1、cDNA文庫(kù)構(gòu)建(CLONTECH)cDNA文庫(kù)構(gòu)建5RACE(CLONTECH)3RACE(CLONTECH)4.2 基因超表達(dá)基因超表達(dá) 通過(guò)增加基因的通過(guò)增加基因的拷貝數(shù)拷貝數(shù)和采用和采用強(qiáng)啟強(qiáng)啟動(dòng)子動(dòng)子促使基因促使基因超表超表達(dá)達(dá),致使受體表現(xiàn)出致使受體表現(xiàn)出生長(zhǎng)與發(fā)育的異常生長(zhǎng)與發(fā)育的異常,來(lái)研究基因的功能來(lái)研究基因的功能. 4.3反義反義RNA 反義反義RNA是由基因的負(fù)鏈編碼是由基因的負(fù)鏈編碼,可與可與正義正義RNA (sense RNA)或或DNA 編碼順序編碼順序結(jié)合結(jié)合,干擾干擾mRNA 的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄,加工和轉(zhuǎn)運(yùn)加工和轉(zhuǎn)運(yùn),調(diào)調(diào)控基因的表達(dá)控基因的表達(dá).v構(gòu)建反義RNA 表

2、達(dá)載體: 將全目的基因或部分目的基因反向插入表達(dá)載體 轉(zhuǎn)化目標(biāo)生物 獲得轉(zhuǎn)基因個(gè)體或品系 分析轉(zhuǎn)基因植株在生理、生化、形態(tài)等方面的變異 判別目的基因的功能p3301-HbF(11030bp)300bpHbF35S proNco ISpe I Bst EIIp3301-HbR(11030bp)300bpHbR35S proNco IBst EII正義表達(dá)載體反義表達(dá)載體v反義RNA 作用機(jī)理： A 干擾翻譯的起始與延伸，可與翻譯起始順序及編碼序列結(jié)合形成雙鏈RNA，隨之被細(xì)胞降解。 B 與mRNA 的引導(dǎo)順序結(jié)合，阻止核糖體的附著，使翻譯無(wú)法啟動(dòng)。 C 反義RNA與mRNA形成雙鏈分子后，使RN

3、A多聚酶脫離模板,轉(zhuǎn)錄終止。4.4 RNAi干涉 RNAi干涉是通過(guò)雙鏈RNA的介導(dǎo),特異性地降解相應(yīng)序列的mRNA,從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制.RNAi 作用機(jī)理A dsRNA核酸內(nèi)切酶Dicer被激活,它把dsRNA加工成2125 個(gè)核苷酸長(zhǎng)的RNA鏈;B 這些小片段RNA(siRNA)作為另一個(gè)核糖核酸復(fù)合體RISC(RNA-induce silencing complex,RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體)的指引物,結(jié)合到RISC上,使之識(shí)別并降解mRNA,從而導(dǎo)致與雙鏈RNA同源的基因沉默;vRNAi設(shè)計(jì)方法及應(yīng)用A Fraser 合成與開(kāi)放讀碼框相對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA或利用細(xì)菌

4、克隆表達(dá)這些雙鏈RNA微量注射和喂食干擾同源基因的表達(dá)B Chuang 等設(shè)計(jì)出嵌合體結(jié)構(gòu) 連接強(qiáng)啟動(dòng)子大量表達(dá)雙鏈mRNA干擾同源基因的表達(dá)HbF基因的RNAi載體構(gòu)建RNAi技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)vRNAi最根本的特點(diǎn)是特異性vRNAi具有特殊的穿越能力,如將雙鏈RNA注射在線(xiàn)蟲(chóng)性腺里,它也會(huì)干擾到體細(xì)胞里的基因表達(dá),而且干擾作用會(huì)傳給后代;vRNAi對(duì)一些低水平表達(dá)的基因的RNAi現(xiàn)象并不明顯,而且?guī)讉€(gè)有相同或相似序列的基因, RNAi也會(huì)同時(shí)作用與它們.4.5 酵母雙雜交（酵母雙雜交（yeast two-hybridization）v原理： 其原理涉及轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子之間的互作。 正常條件下：

