1、生物化學實驗考試試題細胞破碎 1 常用的細胞破碎的方法有哪些？ 機械法：研磨，高速搗碎機；物理法：反復凍溶，超聲波破碎，壓榨法；化學與生物化學法：自溶，溶脹法，酶解法，有機溶劑處理。 2 有機溶劑法破碎細胞原理，常用的有機溶劑有哪些 ？有機溶劑溶解細胞壁并使之失穩。比如笨、甲苯、氯仿、二甲苯及高級醇等 3 酶法破碎細胞原理：酶分解作用 4 反復凍融法破碎細胞原理：通過反復將細胞放在低溫下突然冷卻和室溫下融化達到破壁作用 層析技術 1.什么叫層析技術？層析技術是利用混合物中各組分理化性質的差別（分子親和力、吸附力、分子的形狀和大小、分配系數等），使各組分以不同程度分布在兩個相，其中一個是固定相，

2、另一個是流動相，從而使各組分以不同速度移動而使其分離的方法。 2、按層析過程的機理，層析法分哪幾類？按操作形式不同又分哪三類？根據分離的原理不同分類，層析主要可以分為吸附層析、分配層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等。按操作形式不同又分層析可以分為紙層析、薄層層析和柱層析。3.指出常用層析技術的應用范圍。 凝膠層析法：脫鹽；用于分離提純；測定高分子物質的分子量；高分子溶液的濃縮 離子交換層析法：主要用于分離氨基酸、多肽及蛋白質，也可用于分離核酸、核苷酸及其它帶電荷的生物分子 高效液相層析法：液-固吸附層析；液-液分配層析；離子交換層析 4.SephadexG-100凝膠柱層析分離蛋白質

3、原理是什么？ 大小不同的分子經過的路線長短不同而達到分離作用。5.用Sephadex G25脫鹽時蛋白質和鹽哪個先出峰？ 蛋白質 6.相對分子量為8萬和10萬的蛋白質能否在SephadexG-75柱中分開？為什么？ 不能,分子量差距太小。 7.將分子量分別為a（90 000）、b（45 000）、c（110 000）的三種蛋白質混合溶液進行凝膠過濾層析，正常情況下，將它們按被洗脫下來的先后排序。 c、a、b 8.離子交換層析與凝膠過濾哪種分辨率高？ 離子交換層析較高。 9.如果樣品中只有Ala和His(Ala pI=6.0,His pI=7.6)，在pH4條件下，這兩種氨基酸那一種與CM（陽離

4、子交換劑）結合的緊密？如果用pH4-7的洗脫液梯度洗脫，那種氨基酸先洗脫出來？ Ala 10. 柱層析時濕裝柱的注意事項有哪些？ 用水灌注、不能有氣泡。 11.說說離子交換層析中洗脫液的選擇原則 陰離子交換劑選用陽離子緩沖液（如氨基乙酸、銨鹽、Tris等），陽離子交換劑選用陰離子緩沖液（如乙酸鹽、磷酸鹽等），以防緩沖離子參與交換過程，降低交換劑的交換容量。緩沖液pH值的選擇要使被分離物質的電荷與平衡離子電荷的正負性相同。選用的緩沖系統對分離過程無干擾。要確定一定的離子強度。 12、離子交換層析的原理：離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質作固定相,利用它與流動相中的離子能進行可逆的交換性質來

5、分離離子型化合物的一種方法。 13、親和層析的原理：親和層析是應用生物高分子與配基可逆結合的原理,將配基通過共價鍵牢固結合于載體上而制得的層析系統。這種可逆結合的作用主要是靠生物高分子對它的配基的空間結構的識別。 14、吸附層析的原理：組份在吸附劑表面吸附固定相是固體吸附劑, 各能力不同而進行分離的方法。 15、試述凝膠層析原理，并列出常用凝膠名稱凝膠層析柱裝有多孔凝膠，當含有各組分的混合液流經凝膠層析柱時，各組分在層析柱內同時進行兩種不同的運動。一種是隨著溶液流動而進行的垂直向下的移動，另一種是無定向的分子擴散運動。大分子物質由于分子直徑大，不能進入凝膠微孔，只能分布于凝膠顆粒的間歇中以較快

