1、N-乙酰鳥氨酸脫酰基酶的生物信息學(xué)分析1翁秋萍，李環(huán)，韋萍南京工業(yè)大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院，南京（210009）E-mail ：摘 要：為分析ArgE 基因編碼的蛋白N-乙酰鳥氨酸脫?；傅慕Y(jié)構(gòu)與功能，探討其在精氨酸合成途徑中的作用。本文應(yīng)用多種二級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件對 ArgE編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)和特殊結(jié)構(gòu)、序列同源性、結(jié)構(gòu)域及功能位點進行了初步預(yù)測。生物信息分析表明ArgE 蛋白是一種酸性可溶性蛋白，理論等電點為 5.54，分子量為42347.3，無信號肽，為非分泌蛋白，有多個磷酸化位點。ArgE 蛋白中存在 螺旋、-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu), 有兩個可形成跨膜結(jié)構(gòu)的片段, 不存在卷曲螺旋, 無信號肽,

2、也無線粒體定位信號。ArgE 蛋白與和CBPG 、DAPE 、ACY1、YSCS 幾種蛋白具有較高的相似性。本文對ArgE 蛋白的結(jié)構(gòu)分析與預(yù)測為該基因的功能的深入研究提供了重要的理論依據(jù)。關(guān)鍵詞：ArgE 基因；N-乙酰鳥氨酸脫?；福唤Y(jié)構(gòu)與功能 ；生物信息學(xué)中圖分類號：Q556 文獻標(biāo)識碼：1. 引言蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)與功能的研究無疑是分子生物學(xué)領(lǐng)域中最具挑戰(zhàn)性的課題。從氨基酸序列到蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的編碼關(guān)系, 被稱為第二遺傳密碼并被列為21世紀(jì)生物學(xué)的首要任務(wù)1。對蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究, 傳統(tǒng)的方法如 X 射線晶體衍射方法、核磁共振技術(shù)等費時費力, 從而使從理論上對一個已知序列的蛋白質(zhì)的空

3、間結(jié)構(gòu)進行預(yù)測的問題變得日益緊迫和重要。ArgE 是一種在大腸桿菌中能高效表達(dá)的基因, 該基因 cDNA 序列大小為1152bp, 編碼 383個氨基酸。ArgE 編碼的N-乙酰鳥氨酸脫?；福∟-acetylornithine deacetylase, NAOase；EC6）催化N-乙酰鳥氨酸脫去乙?；蒐-鳥氨酸。該反應(yīng)是精氨酸合成途徑的關(guān)鍵，產(chǎn)物鳥氨酸是多胺類物質(zhì)合成的前體2-4。多胺和DNA 復(fù)制及細(xì)胞分裂有關(guān)，故NAOase 的活性對細(xì)菌繁殖不可缺少，argE 基因及其編碼的NAOase 可能會成為新的藥物作用靶標(biāo)5。迄今，尚無文獻報道該酶的具體催化機制、酶的構(gòu)象、

4、活性中心組成、底物和酶的結(jié)合位點、三維結(jié)構(gòu)等基礎(chǔ)性研究4-10。應(yīng)用各種相關(guān)軟件對ArgE 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。進行初步預(yù)測, 對ArgE 蛋白的一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、特殊結(jié)構(gòu)、同源性和結(jié)構(gòu)功能域等方面信息進行綜合分析，預(yù)測 ArgE蛋白的三維結(jié)構(gòu), 為實驗研究ArgE 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能提供理論依據(jù)。2. 材料與方法1.1材料以在GenBank 上查找到的若干微生物N-乙酰鳥氨酸脫?；富蛐蛄袨榉治鰧ο蟆?.2 方法1.2. 1ArgE 基因序列同源性檢索具有相似序列的蛋白質(zhì)具有相似的功能4。因此，最可靠的確定蛋白質(zhì)功能的方法是進行數(shù)據(jù)庫的相似性搜索，但是一個顯著的匹配應(yīng)至少有 25%的相同序列

5、和超過80個氨基酸的區(qū)段。以ArgE 基因的序列為檢測序列，通過美國國家生物技術(shù)信息中心服務(wù)器，對核酸序列1本課題得到國家973課題（NO.2003CB7160004）的資助。數(shù)據(jù)庫進行BLAST(basic local alignment search tool搜索，以期發(fā)現(xiàn)同源序列。1.2.2 ORF 識別及染色體定位用ORF Finder 程序搜索，對ArgE 的cDNA 序列進行開放閱讀框(ORF識別。1.2.3 ArgE 基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析將編碼的氨基酸序列用NCBI 提供的BlastP 程序進行同源性分析，再利用瑞士生物信息 學(xué)研究所(

