1、吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心藥物雜質檢查(1)吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心目的要求目的要求掌握一般雜質檢查的目的和原理。熟悉雜質檢查的一般操作方法。吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心實驗原理實驗原理1. 氯化物檢查法氯化物在硝酸酸性溶液中與硝酸銀作用，生成氯化銀微粒而顯白色渾濁，與一定量的標準氯化鈉溶液和硝酸銀在同樣的條件下，用同法處理生成的氯化銀渾濁程度相比較，測定供試品中氯化物的限量。Cl- + Ag+ AgCl吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心實驗原理實驗原理2. 重金屬檢查法重金屬是指在

2、弱酸性(pH33.5)溶液中，能與硫代乙酰胺或硫化鈉作用生成硫化物的金屬雜質。在藥品生產中遇到鉛的機會比較多，鉛又易積蓄中毒，故檢查時以鉛為代表。同上法，硫代乙酰胺分別和樣品、標準品生成有硫化物的均勻沉淀，再比較判斷樣品中的重金屬限量。 CH2CSNH2+H2O CH3CONH2+H2S Pb 2+ + H2S PbS吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心實驗原理實驗原理3. 砷鹽檢查法砷鹽檢查法本法系采用鋅和酸作用所產生的初生態氫與本法系采用鋅和酸作用所產生的初生態氫與供試品中微量砷鹽化合物反應生成揮發性砷供試品中微量砷鹽化合物反應生成揮發性砷化氫，再與溴化汞試紙作用生成黃

3、色至棕色化氫，再與溴化汞試紙作用生成黃色至棕色砷斑。比較供試品與標準砷溶液在同一條件砷斑。比較供試品與標準砷溶液在同一條件下所顯的砷斑的顏色深淺，以測得供試品的下所顯的砷斑的顏色深淺，以測得供試品的含砷限度。含砷限度。AsO33-3Zn9H+AsH33Zn2+3H2OAsH32HgBr22HBrAsH(HgBr)2(黃色黃色)AsH33HgBr23HBrAs(HgBr)3(棕色棕色)（選做）（選做）吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心實驗原理實驗原理 五價砷在酸性溶液中也能被金屬鋅還原為砷化氫，但五價砷在酸性溶液中也能被金屬鋅還原為砷化氫，但生成砷化氫比三價砷慢。三價砷生成

4、砷化氫在生成砷化氫比三價砷慢。三價砷生成砷化氫在2h內已內已反應完全，而五價砷在同時間內僅五分之一起反應。反應完全，而五價砷在同時間內僅五分之一起反應。為了防止五價砷存在，影響測定結果的準確性，故必為了防止五價砷存在，影響測定結果的準確性，故必須加入碘化鉀、酸性氯化亞錫還原劑，將五價砷還原須加入碘化鉀、酸性氯化亞錫還原劑，將五價砷還原為三價砷。碘化鉀被氧化生成為三價砷。碘化鉀被氧化生成I2，以氧化亞錫來還原，以氧化亞錫來還原，使反應液中維持有碘化鉀的還原劑存在。使反應液中維持有碘化鉀的還原劑存在。 AsO43-2I-2H+AsO33-I2H2O AsO43-Sn2+2H+AsO33-Sn4+H

5、2OI2Sn2+2 I-Sn4+ 溶液中的碘離子，與反應中產生的鋅離子能形成配合溶液中的碘離子，與反應中產生的鋅離子能形成配合物，使生成砷化氫的反應不斷進行。物，使生成砷化氫的反應不斷進行。 4I-Zn2+ZnI42-吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心實驗原理實驗原理 氯化亞錫與碘化鉀存在，還可抑制銻化氯化亞錫與碘化鉀存在，還可抑制銻化氫生成，在實驗條件下，氫生成，在實驗條件下，100 g銻存在銻存在不至于干擾測定。同時氯化亞錫的作用不至于干擾測定。同時氯化亞錫的作用可在鋅粒表面形成鋅錫齊（鋅錫的合金）可在鋅粒表面形成鋅錫齊（鋅錫的合金）起去極化作用，使鋅粒與鹽酸作用緩和

6、，起去極化作用，使鋅粒與鹽酸作用緩和，放出氫氣均勻，使產生的砷化氫氣體一放出氫氣均勻，使產生的砷化氫氣體一致，有利于砷斑的形成，增加反應的靈致，有利于砷斑的形成，增加反應的靈敏度與準確度。敏度與準確度。 Sn2+ZnSnZn2+吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心樣品 標準砷溶液還 原 反 應(25-40 )AsH3 砷斑標準砷 溶液樣品醋酸鉛棉花醋酸鉛棉花 溴化汞試溴化汞試紙紙 H2S 吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心試劑與器材試劑與器材1、材料：藥用葡萄糖（分析型）、稀硝酸、材料：藥用葡萄糖（分析型）、稀硝酸、硝酸銀、氯化鈉、磺基水楊酸、硝酸鉛、

