養基培養基BUG，BUABUG，BUABUG，BUA，BUY鑒定板鑒定板GN2,GP2,ANGN2,GP2,ANGN2,GP2,AN,YT,FF接種液接種液GN/GP-IFAN-IFGN/GP-IFAN-IFGN/GP-IFAN-IF,FF-IF其它通用消耗品其它通用消耗品疏

10、基乙酸鈉，水楊酸鈉，試管架，吸嘴，加樣槽，一次性疏基乙酸鈉，水楊酸鈉，試管架，吸嘴，加樣槽，一次性移液管，長棉簽，木制接種棒。移液管，長棉簽，木制接種棒。27微生物鑒定（95種碳源）微生物研究GN2鑒定革蘭氏陰性好氧菌GP2鑒定革蘭氏陽性好氧菌AN 鑒定厭氧菌YT 鑒定酵母菌FF 鑒定絲狀真菌SFN2用于革蘭氏陰性放線菌和真菌代謝研究SFP2用于革蘭氏陽性放線菌和真菌代謝研究ECO用于微生物特性和群落分析研究（31）MT2用于微生物代謝研究（不含碳源）ES 用于埃希氏大腸桿菌沙門氏菌的研究 （95種碳源）鑒定板種類282930Electron micrograph of strain ZJB-

11、05174 cells 31分子遺傳學鑒定分子遺傳學鑒定 32Genomic DNA extraction 33Primers design 16S/18S rDNA sequence amplification34Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)35DNA sequencing machines use fluorescent dideoxynucleotides363738394041 1001009093505924440.01 Bacillus aquimaris AY505499 Bacillus methanolicus

12、AB112729 Bacillus firmus EF032672 Bacillus oleronius AY988598 Bacillus subtilis ZJB-063 DQ474759 Bacillus subtilis AB232386 Bacillus atrophaeus isolate SCH0408 AY881241 Bacillus carboniphilus AB021182 Bacillus pseudomycoides AF013121 Bacillus indicus AJ583158 Sporolactobacillus inulinus SPO16SRR23 4

13、2 10a 1001001001007610010096100100687210056100721000.05 Cryptococcus adeliensis strain LEVX01 (DQ269445) Cryptococcus adeliensis strain RKI 456/93 (AY733078) Cryptococcus albidus var. ovalis strain CBS5810 (AF145329) Cryptococcus antarcticus strain CBS7687 (AF145326) Cryptococcus magnus (AY188384) C

14、ryptococcus vishniacii (AB032689) Rhodotorula mucilaginosa (DQ402533) Rhodosporidium kratochvilovae (DQ402534) Rhodotorula glutinis (AM160642) Itersonilia perplexans isolate AFTOL-ID 1896 (DQ667163) Xanthophyllomyces dendrorhous strain ATCC 24261 (DQ661025) Xanthophyllomyces dendrorhous strain KBP 2

15、604 (DQ661026) Xanthophyllomyces dendrorhous strain ATCC 24229 (DQ661023) Phaffia rhodozyma strain ZJB 00010 (DQ999084) Phaffia rhodozyma strain CBS 5905 (AF139629) Tricholoma aurantium isolate OUC99349 (DQ367919) Tricholoma saponaceum var. saponaceum isolate OUC99343 (DQ370440) Cyphellostereum laev

16、e isolate AFTOL-ID 982 (DQ486699) Phellinus linteus strain SFC 20001106-7 (AF534070) Phellinus baumii strain SFC 960405-4 (AF534068) 43微生物菌種保藏及其專利申請 按照1977年4月28日各國于布達佩斯簽訂于1980年9月26日修正的國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約的解釋， “微生物菌種保藏”的概念是：“向接收與受理微生物的國際保存單位送交微生物或由國際保存單位貯存此種微生物，或兼有上述送交與貯存兩種行為”。 如果發明涉及新的微生物、微生物學方法或者

17、其產品，而且使用的微生物是公眾不能得到的，在申請專利前或最遲在申請日，必須按各國的專利法的有關規定對微生物進行保藏，申請專利時還需提供相應的申請文件。 44國際承認用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約 1.締約國允許或要求保存用于專利程序的微生物的, 應承認為此種目的而在任一國際保存單位所做的微生物保存。這種承認應包括承認由該國際保藏單位說明的保存事實和交存日期，以及承認作為樣品提供的是所保藏的微生物樣品。 2.任一締約國均可索取由國際保藏單位發出的 (1) 項所述保藏的藏單副本。 45我國專利法還應辦理下列手續1.在申請日前或者最遲在申請日，將該微生物菌種提交專利局指定的微生物菌種保藏單位保