6、速度流過凝膠柱。較小的分子能進入凝膠微孔，不斷進出一個個顆粒的微孔內外，因此流動速度較慢，從而使混合溶液中各組分按照相對分子量由大到小順序先后流出層析柱得到分離。 常用凝膠：葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠。 16、 說明紙層析和離子交換層析分離氨基酸混合物的方法是根據氨基酸的什么性質? 紙層析是分配層析，利用分配系數不同，即氨基酸在兩相中的溶解能力不同。離子交換層析利用氨基酸是兩性物質，在一定pH下不同氨基酸帶電性質和帶電量不同，因此交換能力不同。 17、簡述薄層層析法分離糖類的原理? 薄層層析的實質就是吸附層析，也就是在鋪有吸附劑的薄層上，經過反復地被吸附劑吸附以及被擴展劑擴展的過程

7、。而吸附劑對不同的物質的吸附力不同，從而使糖在薄層上的涌動速度不同達到分離的目的紙層析分離氨基酸 1為什么苯丙氨酸的Rf值大于賴氨酸 因為水與濾紙的吸附性很強，故擴散的慢，郵寄溶劑與濾紙吸附性差，故擴散的快。苯丙氨酸是非極性氨基酸，其易隨著有機溶劑一起擴散，而賴氨酸正好相反。故最后苯丙氨酸走的更遠些，因而使苯丙氨酸Rf較大些。 2為什么脯氨酸和茚三酮加熱后是黃色斑點 脯氨酸等伯胺氨基酸與茚三酮反應可生成黃色化合物。 4紙層析和柱層析的一般操作步驟 紙層析：點樣、層析、標記前沿、烘干、顯色、得到層析圖譜、標記色斑 柱層析：裝柱、平衡、上樣、洗脫、收集、檢測、測定 5.何謂Rf值？影響Rf值的因素

8、？Rf是原點到層析中心的距離與原點到溶劑前沿的距離之比。Rf的大小與物質的結構，性質，溶劑系統，層析濾紙的質量和層析溫度有關，對同一種物質來講Rf是一個常量。電泳原理 1、電泳的原理：電泳是指帶電顆粒在電場的作用下發生遷移的過程。許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質、核苷酸、核酸等都具有可電離基團，它們在某個特定的pH值下可以帶正電或負電，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動。電泳技術就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而對樣品進行分離、鑒定或提純的技術。 2.常見的凝

9、膠電泳有哪幾種？說明其主要用途，并比較其主要優缺點。 A醋酸纖維素薄膜電泳。用于血清蛋白，血紅蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，類固醇及同工酶等的分離分析中。優點是操作簡單、快速、廉價缺點是它的分辨力不夠高。（比聚丙酰胺凝膠電泳低） B凝膠電泳。用于分子生物學、遺傳學和生物化學，如大的DNA或者RNA分子的分離，酶譜法等。優點是操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。 C等電聚焦電泳。應用蛋白質和兩性分子的分離等。兩性優點是分辨率高，區帶清晰、窄，加樣部位自由，重現性好，可測定蛋白或多肽的等電點。缺點是需無鹽溶液，不適用于在等電點不溶解或發生變性的蛋白

10、。 3.從分離原理和實際應用兩方面簡單說明SDS-PAGE和PAGE技術方法有何主要區別？ 非變性凝膠電泳，也稱為天然凝膠電泳，與變性凝膠電泳最大的區別就在于蛋白在電泳過程中和電泳后都不會變性。最主要的有以下幾點： A. 凝膠的配置中非變性凝膠不能加入SDS，而變性凝膠的有SDS。 B. 電泳載樣緩沖液中非變性凝膠的不僅沒有SDS，也沒有巰基乙醇。 C.在非變性凝膠中蛋白質的分離取決于它所帶的電荷以及分子大小，不像SDS-PAGE電泳中蛋白質分離只與其分子量有關。 D.非變性凝膠電泳中，酸性蛋白和堿性蛋白的分離是完全不同的，不像SDS-PAGE中所有蛋白都朝正極泳動。非變性凝膠電泳中堿性蛋白通

