1、cDNA文庫構建(CLONTECH)cDNA文庫構建5RACE(CLONTECH)3RACE(CLONTECH)4.2 基因超表達基因超表達 通過增加基因的通過增加基因的拷貝數拷貝數和采用和采用強啟強啟動子動子促使基因促使基因超表超表達達,致使受體表現出致使受體表現出生長與發育的異常生長與發育的異常,來研究基因的功能來研究基因的功能. 4.3反義反義RNA 反義反義RNA是由基因的負鏈編碼是由基因的負鏈編碼,可與可與正義正義RNA (sense RNA)或或DNA 編碼順序編碼順序結合結合,干擾干擾mRNA 的轉錄的轉錄,加工和轉運加工和轉運,調調控基因的表達控基因的表達.v構建反義RNA 表

2、達載體: 將全目的基因或部分目的基因反向插入表達載體 轉化目標生物 獲得轉基因個體或品系 分析轉基因植株在生理、生化、形態等方面的變異 判別目的基因的功能p3301-HbF(11030bp)300bpHbF35S proNco ISpe I Bst EIIp3301-HbR(11030bp)300bpHbR35S proNco IBst EII正義表達載體反義表達載體v反義RNA 作用機理： A 干擾翻譯的起始與延伸，可與翻譯起始順序及編碼序列結合形成雙鏈RNA，隨之被細胞降解。 B 與mRNA 的引導順序結合，阻止核糖體的附著，使翻譯無法啟動。 C 反義RNA與mRNA形成雙鏈分子后，使RN

3、A多聚酶脫離模板,轉錄終止。4.4 RNAi干涉 RNAi干涉是通過雙鏈RNA的介導,特異性地降解相應序列的mRNA,從而阻斷相應基因表達的轉錄后水平的基因沉默機制.RNAi 作用機理A dsRNA核酸內切酶Dicer被激活,它把dsRNA加工成2125 個核苷酸長的RNA鏈;B 這些小片段RNA(siRNA)作為另一個核糖核酸復合體RISC(RNA-induce silencing complex,RNA誘導沉默復合體)的指引物,結合到RISC上,使之識別并降解mRNA,從而導致與雙鏈RNA同源的基因沉默;vRNAi設計方法及應用A Fraser 合成與開放讀碼框相對應的雙鏈RNA或利用細菌

4、克隆表達這些雙鏈RNA微量注射和喂食干擾同源基因的表達B Chuang 等設計出嵌合體結構 連接強啟動子大量表達雙鏈mRNA干擾同源基因的表達HbF基因的RNAi載體構建RNAi技術的優缺點vRNAi最根本的特點是特異性vRNAi具有特殊的穿越能力,如將雙鏈RNA注射在線蟲性腺里,它也會干擾到體細胞里的基因表達,而且干擾作用會傳給后代;vRNAi對一些低水平表達的基因的RNAi現象并不明顯,而且幾個有相同或相似序列的基因, RNAi也會同時作用與它們.4.5 酵母雙雜交（酵母雙雜交（yeast two-hybridization）v原理： 其原理涉及轉錄因子與啟動子之間的互作。 正常條件下：

5、轉錄因子 （包括兩個功能區域） 結合功能域同基因上游的區段結合 激活功能域激活RNA多聚酶 將基因轉錄為mRNA v酵母雜交系統中： 融合表達載體1 融合表達載體2DNA結合功能域+目的片段激活功能域+ 多種未知cDNA 融合表達載體1同一細胞 融合表達載體2 形成聚合物，啟動報告基因的表達表達載體共轉化4.6 其他方法v構建轉座子突變庫v噬菌體外顯v內含子歸槽突變v開放讀框順序標簽第四講 基因組序列詮釋5. 轉錄物組6. 蛋白質組問題問題v細胞周期的不同時期細胞周期的不同時期v個體發育不同階段個體發育不同階段v不同的器官和組織不同的器官和組織v不同的外界環境下不同的外界環境下 各種基因的表達