7、硝酸銀、氯化鈉、磺基水楊酸、硝酸鉛、醋酸銨、稀硫酸或濃硫酸、濃鹽酸醋酸銨、稀硫酸或濃硫酸、濃鹽酸2、器材：天平、容量瓶、器材：天平、容量瓶10 ml、納氏比色、納氏比色管管 （25 ml） 等等吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心實驗步驟實驗步驟1. 溶液的澄清度與顏色 取藥用葡萄糖（分析型）5.0 g置于100ml燒杯中，加熱水溶解后放冷，用去離子水稀釋至10 ml，溶液應澄清無色，如顯渾濁，與1號濁度標準液(1) （取濁度標準原液5.0 ml，加水95.0 ml，搖勻）10 ml比較，不得更深，如顯色，與對照液（取比色氯化鈷液3 ml，比色用重鉻酸鉀液3 ml與比色用硫

8、酸銅液6 ml，加水稀釋至50 ml）1.0 ml加水稀釋至10 ml，比較，不得更深。吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心實驗步驟實驗步驟2. 氯化物(2) 取藥用葡萄糖（分析型）0.3 g置于100ml燒杯中，加去離子水溶解使成12.5 ml（如顯堿性，可滴加稀硝酸使遇石蕊試紙顯中性反應），再加稀硝酸5 ml，溶液如不澄清，應過濾。置25 ml納氏比色管中，加水適量使成約 20 ml (3)，加硝酸銀試液0.5 ml，用水稀釋使成25 ml，搖勻在暗處放置5 min，如發生渾濁，與（標準氯化鈉溶液1.0 ml，加入一定量的硝酸銀試液，再加水稀釋使成50 ml，搖勻，在暗

9、處放置5 min），比較，不得比更濃。吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心實驗步驟實驗步驟3. 蛋白質 取藥用葡萄糖（分析型）1.0 g置于100ml燒杯中，加去離子水10 ml溶解后，加入磺基水楊酸溶液3 ml，不得發生沉淀。吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心實驗步驟實驗步驟4. 重金屬 取25 ml納氏比色管兩支，一管加標準鉛溶液2.0 ml，醋酸鹽緩沖液(5) (pH 3.5)2.0 ml，加水至25 ml；另一支管取藥用葡萄糖（分析型） 4.0 g，加去離子水23 ml溶解，加醋酸鹽緩沖液 (pH 3.5) 2.0 ml；各管分別加硫代乙酰胺試

10、液(6) 2 ml，搖勻，放置2 min，同置白紙上，自上向下透視，供試液顯出的顏色與標準比較不得更深。吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心注意事項注意事項臨用時現配，使用前充分搖勻。標準對照法。目的是稀釋Cl-濃度，產生渾濁而不是沉淀。酸性物質可沉淀蛋白質。在pH33.5時PbS沉淀較完全。硫代乙酰銨試液是硫代乙酰胺溶液1ml與混合液5ml水浴加熱20s，冷卻后立即使用。吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心思考題思考題實驗中各項雜質檢查的目的是什么？重金屬檢查原理是什么？實驗中應注意些什么？（實驗關鍵）藥物中特殊雜質的檢查吉林大學生物基礎實驗吉林大學生

11、物基礎實驗教學中心教學中心1、目的要求目的要求2、試劑與器材試劑與器材3、實驗步驟實驗步驟4、注解注解5、思考題思考題吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心目的要求目的要求1. 掌握試驗中特殊雜質的來源和檢查原理。2. 掌握特殊雜質檢查中的一般操作方法。吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心試劑與器材試劑與器材1、材料：阿司匹林、乙醇、硫酸鐵銨、水、材料：阿司匹林、乙醇、硫酸鐵銨、水楊酸、冰醋酸、楊酸、冰醋酸、 氫化可的松、氯仿、甲氫化可的松、氯仿、甲醇、二氯甲烷、乙醚、四氮唑藍、氫氧醇、二氯甲烷、乙醚、四氮唑藍、氫氧化鈉化鈉2、器材：容量瓶（、器材：容量瓶

12、（1000 ml/50 ml）、試管）、試管或或10 ml EP管、層析板管、層析板 10 cm5 cm、層、層析缸、析缸、110 烘箱、噴壺（薄層層析噴顯烘箱、噴壺（薄層層析噴顯色劑用）色劑用）吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心實驗步驟實驗步驟1. 阿司匹林中游離水楊酸的檢查 取本品0.1 g，加乙醇1 ml溶解后，加冷水適量使成50 ml，立即加新制的稀硫酸鐵銨溶液1ml，搖勻；30 s內如顯色，與對照液（水楊酸鐵試液 ）比較，不得更深（0.1%）。吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心實驗步驟實驗步驟2. 氫化可的松中其它甾體的檢查 取本品，加氯仿