11、常是在微酸性環境下進行，蛋白帶正電荷，需要將陰極和陽極倒置才可以電泳。 因為是非變性凝膠電泳，所有的電泳時候電流不能太大，以免電泳時產生的熱量太多導致蛋白變性，而且步驟都要在0-4度的條件下進行，這樣才可以保持蛋白質的活性，也可以降低蛋白質的水解作用。這點跟變性電泳也不一樣。 所以與SDS-PAGE電泳相比，非變性凝膠大大降低了蛋白質變性發生的機率。 4、試分析影響電泳的主要因素有哪些？ （1）帶電顆粒的大小和形狀：顆粒越大，電泳速度越慢，反之越快； （2） 顆粒的電荷數：電荷越少，電泳速度越慢，反之越快； （3）電場強度：電場強度越小，電泳速度越慢，反之越快； （4） 溶液的pH值：影響被分

12、離物質的解離度，離等電點越近，電泳速度越慢，反之越快； （5） 溶液的粘度：粘度越大，電泳速度越慢，反之越快； （6） 離子強度：離子強度越大，電泳速度越慢，反之越快；（7）電滲現象：電場中，液體相對于固體支持物的相對移動； （8）支持物篩孔大小，孔徑越小，電泳速度越慢，反之越快。5.聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白時，使用的電泳緩沖液PH8.3，那么樣品應點在哪端？為什么？ 在負極。因為電泳緩沖液PH8.3時，血清蛋白的幾種蛋白電離后都帶上負電荷，所有只有點樣在負極端，外加電壓后，才能向正極移動，彼此才能分開。（PH值大于等電點時帶負電荷 ,小于等電點時帶正電） 6.簡述不連續聚丙烯酰胺凝膠電

13、泳中的三個不連續及三種物理效應。 三個不連續：（1）凝膠由上下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同； （2）緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同； （3）在電場中形成不連續的電位梯度。 三種物理效應：（1）電荷效應：酶蛋白按其所帶電荷的種類及數量，在電場作用下向一定的電極以一定的速度泳動。 （2）分子篩效應：分子量、形狀不同的分子在經過凝膠孔徑過程中，受到的阻力不同，因此移動速率不等。 （3）濃縮效應：使待分離樣品中的各組分在濃縮膠中被壓縮成層，使原來很稀的樣品得到高度的濃縮。 7、為什么SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可以用來測定未知蛋白質的相對分子質量？在聚丙烯酰胺凝膠系統中，加入一定量的十二烷基硫酸鈉

14、（SDS），形成蛋白質SDS復合物，這種復合物由于結合了大量的SDS，使蛋白質喪失了原有的電荷狀態，形成了僅保持原有分子大小為特征的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質分子之間的天然的電荷差異，此時，蛋白質分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小，而其它因素對電泳遷移率的影響幾乎可以忽略不計。當蛋白質的分子量間時，電泳遷移率與分子量的對數值呈直線關系，符合下列方程： 10Mr = b?mR + K 8、連續聚丙烯酰胺凝膠電泳與不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳有什么不同？不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳包含了兩種以上的緩沖液成分、pH值和凝膠孔徑，而且在電泳過程中形成的電位梯度亦不均

15、勻。由此產生的濃縮效應、電荷效應和分子篩效應。 9、聚丙烯酰胺凝膠電泳的主要優點及用途：聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N，N'甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝膠有 格子是帶有酰胺側鏈的碳-碳聚合物，沒有或很少帶有離子的側基，因而電滲作用比較小，不易和樣品相互作用。 由于聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的物質，在聚合前可調節單體的濃度比，形成不同程度交鏈結構，其空隙度可在一個較廣的范圍內變化，可以根據要分離物質分子的大小，選擇合適的凝膠成分，使之既有適宜的空隙度，又有比較好的機械性質。當丙烯酰胺的濃度增加時可以減少雙含丙烯酰胺，以改進凝膠的機械性能。 在一定濃度范圍聚丙烯酰胺對熱穩定。凝膠無