6、/cgi-bin/protparam提供的Prot Param 軟件進行氨基酸殘基數(shù)目、組成、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量、理論等電點及平均可塑性、疏水性等參數(shù)的在線分析。1.2.4 ArgE 基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)分析利用網(wǎng)站(http:/npsa-pbil.ibcp.fr 中的SOPMA 程序和nnpredict 程序在線分析 螺旋 ( helix、 轉(zhuǎn)角(beta turn、無規(guī)卷曲(random coil以及延伸鏈(exted strand等（/cgi-bin/）。1.2.5 ArgE 蛋白跨膜螺旋預(yù)測TMpred( 可預(yù)測蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)段和在膜

7、上的取向。1.2.6 ArgE 蛋白卷曲螺旋的預(yù)測COILS(/software/COILS_form.html算法將查詢序列在一個由已知包含卷曲螺旋蛋白結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫中進行搜索。登陸ArgE 編碼的氨基酸序列輸入對話框, 運行程序。1.2.7 SignalP-NN 服務(wù)器預(yù)測 ArgE的信號肽登 陸http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ 氨基酸序列按指定格式輸入對話框, 運行程序。1.2.8 ArgE的亞細(xì)胞定位使用程序進行該蛋白的亞細(xì)胞定位，并使用Psortb 程序/ps

8、ortb/index.html 進行驗證分析。1.2. 9ArgE 蛋白的 motif 及結(jié)構(gòu)功能域預(yù)測Scanprosite 軟件預(yù)測 ArgE 蛋白的功能位點Scanprosite 對 PROSITE 或 Swiss-Prot 和 TrEMB的模式序列進行搜索, 搜索是否有已知模式與用戶提供的序列匹配。InterPro Scan 軟件預(yù)測 ArgE 蛋白的結(jié)構(gòu)域，利用SignalP （http:/www.cbs.dtu.dk/services/SingnalP/）對ArgE 基因編碼蛋白進行了信號肽分析，以及利用SUPERFAMILY (http:/supfam.mrc-lmb.cam.a

9、c.uk/ 進行超家族分析，利用結(jié)構(gòu)域分析(http:/supfam.mrc-lmb.cam.ac.uk/進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的搜索等。1.2.10 ArgE 基因編碼蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測一般認(rèn)為，若在連續(xù) 100個氨基酸范圍內(nèi)含有大于40%的一致性，則在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上具有較為顯著的相似性。故利用已知結(jié)構(gòu)的同源蛋白可以預(yù)測目的蛋白的結(jié)構(gòu)模型。通過搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(protein data bank,PDB或利用網(wǎng)站(/tools/中Swiss Model程序 可同源建模(homology modeling，推測ArgE 基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)，并采用DS Viewe

10、rPro trial 5.0圖形展示軟件分析結(jié)構(gòu)。2 結(jié)果與分析2.1ArgE 基因編碼的蛋白序列同源性比對蛋白質(zhì)的功能預(yù)測可靠的方法是進行數(shù)據(jù)庫相似性檢索由Blast p 搜索NR 數(shù)據(jù)庫，結(jié)果顯示ARGE 蛋白序列與琥珀酰庚二酸脫琥珀酶（DAPE ），ACY1，PEPD ，CBPG 分別有35%、29%，35%，28%。 所以, 我們認(rèn)為 ARGE 蛋白與已知DAPE ，ACY1，PEPD ，CBPG 同源。在 PDB中查詢DAPE ，ACY1，PEPD,CPG2相關(guān)信息, 發(fā)現(xiàn) PDB 中無前三者的注釋, 對CPG2結(jié)構(gòu)、功能及系統(tǒng)分類等方面的信息有一定的描述。故可以將ArgE 蛋白與C

11、BPG 同源建模。 圖1 氨基酸序列同源比對Fig.1. Comparison of amino acid sequence of amino acid由圖1可知，ARGE 編碼蛋白序列與琥珀酰庚二酸脫琥珀酶（DAPE ），ACY1，PEPD ，CBPG 分別有35%、29%，35%，28%。其中NAOase 與CBPG 有218個氨基酸序列相同，NAOase 中第11aa-228aa 與CBPG 中45aa-264aa 相一致，這218個氨基酸中64個氨基酸序列相似性為29.4%，47個氨基酸是保守序列。由此可以推斷出NAOase 與CBPG 同源，可根據(jù)CBPG 的結(jié)構(gòu)模擬NAOase 的

