1、ELISA-2ELISA-2（乙肝兩對半的檢測）乙肝兩對半的檢測）臨床免疫學教研室臨床免疫學教研室鄧念華鄧念華【目的要求】1.掌握乙肝兩對半的檢測原理及操作過程；2.熟悉影響乙肝兩對半檢測的因素；3.進一步熟悉酶標儀及洗板機使用；4.了解乙肝兩對半的臨床意義。【原理】項 目表面抗原（HBsAg）表面抗體（抗-HBs）e抗原（HBeAg）抗e抗體（抗-HBe）核心抗體（抗-HBc）檢 測 原 理雙抗體夾心法雙抗原夾心法雙抗體夾心法競爭抑制法競爭抑制法【器材】SM-3型自動化酶免分析儀ZMX-988B型全自動酶標洗板機微量加樣器吸頭等 【試劑】HBsAgELISA試劑盒HBsAbELISA試劑盒H

2、BeAgELISA試劑盒HBeAbELISA試劑盒HbcAbELISA試劑盒【標本】待測血清 【操作步驟】1.準備：試劑盒各組份在37平衡30min；2.配洗滌液：用純化水按1:25將濃縮洗液稀釋；3.加樣品：每孔加入待測樣品75ul/孔，同時設置陽性對照、陰性對照，空白對照（不加樣品），輕輕振蕩混勻；4.孵育：貼上封膜，37反應60min;5.加酶結合物：每孔加入50ul/孔（空白對照不加），震蕩10秒鐘；表面抗原檢測(雙抗體夾心法)6.孵育：貼上封膜，37 反應30min;7.洗板：洗板機5次，最后一次盡量扣干；8.顯色：先加顯色液A 50ul，再加入顯色液B 50ul，貼上封膜，37反應

3、30min(避光)； （注：顯色從加入第一滴顯色液B開始計時）9.終止：加終止液50ul；10.判讀：終止反應后10min內完成。(450nm處測定吸光度)。結果判斷及解釋 COV=2.1OD陰性對照陽性：OD樣品COV 陰性：OD樣品COV 檢測有效性OD陰性對照0.10， OD陽性對照1.0OD空白對照0.04（雙波長檢測）1.準備：試劑盒各組份在37平衡30min；2.配洗滌液：用純化水按1:25將濃縮洗液稀釋；3.加樣品：每孔加50ul，同時設陽性對照、陰性對照和空白對照（不加樣品）；4.加酶結合物：每孔50ul（空白對照不加）；5.孵育：貼上封膜，37 反應30min；表面抗體檢測(

4、夾心法)6.洗板：洗板機5次，每次洗液在孔中滯留時間10-15s，并注滿反應微孔；7.顯色：先加顯色液A 50ul，再加入顯色液B 50ul，貼上封膜，37反應15min(避光)；（注：顯色從加入第一滴顯色液B開始計時）8.終止：加終止液50ul；9.判讀：終止反應后10min內完成。(450nm處測定吸光度)結果判斷及解釋 COV=2.1 OD陰性對照（ OD陰性對照低于0.05按0.05計算）陽性：OD樣品COV 陰性：OD樣品COV 檢測有效性OD陰性對照0.10，OD陽性對照1.0OD空白對照0.015（雙波長檢測）1.準備：試劑盒各組份在37平衡30min；2.配洗滌液：用純化水按1

5、:25將濃縮洗液稀釋；3.加樣品：每孔50ul，同時設陽性對照、陰性對照和空白對照（不加樣品）；4.加酶結合物：每孔50ul（空白對照不加）；5.孵育：貼上封膜，37 反應30min；e抗原檢測(夾心法)6.洗板：洗板機5次，每次洗液在孔中滯留時間10-15s，并注滿反應微孔；7.顯色：先加顯色液A50ul，再加入顯色液B50ul，貼上封膜，37反應15min(避光)；（注：顯色從加入第一滴顯色液B開始計時）8.終止：加終止液50ul；9.判讀：終止反應后10min內完成。(450nm處測定吸光度)。結果判斷及解釋 COV=2.1 OD陰性對照（ OD陰性對照低于0.05按0.05計算）陽性：

6、OD樣品COV 陰性：OD樣品COV 檢測有效性OD陰性對照0.10，OD陽性對照1.0OD空白對照0.015（雙波長檢測）e抗體檢測(競爭抑制法)1.準備：試劑盒各組份在37平衡30min；2.配洗滌液：用純化水按1:25將濃縮洗液稀釋；3.加樣品：每孔50ul，同時設陽性對照、陰性對照和空白對照（不加樣品）；4.加酶結合物：每孔50ul（空白對照不加）；5.孵育：貼上封膜，37 反應30min；6.顯色：先加顯色液A 50ul，再加入顯色液B 50ul，貼上封膜，37反應15min(避光)；（注：顯色從加入第一滴顯色液B開始計時）7.終止：加終止液50ul；8.判讀：終止反應后10min內

7、完成。(450nm處測定吸光度)結果判斷及解釋 COV=0.5 （OD陽性對照+OD陰性對照）陽性：OD樣品COV 陰性：OD樣品COV 檢測有效性OD陰性對照1.0，OD陽性對照0.05OD空白對照0.015（雙波長檢測）c抗體檢測(競爭抑制法)1.準備：試劑盒各組份在37平衡30min；2.配洗滌液：用純化水按1:25將濃縮洗液稀釋；3.加樣品：每孔加50ul（1:30稀釋樣本），同時設陽性對照、陰性對照和空白對照（不加樣品）；4.加酶結合物：每孔50ul（空白對照不加）；5.孵育：貼上封膜，37 反應30min；6.顯色：先加顯色液A 50ul，再加入顯色液B 50ul，貼上封膜，37反應15min(避光)；（注：顯色從加入第一滴顯色液B開始計時）7.終止：加終止液50ul；8.判讀：終止反應后10min內完成。(450nm處測定吸光度)結果判斷及解釋 COV=0.5 （OD陽性對照+OD陰性對照）陽性：OD樣品COV 陰性：OD樣品COV 檢測有效性OD陰性對照1.0，OD陽性對照0.05OD空白對照0.015（雙波長檢測）1.不同品種及批號試劑組份請勿混用；2.試劑從2-8條件下取出，先在室溫平衡1h；3.最好用微量移液器加各種組份；4.每次手工加樣，應更換吸頭；5.加樣時盡量避免反應微孔中產生氣泡；6.封板膜不能重復使用；【注意事項】7.洗液如有結晶形