16、色透明，易觀察，可用檢測儀直接測定。 丙烯酰胺是比較純的化合物，可以精制，減少污染。合成聚丙烯酰胺凝膠的原料是丙烯酰胺和甲撐雙丙烯酰胺。丙烯酰胺稱單體，甲撐雙丙烯酰胺稱交聯劑，在水溶液中，單體和交聯劑通過自由基引發的聚合反應形成凝膠。 10、瓊脂糖凝膠電泳的優點？（1） 瓊脂含液體量大，可達98-99%，近似自由電泳，但是樣品的擴散度比自由電泳小，對蛋白質的吸附極微。（2）瓊脂作為支持體有均勻，區帶整齊，分辨率高，重復性好等優點。（3）電泳速度快。（4）透明而不吸收紫外線，可以直接用紫外檢測儀作定量測定。（5）區帶易染色，樣品易回收，有利于制止備。然而瓊脂中有較多硫酸根，電滲作用大。瓊脂糖是從

17、瓊脂中提取出來的，是由半乳糖和3.6-脫水-L- 半乳糖相互結合的鏈狀多糖。含硫酸根比瓊脂少，因而分離效果明顯提高。 瓊脂（糖）電泳常用緩沖液的pH在6-9之間，離子強度為0.02-0.05。離子強度過高時，會有大量電流通過凝膠，因而產生熱量，使凝膠的水份量蒸發，析出鹽的結晶，甚至可使凝膠斷裂，電流中斷。常用的緩沖液有硼酸鹽緩沖液與巴比妥緩沖液。為了防止電泳時兩極緩沖液槽內pH和離子強度的改變，可在每次電泳后合并兩極槽內的緩沖液，混勻后再用。 11、凝膠電泳的一般操作步驟：制膠，加入電泳緩沖液，加樣，電泳，剝膠，染色，脫色。蛋白質電泳 1、簡述血清蛋白的醋酸纖維薄膜的電泳原理？血清蛋白中各種蛋

18、白質離子在電場力的作用下向著與自身電荷相反的方向涌動，而各種蛋白質等電點不同，且在PH為8.6時所帶電荷不同，分子大小不等，形狀各有差異，所以在同一電泳下永動速度不同從而實現分離。2、醋酸纖維薄膜電泳時點樣端應靠近電極的哪一端，為什么？電泳時點樣端應靠近負極，因為血清中各種蛋白質在PH為8.6的環境中均帶負電，根據同性相吸，異性相斥原理，點樣端在負極時蛋白質向正極泳動從而實現蛋白質分離。3、血清醋酸纖維薄膜電泳可將血清蛋白依次分為哪幾條帶？哪帶電泳最快？影響電泳速度有哪些？有血清蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、b-球蛋白、r-球蛋白；其中血清蛋白點用最快。影響因素蛋白質所帶電荷數，分子大小與

19、形狀以及緩沖液濃度。4、醋酸纖維薄膜電泳分離人血清實驗方法中，電壓正常范圍是多大？電壓過大會造成什么樣的結果？ 電泳電壓的大小，時間的長短與緩沖液的離子強度都有一定的關系。一般電流約0.40.6mA/cm，電壓110160V，通電時間4060min。電壓高，電流大，電泳速度加快，時間縮短，但薄膜上蒸發嚴重，因此不能無限增大電流。5、PAGE是現代生物科學研究中主要用來分離分析蛋白質、酶等生物大分子的核心技術之一，該技術分辨率較高的主要因素有哪幾種？簡要說明。 A.聚丙烯酰胺凝膠是一種透明而不溶于水的韌性凝膠，其在電泳中除了具有電泳的分離外，還具有分子篩的作用，故而提高了分辨率 B聚合物分子中含

20、有許多酰胺基，所以凝膠具有良好的親水性，能在水中溶脹但不溶解。 蛋白質含量測定 1 紫外吸收法與Folin-酚比色法測定蛋白質含量相比，有何缺點及優點？ 紫外吸收法優點：簡單快速，靈敏度高。缺點：核酸干擾 2 若樣品中含有核酸類雜質，應如何校正？ 校正:計算待測蛋白質溶液的OD280/OD260比值后，查(紫外分光光度法測定蛋白質含量校正數據表）校正因子“F”值，根據經驗公式-蛋白質濃度(mg/ml)=F×1/d×OD280×D計算該溶液的蛋白質濃度；D-溶液的稀釋倍數，d比色杯的厚度（cm） 3 試說明考馬斯亮藍G250法的優缺點。 考馬斯亮藍G250 當該染料