6、與否、量的差異、表達各種基因的表達與否、量的差異、表達部位如何部位如何5. 5. 轉錄物組轉錄物組5.1 Northern5.1 Northern雜交雜交v雜交主要步驟： 提取總RNA（不同組織、不同器官） 變性電泳 制備目的基因探針 轉移尼龍膜 （放射性 或 化學標記法） 雜 交 掃描或放射自顯影 依據雜交信號的強弱、有無判斷基因的表達部位、 表達量、表達時期等 5.2 SAGESAGE （serials analysis of gene expression）基因表達系列分析 1995 Velculescu 及其同事年創立1. 將5g含有oligo dT（引物）的磁珠與RNA混合。2. 合

7、成雙鏈cDNA。 3. 用Nla酶消化形成一條鏈末端有標簽的產物。 4. 將樣品分成兩份，連接成含有識別序列的產物，以備用BsmF1消化。5. 用Mme I切割每一個樣品形成約60bp的標簽。SAGE 步驟步驟6. 延伸5秒，連接成約130bp的雙鏈標簽。 7. PCR擴增。8. 用Nla 酶切130bp產物釋放34bp雙鏈標簽。9. 連接片斷形成串聯體。 10. 克隆到pZErO-1+里，并測序。 SAGE實例實例SAGESAGE特點：特點：v進行轉錄物組研究，也就是轉錄水平的研究；v通過快速和詳細分析成千上萬個EST來尋找出表達豐度不同的SAGE標簽序列，從而接近完整地獲得基因組的表達信息

8、；v SAGE區別于差異顯示、消減雜交等其它技術的主要特點是可用于尋找那些較低豐度的轉錄物，最大限度地收集基因組的基因表達信息，這使之成為從總體上全面研究基因表達、構建基因表達圖譜的首選策略；vSAGE可用于在不同環境、不同生理狀態及不同生長階段的細胞和組織表達圖譜構建，對不同狀態下基因表達水平的定量或定性比較，特別是對疾病組織與正常組織的比較發展迅速； SAGE SAGE 技術的主要理論依據：技術的主要理論依據：v來自轉錄物內特定位置的一小段寡核苷酸序列（911bp）含有鑒定一個轉錄物特異性的足夠信息，可作為區別轉錄物的標簽（tag）；v通過簡單的方法將這些標簽串聯在一起，形成大量多聯體（c

9、oncatemer），對每個克隆到載體的多聯體進行測序，并應用SAGE軟件分析，可確定表達的基因種類，并可根據標簽出現的頻率確定基因的表達風度（abundance）。 5.3 基因芯片v何為生物芯片? 生物芯片主要指通過平面微細加工技術在固體芯片表面構建的微流體分析單元和系統，以實現對細胞、蛋白質、核酸以及其他生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。 它是繼大規模集成電路之后的又一次具有深遠意義 的科學技術革命。D N A C h ip s P ro te in C h ip sL a b C h ip sB io c h ip s基因芯片基因芯片基因芯片的主要應用基因芯片的主要應用基因表達檢測

10、 擬南芥、酵母基因表達研究等突變檢測 BRCA基因外顯子、CFTR基因、-地中海貧血、酵母突變菌株、HIV-1逆轉錄酶及蛋白酶基因等的突變檢測等基因組多態性分析 人類基因組單核苷酸多態性的鑒定及分系析，人線粒體16.6kb基因組多態性的研究等基因文庫作圖 通過確定重疊克隆的次序從而對酵母基因組進行作圖 Expression ChipsGenomic ChipsSequencing ChipsDNA Chips基因芯片研制的總體藍圖基因芯片研制的總體藍圖 研制方向的確定基因組序列分析與待檢基因探針序列的確定檢測樣品 的制備探針陣列的準備檢測設備的研制雜交檢測與數據分析表達芯片的制備檢測流程表達芯

11、片的制備檢測流程v表達芯片實例PCR法從外周血淋巴細胞cDNA文庫擴增產物擴增產物點樣于包被的玻片上DNA 芯片熱擊T細胞cDNA未處理的細胞cDNA 雜交 雜交激光共聚焦掃描發現17個差異表達基因,11個被熱誘導,6個被熱抑制,發現其中3個為未發現的新基因6. 6. 蛋白質組蛋白質組 DNAmRNAPROTEIN(活活性性)轉錄水平調控(transcriptional control)翻譯水平調控(Translational control)翻譯后水平調控(Post-translational control)6.1蛋白質組(Proteome)v Proteome來源于 Proteins和