12、三維結(jié)構(gòu)2.2 ArgE 基因的結(jié)構(gòu)分析及染色體定位ArgE 基因全長1152bp ，經(jīng)ORF 程序六框搜索發(fā)現(xiàn)該序列中，最長的ORF 有312bp ， 最短的有102bp ，預(yù)測最為可能的開放閱讀框為1152bp ，從1到1152，編碼383個氨基酸殘基。2.3 ArgE 基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析對ArgE 基因編碼蛋白質(zhì)進行分析, 結(jié)果表明ArgE 基因編碼的蛋白由 383個氨基酸組成, 第65個氨基酸-第79是低重復(fù)序列（SEG ）4， 146個氨基酸可能形成螺旋結(jié)構(gòu), 41個氨基酸可能形成折疊, 196個氨基酸可能形成無規(guī)卷曲。其中亮氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、蘇

13、氨酸、天冬氨酸含量較高, 分別為11.5%，8.4%，6.5%，6.3%，7.6%，7.3%，7.0%，6.0%。理論等電點為 5.54，相對分子質(zhì)量為42347.3，酸性氨基酸殘基總數(shù)(AspGlu 為47，堿性氨基酸殘基總數(shù)(ArgLys 共為32。原子組成為C 1894H 2957N 517O 556S 15。該酶極其不穩(wěn)定。2.4 ArgE 基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測通過SOPMA 方法和nnpredict 程序預(yù)測其二級結(jié)構(gòu), 結(jié)果如表1 表1 ArgE 蛋白二級結(jié)構(gòu)組成 Table 1 The second structure type of ArgE protein 二級結(jié)構(gòu)組成

14、(Second structure 螺旋Alpha helix 直鏈 Extended strand 無規(guī)則卷曲 Random coil 146 41 196 個數(shù)(type Number 所占百分率 %( count in protein 38.12% 10.7% 51.17% 2.5 ArgE 基因編碼蛋白的功能分析 2.5.1 特定位點分析 通過PROSITE motif search發(fā)現(xiàn) ArgE 蛋白在第250-252,286-288個氨基酸處可能有蛋白激 酶C 磷酸化位點，在第69-74，74-79，107-112，246-251，268-273個氨基酸處有?；稽c, 在第22-

15、25,31-34,97- 100,99-102，141-144,270-273, 和第294-297個氨基酸處可能有酪蛋白激 酶磷酸化位點，是ATP/GTP 結(jié)合位點基序A。 2.5.2 Signal 服務(wù)器預(yù)測 ARGE 蛋白信號肽結(jié)果及分析 信號肽是位于新生肽 N 端的一段序列, 它的一般特征： 長度為 15-35 個氨基酸, N 端含 有一個或多個帶正電的氨基酸, 其后是 6-12 個連續(xù)的疏水殘基，進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通常被切除。 用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法和隱馬爾可夫算法分析 ArgE 蛋白是否有信號肽，結(jié)果顯示，ArgE 蛋白沒 有信號肽，不是分泌蛋白。 2.5.3 ArgE 蛋白的亞細(xì)胞器定位 使用

16、SubLoc v1.0 程序進行該蛋白的亞細(xì)胞定位， 發(fā)現(xiàn)此蛋白質(zhì)為細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)， 并 使用 TArgEtP 程序進行驗證分析。將真核生物的蛋白質(zhì)序列用 SubLoc v1.0 分析，結(jié)果證 實 ArgE 蛋白為細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)。 2.5.4ArgE 蛋白跨膜螺旋預(yù)測 蛋白跨膜螺旋可能的方式有兩種， 既由膜內(nèi)側(cè)向膜外側(cè)跨膜和由膜外側(cè)向膜內(nèi)側(cè)跨膜. 預(yù)測結(jié)果顯示，ArgE 蛋白中有 2 個可能的由膜內(nèi)側(cè)向膜外側(cè)的跨膜區(qū)域，其中顯著意義的 跨膜區(qū)域有兩個(分值超過 1000。第一個有顯著意義跨膜區(qū)域為第 62 個氨基酸到第 79 個 氨基酸，被賦予的分值為 1061；第二個有顯著意義跨膜區(qū)域為第 33