21、與蛋白質結合后為青色 ，在波長595nm有最大吸收；其吸收值與蛋白質含量成正比。靈敏度高，是常用的微量蛋白質快速測定法。缺點：、大量的去污劑如TritonX-100，SDS等嚴重干擾測定。B、蛋白質與改染料2min反應達平衡，其結合物在室溫下1h內穩定。時間太長，結果偏低。 4 簡述4種測定蛋白質含量的方法及其原理。 (1)考馬斯亮藍G-250染色法： 考馬斯亮藍G-250結合蛋白質后，形成藍色CBG-蛋白質結合物，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白質濃度范圍內（10-1000ug/ml），CBG-蛋白質結合物的O.D595nm值與蛋白質含量成正比，故可用分光光度法進行蛋白質的定量測定。 （

22、2）雙縮脲法： 蛋白質含有兩個以上的肽鍵（-CO-NH-）因此，有雙縮脲反應，在堿性溶液中蛋白質與Cu2+形成紫色絡合物，其顏色深淺與蛋白質含量成正比，而與蛋白質的相對分子質量及aa成分無關，故可以用來測定蛋白質含量； （3）Folin-酚試劑法（Lowry法）： 是雙縮脲法的發展，第一步涉及到堿性溶液中銅蛋白質復合物的形成，然后這個復合物還原磷鉬酸磷鎢酸試劑，產生深藍色（鉬藍和鎢藍混合物）比雙縮脲法靈敏，但費時； （4）紫外吸收法： 蛋白質中一些氨基酸殘基中的苯環含有共軛雙鍵，所以蛋白質具有吸收紫外光的性質，最大吸收峰在280nm處，在一定范圍內，蛋白質溶液的光吸收值與蛋白質含量成正比，可用

23、作定量測定，簡單、靈敏、快速、不耗樣品，低濃度的鹽類不干擾。 （5）微量凱式定氮法： 根據蛋白質的平均含氮量為16%，因此，測得1g蛋白氮，相當于6.25g蛋白質。5 蛋白質的分離常用的方法有哪些？1、 前處理：選擇適當的破碎細胞的方法破碎細胞，組織細胞破碎后，選擇適當的介質（一般用緩沖液）把所要的蛋白質提取出來。2、粗分離：當蛋白質混合物提取液獲得后，選用一套適當的方法，將所要的蛋白質與其他雜蛋白質分離開來。一般這一步的分級用鹽析、等電點沉淀和有機溶劑分級分離等方法。這種方法的特點是簡便、處理量大，既能除去大量雜質，又能濃縮蛋白質溶液。 3、細分離：也就是樣品的進一步提純，一般使用層析法，包

24、括凝膠過濾層析，離子交換層析，吸附層析以及親和層析等。必要時還可以選擇電泳法。 6 蛋白質顯色黃色反應的原理是什么?反應結果為什么深淺不一？含有苯環的氨基酸如酪氨酸和色氨酸，能被硝酸硝化成黃色的物質，而且不同蛋白質中所含的苯環數量不同，造成與試劑反應的程度不同，因此呈現顏色深淺不一 。雙縮脲法測蛋白質含量 1.雙縮脲法定量測生物材料中蛋白質是否適合所有樣品，如植物塊莖等 不是。在生物實驗中，雙縮脲是用來測蛋白質的，現在是出現紫紅色。選材時要注意蛋白質含量要高，材料顏色為白色或接近白色。故并非適用所有樣品。 2.比值法雙縮脲法定量測定蛋白質含量的優缺點？ 優點：快速，蛋白質特異性影響小。 缺點：

25、準確度差，蛋白質樣品被破壞，干擾因素不易排除。 沉淀技術 1 蛋白質沉淀的常用方法有哪些 鹽析沉淀法、等電點沉淀法、有機溶劑沉淀法 2什么是鹽析，鹽析的原理，列舉鹽析時常用的鹽 一般是指溶液中加入無機鹽類而使某種物質溶解度降低而析出的過程。 原理：蛋白質在水中的溶解度受到溶液中鹽濃度的影響。一般在低鹽濃度的情況下，蛋白質的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這種現象稱為鹽溶。而在鹽濃度升高到一定濃度后，蛋白質的溶解度又隨鹽濃度的升高而降低，使蛋白質沉淀析出，這種現象稱為鹽析。在某一濃度的鹽溶液中，不同蛋白質的溶解度各不相同，由此可達到彼此分離的目的。 主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉 3簡