12、genome 兩個詞的組合,意思是Proteins expressed by a genome,即基因組表達的蛋白質.v蛋白質組定義蛋白質組定義 廣義上是指某種細胞或組織中基因組表達的所有蛋白質廣義上是指某種細胞或組織中基因組表達的所有蛋白質; ; 狹義上狹義上, , 可以指不同時期細胞內蛋白質的變化可以指不同時期細胞內蛋白質的變化. .v蛋白質組學定義蛋白質組學定義 研究蛋白質組結構和功能的領域稱為蛋白質組學研究蛋白質組結構和功能的領域稱為蛋白質組學. .v蛋白質組學的研究內容蛋白質組學的研究內容: : 分析全部蛋白質組所有成分以及它們的數量分析全部蛋白質組所有成分以及它們的數量; ; 確定

13、各種組分所在的空間位置、修飾方法、互作機制、確定各種組分所在的空間位置、修飾方法、互作機制、生物活性和特定功能等生物活性和特定功能等 6.2 蛋白質組分析復雜性v蛋白質有許多加工方式,如磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化等；vmRNA 的可變剪接、程序性移碼和可控突變，1個基因可編碼許多不同的蛋白質，常常表現為組織特異性；v蛋白質之間存在大量的相互作用，如形成同源或異源二聚體、三聚體或多聚體，不同的結合狀態有不同的活性；v1種蛋白質可參與多種反應，或多種蛋白質參與1種反應。6.36.3蛋白質組研究技術蛋白質組研究技術 蛋白質組主要研究技術：蛋白質組主要研究技術： 雙向電泳雙向電泳 生物質譜技術生物

14、質譜技術 蛋白質芯片蛋白質芯片 酵母雙雜交酵母雙雜交6.3.1 6.3.1 雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳 樣品制備（包括蛋白質的溶解、變性及還原，從而去除非蛋白質雜質等） 第一向等電聚焦（根據蛋白質電荷差異進行分離） 第二向SDS-PAGE（以蛋白質分子量差異為基礎）蛋白質的檢測（用考馬斯亮藍、銀染、銅染等方法）圖譜數字化分析（圖象掃描、確定每個蛋白質點的等電點和分子量，尋找差異蛋白）6.3.2 蛋白質組分析技術 主要蛋白質組分析技術： 質譜方法 蛋白質序列分析 氨基酸組成分析v質譜技術的基本原理： 樣品分子離子化后，根據不同離子間質核比（m/z）的差異來分離并確定分子量。v質譜儀組成： 進樣裝置

15、、離子化源、質量分析器、離子檢測器和數據分析系統組成。v質譜技術在蛋白組研究中的應用：質譜技術在蛋白組研究中的應用：A 肽質譜和肽序列分析 蛋白質經雙向電泳后，分離到的蛋白質被切割下來，進行膠內酶解，或轉移到PVDF膜上，進行膜上膜解，然后上樣進行測序。 但目前質譜法還不能夠取代Edman降解法測序，可是其測定速度較快。B 鑒定翻譯后修飾的蛋白質鑒定翻譯后修飾的蛋白質 質譜可通過特征離子監測的方法很快確定磷酸化肽，通過串聯質譜確定磷酸化位點； 質譜可與蛋白酶解和糖苷酶酶解結合，尋找糖肽，鑒定糖基化位點； 質譜還參與糖鏈組成、結構甚至分支情況等的分析。 C 質譜技術的其他作用 質譜可對蛋白質二硫鍵進行定量和定位，分析蛋白質與蛋白質的相互作用，蛋白質與其他分子的相互作用，以及蛋白質的二級結構等。6.4蛋白質組數據庫的建立和生物信息學 數據庫的建立是蛋白質組研究的最重要的一個方面。 蛋白質的數據庫包括： 蛋白質序列數據庫 質譜數據庫 雙向電泳圖