17、4 個氨基酸到第 351 個氨基酸，被賦予的分值為 351. 由膜外側(cè)向膜內(nèi)側(cè)跨膜的可能區(qū)域有 2 個，分別是位于第 62 個氨基酸到第 79 個氨基酸和第 336 個氨基酸到第 354 個氨基酸， 被賦予的分值分別為 939 和 1531. 結(jié)果顯示， ArgE 蛋白兩種不同的跨膜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。蛋白 N-端位于膜內(nèi)，第 62 個氨基酸到第 79 個氨基酸由膜內(nèi)側(cè)向膜外側(cè)跨膜。 2.5.5ARGE 蛋白卷曲螺旋的預(yù)測結(jié)果及分析 卷曲螺旋是兩個螺旋通過其疏水性界面相互纏繞在一起形成的十分穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。 COILS 值超過 0.5 被認(rèn)為存在卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，ARGE 蛋白中可能不存在卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。 -6

18、- 2.5.6 ArgE 蛋白的超家族分析 經(jīng)Superfamily 預(yù)測，ArgE 蛋白屬于依賴鋅的肽鏈端解酶超家族。如表2。 表2 ArgE 蛋白的超家族分析 Table 2 The superfamily classification of ArgE protein 序列Sequence 區(qū)域1 Domain Number1 超家族 Superfamily 區(qū)域2 Domain Number2 超家族 Superfamily soluble adenylyl cyclase 5188 依賴鋅的肽鏈端解酶家族 181301 細(xì)菌肽鏈端解酶二聚體功能域 InterPro Scan 分析 Ar

19、gE 蛋白結(jié)構(gòu)功能域，結(jié)果也表明，ArgE 蛋白中 5-188 存在依賴 于鋅的肽鏈端解酶功能域，折疊類似于磷酸化酶或水解酶，屬 a/ 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)蛋白，181-301 存在細(xì)菌肽鏈端解酶二聚體功能域，折疊類似于鐵氧化蛋白，屬 + 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)蛋白。推測 ArgE 蛋白屬于鋅離子依賴性，形成了以 折疊為中心、兩邊有多個長度不等的 螺旋環(huán)繞 的 a/ 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。 2.6 ArgE 基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 各蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中搜索到其同源模型1cg2(羧肽酶G2的晶體結(jié)構(gòu)。. 利用網(wǎng)站 (/tools/中Swiss Model程序可同源建模(homology mo

20、deling，推測ArgE 基 因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖2： 圖2 ArgE蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測圖 Fig2. Three-dimensional structure prediction map of ArgE protein 2.7 ArgE 蛋白 motif 及結(jié)構(gòu)功能域預(yù)測結(jié)果及分析 蛋白質(zhì)在進化過程中， 一些氨基酸必須足夠保守以實現(xiàn)蛋白質(zhì)的功能。通過確定這些 保守區(qū)域，就有可能預(yù)測蛋白質(zhì)的功能。在 75-84，110-147 位置呈現(xiàn) ArgE /dapE / ACY1 / CPG2 / yscS 家族標(biāo)記序列。 -7- 3 討論 對 ArgE 蛋白進行序列同源性分析，檢測得到的

21、具有高相似性的序列為已知蛋白但結(jié)構(gòu) 和功能大部分未知，這給預(yù)測 ArgE 蛋白的三級結(jié)構(gòu)帶來了困難，ArgE 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能 的研究具有創(chuàng)新意義. 本文利用國際互聯(lián)網(wǎng)上的相關(guān)生物信息學(xué)分析軟件ORF finder，ProtParam，Protscale等對 ArgE 基因編碼的蛋白進行了結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測分析。ArgE 蛋白主肽鏈由 383個氨基酸組 成，在第10、20、40、60、110、150、175、200、250、275、310、375個氨基酸處有較強的 形成 螺旋的傾向，在第50、70、105、140、190、220、235、295、325、340、345處氨基 酸處有較強的形成折疊

22、的傾向， 有隨機螺旋結(jié)構(gòu)，無隨機卷曲結(jié)構(gòu)；ArgE 蛋白無 N 端 信號肽， 不形成跨膜結(jié)構(gòu)， 無線粒體定位信號， 定位于細(xì)胞質(zhì)， 由于豆蔻酸?；B接位點， 有可能成為膜內(nèi)在蛋白； ArgE 蛋白與已知CPG2、 DEPE、 ACY1、 YSCS同源； 在75-84， 110-147 位置呈現(xiàn) ARGE /DAPE / ACY1 / CPG2 /YSCS家族標(biāo)記序列。ArgE 蛋白存在依賴于鋅的肽 鏈端解酶功能域、細(xì)菌肽鏈端解酶二聚體功能域及多個蛋白激酶 C、酪蛋白激酶II磷酸化位 點，推測ArgE 蛋白可能與細(xì)胞的生長繁殖相關(guān)。 參考文獻 1 張建平,李 峰,李 榮,劉 云,陳志輝,何志偉

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