26、述等電點沉淀及原理 通過調節溶液的pH值至某種溶質的等電點(pI)時，使其溶解度降低，沉淀析出，而與其他組分分離的方法稱為等電點沉淀法。 原理：在等電點時，蛋白質分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零，此時蛋白質分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，溶解度最小，最易形成沉淀物。等電點時的許多物理性質如黏度、膨脹性、滲透壓等都變小，從而有利于懸浮液的過濾。 4什么是有機溶劑沉淀，列舉常用的有機溶劑 利用要分離物質與其他雜質在有機溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機溶劑，使某種溶質沉淀析出，從而與其他組分分離的方法稱為有機溶劑沉淀法。 常用的有機溶劑有乙醇、

27、丙酮、異丙醇、甲醇等。 5雞蛋清可以用作鉛汞中毒的解毒劑是為什么? 由于重金屬離子能與蛋白質中帶負電基團如COOH等作用，生成難溶重金屬的蛋白質鹽，減少機體對重金屬的吸收。6影響蛋白質沉淀的因素是什么？沉淀和變性有什么聯系？水溶液中的蛋白質分子由于表面形成水化層和雙電層從而形成穩定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下蛋白質顆粒因失去電荷和脫水而沉淀。這些因素包括溶液的酸堿度、鹽溶液的濃度、溫度、重金屬離子以及有機溶劑等。變性蛋白質不一定沉淀，沉淀的蛋白質不一定變性。沉淀時蛋白質可能仍然保持天然構像，而變性是蛋白質的高級結構被破壞失去活性。維生素C的測定 1. 指出本實驗采用的定量測定維生素C

28、的方法有何優缺點？ 優點：簡便易行，快速，比較準確。 缺點：易受其它還原物質干擾，滴定終點難以確定。 2. 2,6-D的作用是什么？ A.氧化劑的作用。還原抗壞血酸。 B作為指示劑，判斷滴定終點，以計算樣品含量 3.滴定管的使用 洗滌、裝液、計數、滴定 酶的提取純化與活力測定 1. 從某細胞中提取的一種蛋白水解酶的粗提液300mL含有150mg蛋白質，總活力為360單位。經過一系列純化以后得到的4mL酶制品(含有0.08mg蛋白)，總活力為288單位。請問回收率是多少？純化了多少倍？比活力=酶活力單位數/酶蛋白質量 純化倍數 =純化后的比活力 / 粗抽提液比活力 產率(回收率) =純化后的總活

29、力單位 / 粗抽提液總活力單位 2.簡述酶分離純化的基本過程 A 抽提：破碎細胞，動植物組織一般可用組織搗碎器；或者加石英砂研磨，將材料做成丙酮粉或進行冰凍融解；對細菌，常采用加砂或加氧化鋁研磨和超聲波振蕩方法破碎。 B濃縮：加中性鹽或冷乙醇沉淀后再溶解，膠過濾濃縮以及超過濾濃縮法等。 C純化：利用鹽析法、有機溶劑沉淀法、層析純化法、等電點法吸附分離法進行純化。 D結晶：濃縮液經過各種方法的純化，可得到較純的結晶產品。 4 酶的制備及提取過程中應注意哪些事項 3.常用的酶活力單位？ U（指特定條件（25，其它為最適條件）下，在1分鐘內能轉化1微摩爾底物的酶量）、Kat（在最適條件下，1秒鐘能使

30、1摩爾底物轉化的酶量）。1 Kat=6×107U， 1U=16.67n 比活力概念及意義 比活力用每毫克蛋白所含的酶活力單位數表示。 比活力=酶活力單位數/酶蛋白質量 酶的比活力比活力代表酶制劑的純度。對于同一種酶來說，比活力愈大，表示酶的純度愈高。 4.什么是抑制劑？什么是變性劑？區別是什么？凡是能使酶活性降低而不使酶失活變性的物質成為抑制劑；凡是能引起蛋白質變性失活的物質叫變性劑。抑制劑只是抑制蛋白質的特性而變性劑則破環蛋白質的結構。淀粉酶活力的測定 1如何正確繪制和使用標準曲線? 在制備標準曲線時，標準液濃度一般可選擇5種濃度梯度，測其吸光值，以濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制