18、藏，并在申請時或者最遲自申請日起三個月內提交保藏單位出具的保藏證明和存活證明；期滿未提交證明的，該菌種被視為未提交保藏；2.在申請文件中，提供有關微生物特征的資料；3.涉及微生物菌種保藏的專利申請應當在請求書各說明書中寫明該微生物的分類命名（注明拉丁文名稱）、保藏該微生物菌種的單位名稱、地址、保藏日期和保藏編號；申請時未寫明的，應當自申請日起三個月內補正；期滿未補正的，該菌種被視為未提交保藏。 4647對基因的占有方式是“基因專利” 基因專利保證了專利擁有者對基因應用領域的高度壟斷，其潛在經濟價值和高額回報使得各國的研究機構和大小公司紛紛投入巨額資金。難以想象，如果沒有專利的保護，制藥公司還會

19、不會對基因開發下這么大的賭注，還會不會有基因相關產品走向市場。正是因為基因專利所賦予的高度壟斷，生物技術領域每一項重要產品的問世幾乎都會引來激烈的專利之爭。 48基因專利的商業價值 基因專利是研制開發相關產品的基礎，基因專利的權利人不僅可以通過專利合作或轉讓獲得收益，而且還可以從基于該基因專利的基因產物以及其他衍生產品后期銷售收入中按一定比例提成。一個具有重要功能的疾病或產物相關基因的專利，轉讓價值一般以千萬美元計，而以此開發的基因藥物年銷售額可高達幾億至幾十億美元。 49基因藥靶的價值 1998年9月，Millennium公司與Bayer公司簽訂了五年的基因藥物合作協議，Bayer公司將向M

20、illennium支付總計4.65億美元(包括14%的股權投資)費用，委托Millennium公司開發225種基因藥靶，平均每個基因藥靶的價值為207萬美元。 促紅細胞生成素EPO：美國Amgen公司依賴EPO基因專利的開發應用，從一個瀕臨破產的企業成為美國生物工程醫藥領域的領頭羊，其EPO1998年的銷售收入達到13.6億美元，而EPO的全球市場現已達到34億美元的銷售額。 50基因專利的法律效力 基因專利受法律的保護，專利侵權將要受到法律的制裁。而且，專利授予與否的問題也要服從于法律。 HIV受體專利基因專利的壟斷性曾引起轟動，2000年2月16日美國主要從事人類基因測序和商業化開發的人類

21、基因組科技股份有限公司(HGS)宣布：她向美國專利和商標局(PTO)成功申請了一個在HIV(艾滋病病毒)感染中起關鍵作用的基因的專利，該基因編碼一個稱作CCR5的細胞表面受體蛋白，該蛋白是HIV病毒侵入人體細胞所必需結合的位點。HGS指出：“該專利覆蓋了艾滋病治療的關鍵點” ，HGS已授權其制藥業的合作伙伴開發艾滋病治療類藥物，HGS本身也試著進行一些對付HIV感染的有關抗體的研究。HGS預計：“以CCR5為藥靶開發的新藥，包括艾滋病治療類藥物以及抗潰瘍和抗過敏類藥物，每年的銷售額能達到400億美元。”消息公布后，HGS股價當天創出新高，達到188美元/股，一天內漲幅高達21%。 51HGS僅

22、僅因為對CCR5基因測了序，就獲得了基于CCR5的有關專利權，而1996年那些首先發現“HIV通過與CCR5受體結合而侵染人體免疫細胞”的科學家以及那些在愛滋病研究領域做出了巨大貢獻的科學家，卻因在專利申請上比HGS晚了一步而無法享用基于CCR5基因的有關專利。科學家們認為“專利局把CCR5基因的潛在商業價值優先給予了一個只是做些基因測序等輔助工作的公司，而不授予為識別該受體、研究其功能做了大量科研工作的科學家，實在不太公平。”專利局的態度是，他們仍然可以受理其它的專利。但專利之間的相互交叉和覆蓋勢必會產生碰撞，難免帶來嚴重的法律問題。 然而，HGS并不認為她僅僅是通過基因測序而獲得了CCR5