5、轉(zhuǎn)錄因子 （包括兩個(gè)功能區(qū)域） 結(jié)合功能域同基因上游的區(qū)段結(jié)合 激活功能域激活RNA多聚酶 將基因轉(zhuǎn)錄為mRNA v酵母雜交系統(tǒng)中： 融合表達(dá)載體1 融合表達(dá)載體2DNA結(jié)合功能域+目的片段激活功能域+ 多種未知cDNA 融合表達(dá)載體1同一細(xì)胞 融合表達(dá)載體2 形成聚合物，啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化4.6 其他方法v構(gòu)建轉(zhuǎn)座子突變庫(kù)v噬菌體外顯v內(nèi)含子歸槽突變v開(kāi)放讀框順序標(biāo)簽第四講 基因組序列詮釋5. 轉(zhuǎn)錄物組6. 蛋白質(zhì)組問(wèn)題問(wèn)題v細(xì)胞周期的不同時(shí)期細(xì)胞周期的不同時(shí)期v個(gè)體發(fā)育不同階段個(gè)體發(fā)育不同階段v不同的器官和組織不同的器官和組織v不同的外界環(huán)境下不同的外界環(huán)境下 各種基因的表達(dá)

6、與否、量的差異、表達(dá)各種基因的表達(dá)與否、量的差異、表達(dá)部位如何部位如何5. 5. 轉(zhuǎn)錄物組轉(zhuǎn)錄物組5.1 Northern5.1 Northern雜交雜交v雜交主要步驟： 提取總RNA（不同組織、不同器官） 變性電泳 制備目的基因探針 轉(zhuǎn)移尼龍膜 （放射性 或 化學(xué)標(biāo)記法） 雜 交 掃描或放射自顯影 依據(jù)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱、有無(wú)判斷基因的表達(dá)部位、 表達(dá)量、表達(dá)時(shí)期等 5.2 SAGESAGE （serials analysis of gene expression）基因表達(dá)系列分析 1995 Velculescu 及其同事年創(chuàng)立1. 將5g含有oligo dT（引物）的磁珠與RNA混合。2. 合

7、成雙鏈cDNA。 3. 用Nla酶消化形成一條鏈末端有標(biāo)簽的產(chǎn)物。 4. 將樣品分成兩份，連接成含有識(shí)別序列的產(chǎn)物，以備用BsmF1消化。5. 用Mme I切割每一個(gè)樣品形成約60bp的標(biāo)簽。SAGE 步驟步驟6. 延伸5秒，連接成約130bp的雙鏈標(biāo)簽。 7. PCR擴(kuò)增。8. 用Nla 酶切130bp產(chǎn)物釋放34bp雙鏈標(biāo)簽。9. 連接片斷形成串聯(lián)體。 10. 克隆到pZErO-1+里，并測(cè)序。 SAGE實(shí)例實(shí)例SAGESAGE特點(diǎn)：特點(diǎn)：v進(jìn)行轉(zhuǎn)錄物組研究，也就是轉(zhuǎn)錄水平的研究；v通過(guò)快速和詳細(xì)分析成千上萬(wàn)個(gè)EST來(lái)尋找出表達(dá)豐度不同的SAGE標(biāo)簽序列，從而接近完整地獲得基因組的表達(dá)信息

8、；v SAGE區(qū)別于差異顯示、消減雜交等其它技術(shù)的主要特點(diǎn)是可用于尋找那些較低豐度的轉(zhuǎn)錄物，最大限度地收集基因組的基因表達(dá)信息，這使之成為從總體上全面研究基因表達(dá)、構(gòu)建基因表達(dá)圖譜的首選策略；vSAGE可用于在不同環(huán)境、不同生理狀態(tài)及不同生長(zhǎng)階段的細(xì)胞和組織表達(dá)圖譜構(gòu)建，對(duì)不同狀態(tài)下基因表達(dá)水平的定量或定性比較，特別是對(duì)疾病組織與正常組織的比較發(fā)展迅速； SAGE SAGE 技術(shù)的主要理論依據(jù)：技術(shù)的主要理論依據(jù)：v來(lái)自轉(zhuǎn)錄物內(nèi)特定位置的一小段寡核苷酸序列（911bp）含有鑒定一個(gè)轉(zhuǎn)錄物特異性的足夠信息，可作為區(qū)別轉(zhuǎn)錄物的標(biāo)簽（tag）；v通過(guò)簡(jiǎn)單的方法將這些標(biāo)簽串聯(lián)在一起，形成大量多聯(lián)體（c