31、曲線，需要至少有三個點標準曲線才可用，繪制好的標準曲線只能供以后相同條件下操作測定相同物質時使用。 2.淀粉酶原液和1%的淀粉溶液置于40水浴中保溫的作用 酶反應需要適宜的溫度。只有在一定的溫度條件下才表現出最大活性。40°C是淀粉酶的最適溫度，所以將酶液和底物先分別保溫至最適溫度，然后再進行酶反應，這樣才能使測得的數據更準確。 3.3,5二硝基水楊酸作用： 提供堿性環境，使酶失去活性；做氧化劑，與還原糖反應，起到顯色作用。 4.淀粉酶的最適溫度為40°C，最適PH為5.6.5.如何操作能減小標準曲線結果誤差？ A：標準液濃度的選擇：在制備標準曲線時，標準液濃度選擇一般應能

32、包括待測樣品的可能變異最低和最高指，一般選擇5種濃度。濃度差距最好是成倍增加或等級增加，并應與被測液同樣條件下顯色測定。 B標準液的測定：在比色時，讀取光密度至少讀23次，求其平均值，以減少儀器不穩定而造成的誤差。核酸1、核酸的含量測定常用的方法有哪些？（1）紫外分光光度法；（2）定磷法：鉬藍比色法（3）瓊脂糖凝膠電泳法 （4）定糖法： RNA+鹽酸糠醛+地衣酚670，鮮綠色； DNA+二苯胺595,藍色化合物 2、如何證明提取到的某種核酸是DNA還是RNA？（1）用定糖法檢測。（2）用紫外分光光度計檢測。（3）用瓊脂糖凝膠電泳檢測。3、RNA水解后的三大組分是什么？怎樣各自驗證的？核糖，磷酸

33、，嘌呤堿。核糖+苔黒酚Fe（濃HCI）綠色物質；磷酸+鉬酸銨藍色；嘌呤堿+硝酸銀白色粗脂肪的提取1、粗脂肪的提取和含量測定的基本原理。脂肪是丙三醇(甘油)和脂肪酸結合成的脂類化合物, 能溶于脂溶性有機溶劑。本實驗用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶劑這一特性，用脂溶性溶劑將脂肪提取出來，借蒸發除去溶劑后稱量。整個提取過程均在索氏提取器中進行。通常使用的脂溶性溶劑為乙醚或沸點為30oC -60 oC的石油醚。用此法提取的脂溶性物質除脂肪外，還含有游離脂肪酸、磷酸、固醇、芳香油及某些色素等，故稱為“粗脂肪”。 2、索氏提取器是由哪幾部分組成的？提取瓶，提取管和冷凝管三部分組成。 3、粗脂肪的提取實驗中

34、如何減少誤差？（1）材料和提取瓶充分干燥。（2）材料盡可能的不損失。(3)提取充分完全。（4）提取后瓶子還要充分的干燥。離心技術 15、普通離心機的使用注意事項？ (1).離心機要置水平位置,以保證旋轉軸垂直地球水平面。 (2).使用前應檢查套環是否平衡(臺稱)。 (3).離心杯及其外套(離心管套)是否平衡(臺稱)。 (4).樣品傾入離心杯后應與離心管套一起兩兩平衡，平衡后把它們放置于轉子的對稱位置。 (5).蓋好蓋子,打開電源開關,調整離心時間。 (6).啟動離心時轉速應由小至大,緩慢升速(一般要23min)。 (7).達到預定轉速后再調整離心時間至預定時間(10min)。 (8).離心完成后要調整調速連桿至零位,同時關上電源。 (9).要等到轉速為零時才能打開離心機蓋,取出樣品。2.制備離心機有哪幾種類型？比較它們的特點和用途。 A普通離心機；特點型號很多，容量不同，轉速不同，控制不精密；用途固液沉淀分離。 B高速離心機；特點型號較多，轉速不同，有控溫裝置，控制精密（時間、轉速），用途菌體、細胞碎片、細胞器等的分離。 C超速離心機；特點控制精密：時間控制