13、-甲醇(9:1)制成每1 ml中含5.0 mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加氯仿-甲醇(9:1)稀釋制成每1 ml中含600 mg的溶液，作為對照液。照薄層色譜法實驗，吸取上述兩種溶液各5 ml，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-乙醚-甲醇-水(385:60:30:2)為展開劑，展開后，晾干，在105干燥10分鐘，放冷，噴以堿性四氮唑藍試液，立即檢視。供試品溶液如顯示雜質斑點，不得多于3個，其顏色與對照液的主斑點比較，不得更深。吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心點樣 微量注射器或定量毛細管。一般為圓點，點樣基線距底邊2.0cm，樣點直徑為24mm，點間距離

14、約為1.52.0cm，點間距離可視斑點擴散情況以不影響檢出為宜。點樣時必須注意勿損傷薄層表面。吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心注意事項注意事項1. 游離水楊酸的檢查樣品應盡量干燥，不得帶入過多水分，否則樣品加醇后不易溶解。2. 點樣采用微量注射器進行，在距薄層板2.5 cm處開始，點樣應少量多次點于同一原點處，原點面積應盡量小。3 堿性四氮唑藍試液應臨用新配。新鮮試劑應黃色，顏色如變深色不宜使用。吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心思考題思考題薄層色譜法檢查氫化可的松中其它甾體的原理是什么？為何用稀釋液作對照？2. 試計算阿司匹林中游離水楊酸、氫化可

15、的松中其它甾體的雜質限度。吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心本實驗中各溶液的配制方法本實驗中各溶液的配制方法1，標準氯化鈉溶液： 稱取氯化鈉0.165g，置于1000ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。臨用前，取儲備液10ml，置于100ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻即得。（每1ml10g的Cl）2，標準鉛溶液： 稱取硝酸鉛0.160g置于1000ml容量瓶中，加硝酸5ml，水50ml溶解后，用水稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。臨用前，取儲備液10ml，置于100ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻即得。 （每1ml10g的Pb）3 ，硫代乙酰胺試液 取硫代乙

16、酰胺4g，加水使溶解成100ml,置冰箱中保存。臨用前取混合液由1mol/L氫氧化鈉溶液15ml、水5.0ml及甘油20ml組成5.0ml，加上述硫代乙酰胺溶液1.0ml，置水浴上加熱20秒鐘，冷卻，立即使用。吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心本實驗中各溶液的配制方法本實驗中各溶液的配制方法4，硫酸鐵銨指示液： 取硫酸鐵銨8g，加水溶解，稀釋至100ml，即得。5，濁度標準貯備液的制備： 稱取于105干燥至恒重的硫酸肼1.00g，置100ml量瓶中，加水適量使溶解，必要時可在40的水浴中溫熱溶解，并用水稀釋至刻度，搖勻，放置46小時；取此溶液與等容量的10%烏洛托品溶液混

17、合，搖勻，于25避光靜置24小時，即得。本液置冷處避光保存，可在兩個月內使用，用前搖勻。6，濁度標準原液的制備： 濁度標準貯備液15.0ml，置1000ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，取適量，置1cm吸收池中，照紫外-可見分光光度法(附錄A)，在550nm的波長處測定，其吸光度應在0.120.15范圍內。本液應在48小時內使用，用前搖勻。吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心本實驗中各溶液的配制方法本實驗中各溶液的配制方法7，濁度標準液的制備： 濁度標準液的制備取濁度標準原液與水，按下表配制，即得。本液應臨用時制備，使用前充分搖勻。吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基

18、礎實驗教學中心本實驗中各溶液的配制方法本實驗中各溶液的配制方法8，堿性四氮唑藍溶液： 取含0.2四氮唑藍的甲醇溶液10ml與12NaOH的甲醇溶液30ml，臨用時混合。9，比色對照液： 取比色氯化鈷液3 ml，比色用重鉻酸鉀液3 ml與比色用硫酸銅液6 ml，加水稀釋至50 ml。比色氯化鈷、比色用重鉻酸鉀、比色用硫酸銅配制方法如下：吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心本實驗中各溶液的配制方法本實驗中各溶液的配制方法10，稀硝酸 ： 取硝酸10.5ml，加水稀釋至100ml，即得。本液含HNO3應為9.510.5。11，醋酸鹽緩沖液： 醋酸-醋酸鈉緩沖液（PH3.6），取醋酸鈉5.1g，加冰醋酸20ml，用水稀釋至250ml即得。吉林大學生物基礎實驗教學中心吉林大學生物基礎實驗教學中心本實驗中各溶液的配制方法本實驗中各溶液的配制方法12，硝酸銀溶液 ： 取硝酸銀18.4g，溶解于適量水中，定容至1000ml即得。0.1mol/LAgNO313，水楊酸鐵試液 ：（1）取硫酸鐵銨0.1g，加稀硫酸2ml與水適量使成100ml。（2）取水楊酸鈉1.15g，加水使溶解成100ml。（3）取醋酸鈉13.6g，加水使溶解成100ml。（4）取上述硫酸鐵銨溶液1ml，水楊酸鈉溶液0.5ml，醋酸鈉溶液0.8ml與稀醋