9、oncatemer），對(duì)每個(gè)克隆到載體的多聯(lián)體進(jìn)行測(cè)序，并應(yīng)用SAGE軟件分析，可確定表達(dá)的基因種類(lèi)，并可根據(jù)標(biāo)簽出現(xiàn)的頻率確定基因的表達(dá)風(fēng)度（abundance）。 5.3 基因芯片v何為生物芯片? 生物芯片主要指通過(guò)平面微細(xì)加工技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。 它是繼大規(guī)模集成電路之后的又一次具有深遠(yuǎn)意義 的科學(xué)技術(shù)革命。D N A C h ip s P ro te in C h ip sL a b C h ip sB io c h ip s基因芯片基因芯片基因芯片的主要應(yīng)用基因芯片的主要應(yīng)用基因表達(dá)檢測(cè)

10、 擬南芥、酵母基因表達(dá)研究等突變檢測(cè) BRCA基因外顯子、CFTR基因、-地中海貧血、酵母突變菌株、HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶基因等的突變檢測(cè)等基因組多態(tài)性分析 人類(lèi)基因組單核苷酸多態(tài)性的鑒定及分系析，人線(xiàn)粒體16.6kb基因組多態(tài)性的研究等基因文庫(kù)作圖 通過(guò)確定重疊克隆的次序從而對(duì)酵母基因組進(jìn)行作圖 Expression ChipsGenomic ChipsSequencing ChipsDNA Chips基因芯片研制的總體藍(lán)圖基因芯片研制的總體藍(lán)圖 研制方向的確定基因組序列分析與待檢基因探針序列的確定檢測(cè)樣品 的制備探針陣列的準(zhǔn)備檢測(cè)設(shè)備的研制雜交檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析表達(dá)芯片的制備檢測(cè)流程表達(dá)芯

11、片的制備檢測(cè)流程v表達(dá)芯片實(shí)例PCR法從外周血淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于包被的玻片上DNA 芯片熱擊T細(xì)胞cDNA未處理的細(xì)胞cDNA 雜交 雜交激光共聚焦掃描發(fā)現(xiàn)17個(gè)差異表達(dá)基因,11個(gè)被熱誘導(dǎo),6個(gè)被熱抑制,發(fā)現(xiàn)其中3個(gè)為未發(fā)現(xiàn)的新基因6. 6. 蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)組 DNAmRNAPROTEIN(活活性性)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控(transcriptional control)翻譯水平調(diào)控(Translational control)翻譯后水平調(diào)控(Post-translational control)6.1蛋白質(zhì)組(Proteome)v Proteome來(lái)源于 Proteins和

12、genome 兩個(gè)詞的組合,意思是Proteins expressed by a genome,即基因組表達(dá)的蛋白質(zhì).v蛋白質(zhì)組定義蛋白質(zhì)組定義 廣義上是指某種細(xì)胞或組織中基因組表達(dá)的所有蛋白質(zhì)廣義上是指某種細(xì)胞或組織中基因組表達(dá)的所有蛋白質(zhì); ; 狹義上狹義上, , 可以指不同時(shí)期細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變化可以指不同時(shí)期細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變化. .v蛋白質(zhì)組學(xué)定義蛋白質(zhì)組學(xué)定義 研究蛋白質(zhì)組結(jié)構(gòu)和功能的領(lǐng)域稱(chēng)為蛋白質(zhì)組學(xué)研究蛋白質(zhì)組結(jié)構(gòu)和功能的領(lǐng)域稱(chēng)為蛋白質(zhì)組學(xué). .v蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容: : 分析全部蛋白質(zhì)組所有成分以及它們的數(shù)量分析全部蛋白質(zhì)組所有成分以及它們的數(shù)量; ; 確定