23、的優先權，她是以測序結果為切入點，通過基因數據庫的計算機分析推測基因的功能，然后再通過生物學試驗進行基因功能的研究和相關藥物的開發的。不過，HGS承認她在提交CCR5專利申請的時候并不知道CCR5與艾滋病之間的關系。HGS認為發現CCR5生物學功能的科學家們應該得到認可，HGS將在科研方面與科學家們共享CCR5的有關數據和試劑，但在相關藥物開發方面，HGS是要嚴格執行其專利權利的。 由此可見，誰擁有了基因專利，誰就擁有了該基因所有用途的獨占性開發權，實現的將是對整個產業的壟斷。 52生物技術專利戰略 當今全球性經濟競爭是一種以科技競爭為中心的角逐，而最先進的科技發明信息有 90被收集在專利文獻

24、中，專利保護對鼓勵工業領域的創造和促進產品的開發和銷售起著重要作用。因為創造性受到專利法的保護，所以，企業就愿意投資研究新技術，開發新產品。 近年來，各國科學家們也深切地體會到，傳統的科學宗旨已讓位于自我利益，擁有專利和對專利的追求將激發新的發明創造，從發明創造中獲得公共的關注和經濟資助變成了科學研究的原動力。西方大公司是世界上發明專利的主要申請者和利用者，其專利戰略就是如何有目的、有效地利用這一制度。 5354定義定義 菌種保藏菌種保藏是指在廣泛收集實驗室和生產菌種、菌是指在廣泛收集實驗室和生產菌種、菌株的基礎上，將它們妥善保藏，使之達到不死、不衰、株的基礎上，將它們妥善保藏，使之達到不死、

25、不衰、不污染以便于研究、交換和使用的目的。不污染以便于研究、交換和使用的目的。 第二節第二節 工業微生物菌種的保藏工業微生物菌種的保藏55 菌種保藏主要是根據菌種的生理生化特點生理生化特點，人工創造條件，使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低生長代謝活動盡量降低，以減少其變異減少其變異。一般可通過保持培養基營養成分在最低培養基營養成分在最低水平，缺氧狀態，干燥和低溫，使菌種處于水平，缺氧狀態，干燥和低溫，使菌種處于“休眠休眠”狀態，抑制其繁殖能力狀態，抑制其繁殖能力。 一種好的保藏方法，首先應能長期保持菌種原有的優良性狀不變。 菌種保藏的原菌種保藏的原理理56 菌種保藏的方法很多，一般有下面幾種：

26、菌種保藏的方法很多，一般有下面幾種：A 斜面冰箱保藏法斜面冰箱保藏法 斜面保藏是一種短期、過渡的保藏方法斜面保藏是一種短期、過渡的保藏方法，用新鮮斜面接種后，置最適條件下培養到菌體或孢子生長豐滿后，放在4冰箱保存。一般保存期為三個月到六個月冰箱保存。一般保存期為三個月到六個月。57B 沙土管保藏法沙土管保藏法 這是國內常采用的一種方法。適合于產孢子或芽孢產孢子或芽孢的微生物。制備方法制備方法：首先，將沙與土洗凈烘干過篩洗凈烘干過篩后，按沙與土的比例為按沙與土的比例為l 2 l混合均勻混合均勻，分裝于小試管中，裝料高度約為1厘米厘米左右左右，121C間歇滅菌三次間歇滅菌三次，滅菌試驗合格后烘干備用。一般沙用沙用80目過篩目過篩，土用土用30100目過篩目過篩。其次，將斜面孢子制成孢子懸浮液接入沙土管中或將斜面孢子刮下直接與沙土混合直接與沙土混合，于干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱內保存。一般保存期為保存期為1年左右年左右。 58C、石蠟油封存法、石蠟油封存法 向培養成熟的菌種斜面上，倒入一層滅過菌的石蠟油，用量要高出斜面一厘米高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不能利用石蠟油作碳源的細菌、霉菌、通用于不能利用石蠟油作碳源的細菌、霉菌、酵母等微生物的保存酵母等微生物的保存。 保存期約一年左右。保存期約一年左右。59D、真空冷凍干燥保減法、真空