13、各種組分所在的空間位置、修飾方法、互作機(jī)制、確定各種組分所在的空間位置、修飾方法、互作機(jī)制、生物活性和特定功能等生物活性和特定功能等 6.2 蛋白質(zhì)組分析復(fù)雜性v蛋白質(zhì)有許多加工方式,如磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化等；vmRNA 的可變剪接、程序性移碼和可控突變，1個(gè)基因可編碼許多不同的蛋白質(zhì)，常常表現(xiàn)為組織特異性；v蛋白質(zhì)之間存在大量的相互作用，如形成同源或異源二聚體、三聚體或多聚體，不同的結(jié)合狀態(tài)有不同的活性；v1種蛋白質(zhì)可參與多種反應(yīng)，或多種蛋白質(zhì)參與1種反應(yīng)。6.36.3蛋白質(zhì)組研究技術(shù)蛋白質(zhì)組研究技術(shù) 蛋白質(zhì)組主要研究技術(shù)：蛋白質(zhì)組主要研究技術(shù)： 雙向電泳雙向電泳 生物質(zhì)譜技術(shù)生物

14、質(zhì)譜技術(shù) 蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片 酵母雙雜交酵母雙雜交6.3.1 6.3.1 雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳 樣品制備（包括蛋白質(zhì)的溶解、變性及還原，從而去除非蛋白質(zhì)雜質(zhì)等） 第一向等電聚焦（根據(jù)蛋白質(zhì)電荷差異進(jìn)行分離） 第二向SDS-PAGE（以蛋白質(zhì)分子量差異為基礎(chǔ)）蛋白質(zhì)的檢測(cè)（用考馬斯亮藍(lán)、銀染、銅染等方法）圖譜數(shù)字化分析（圖象掃描、確定每個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的等電點(diǎn)和分子量，尋找差異蛋白）6.3.2 蛋白質(zhì)組分析技術(shù) 主要蛋白質(zhì)組分析技術(shù)： 質(zhì)譜方法 蛋白質(zhì)序列分析 氨基酸組成分析v質(zhì)譜技術(shù)的基本原理： 樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間質(zhì)核比（m/z）的差異來(lái)分離并確定分子量。v質(zhì)譜儀組成： 進(jìn)樣裝置

15、、離子化源、質(zhì)量分析器、離子檢測(cè)器和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)組成。v質(zhì)譜技術(shù)在蛋白組研究中的應(yīng)用：質(zhì)譜技術(shù)在蛋白組研究中的應(yīng)用：A 肽質(zhì)譜和肽序列分析 蛋白質(zhì)經(jīng)雙向電泳后，分離到的蛋白質(zhì)被切割下來(lái)，進(jìn)行膠內(nèi)酶解，或轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，進(jìn)行膜上膜解，然后上樣進(jìn)行測(cè)序。 但目前質(zhì)譜法還不能夠取代Edman降解法測(cè)序，可是其測(cè)定速度較快。B 鑒定翻譯后修飾的蛋白質(zhì)鑒定翻譯后修飾的蛋白質(zhì) 質(zhì)譜可通過(guò)特征離子監(jiān)測(cè)的方法很快確定磷酸化肽，通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜確定磷酸化位點(diǎn)； 質(zhì)譜可與蛋白酶解和糖苷酶酶解結(jié)合，尋找糖肽，鑒定糖基化位點(diǎn)； 質(zhì)譜還參與糖鏈組成、結(jié)構(gòu)甚至分支情況等的分析。 C 質(zhì)譜技術(shù)的其他作用 質(zhì)譜可對(duì)蛋白質(zhì)二硫鍵進(jìn)行定量和定位，分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用，以及蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)等。6.4蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和生物信息學(xué) 數(shù)據(jù)庫(kù)的建立是蛋白質(zhì)組研究的最重要的一個(gè)方面。 蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫(kù)包括： 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù) 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù) 雙向電泳圖