1、一、目的要求11 通過從土壤中分離純化細菌，掌握培養基的制備與滅菌技術、微生物的分離純化方法和無菌操作技術。2 掌握常用的微生物鑒定方法及革蘭氏染色方法，掌握生理生化試驗的原理與方法。3 掌握微生物的鑒定技術、菌種保藏技術。二、基本原理1 培養基的配制與滅菌。培養基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產物的營養基質，用以培養、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產物。在自然界中，微生物種類繁多，營養類型多樣，加之實驗和研究的目的不同，所以培養基的種類很多。但是，不同種類的培養基中，一般應含有水分、碳源、氮源、能源、無機鹽、生長因素等。配制培養基是不僅需要考慮滿足這些營養成分的需求，而且應該

2、注意各營養成分之間的協調。此外不同微生物對 pH 要求不一樣，酵母的培養基的 pH 一般是偏酸性的，而細菌和放線菌的培養基的 pH 一般為中性或微堿性 ( 嗜堿細菌和嗜酸細菌例外 ) 。所以配制培養基時都要根據不同微生物的要求將培養基的 pH 調到合適的范圍。配制培養基的流程如下：原料稱量 溶解 加瓊脂熔化 調節pH值 分裝 塞棉塞和包裝 滅菌由于配制培養的各類營養物質和容器等含有各種微生物，因此，已配制好的培養基必須立即滅菌，如果來不及滅菌，應暫存冰箱內，以防止其中的微生物生長繁殖而消耗養分和改變培養的酸堿度所帶來不利的影響。實驗室最常用的滅菌方法是利用高溫處理達到殺菌效果。高溫的致死作用，

3、主要是使微生物的蛋白質和核酸等重要大分子發生變性。高壓蒸汽滅菌是微生物研究和教學中應用最廣、效果最好的滅菌方法，本實驗同樣采用高壓蒸汽滅菌。2 微生物的分離與純化。自然界中各種微生物混雜生活在一起，要研究某種微生物的特性，首先須使該微生物處于純培養狀態。從混雜的微生物群體中獲得只含有某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。一般是根據微生物對營養、pH、氧氣等要求的不同，供給它們適宜的生活條件，或加入某些抑制劑造成只利于該菌種生長，不利于其他菌種生長的環境，從而淘汰不需要的菌種。分離微生物常用的方法有稀釋平板分離法和劃線分離法。本次畢業設計是從中EPT菌懸液中分離多種有凈水功能的菌株，實驗將采

4、用稀釋平板分離法利用選擇性培養基分離菌種。3 分離菌株的鑒定。微生物的分類鑒定是微生物的重要內容，一般從菌落特征、形態、細菌特點及生理生化等方面進行鑒定。各種細菌在代謝類型上表現了很大的差異。不同的細菌分解大分子碳水化合物、蛋白質和過氧化氫的能力不同。這些都反映了它們是有不同的酶系統。細菌的這種生化反應的多樣性在自然界產生了兩種結果：第一、使自然界所有的有機分子都有可能得到分解；第二、使不同細菌之間有了互相作用和互相依賴的基礎。另一方面，微生物生化反應是微生物分類鑒定中的重要依據之一，細菌的生化反應的多樣性也被人們作為細菌的鑒定和分類方法來利用，可以鑒別一些在形態和其它方面不易區別的微生物。三

5、、實驗器材1 菌種：ETP菌懸液 2 培養基及培養菌種2：A牛肉膏蛋白胨培養基- - ETP菌懸液B 高氏培養基-放線菌C 反硝化細菌培養基試管-反硝化細菌D 硝化細菌培養基-硝化細菌E MRS培養基-乳酸菌F 光合細菌培養基-光合細菌G 馬鈴薯培養基-酵母菌H 淀粉培養基-細菌（生理生化鑒定）I牛肉膏蛋白胨斜面培養基- -細菌（生理生化鑒定）J 明膠培養基-細菌（生理生化鑒定）3 溶液和試劑：配制培養基藥品（附表）蒸餾水、95%乙醇、香柏油、二甲苯、盧戈氏碘液、5%孔雀綠水溶液、0.5%番紅水溶液，草酸銨結晶紫染液。4 儀器和其他用品：普通光學顯微鏡，電子秤，手提式高壓滅菌鍋,超凈工作臺，無

6、菌培養箱，4冰箱。250mL錐形瓶，無菌培養皿，無菌大小試管，無菌1mL移液管，載玻片，膠頭滴管，試劑瓶，燒杯。擦鏡紙，酒精燈 ,接種環，試管架，二甲苯，香柏油，蒸餾水，吸水紙，無菌平板，三角玻棒，玻璃棒,無菌棉塞，藥匙等。四、操作步驟1 培養基的制備與分裝。（1）稱量：按培養基配方比例依次準確地稱取藥品。（2）溶化：在沸水浴鍋中加熱熔化。（3）調pH ：用1mol/L NaOH或1mol/L HCl調pH至培養基所需pH。（4）分裝：將溶化的固體培養基趁熱加至漏斗上，裝大試管時，注意管口不要沾上培養基。大試管固體分裝裝量不超過試管的1/5，滅菌后傾斜放置。分裝三角瓶的量不超過三角瓶容積的一半

7、，滅菌后垂直待凝。（5）加棉塞：培養基分裝完畢后，在試管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物進入培養基內而造成污染，并保證有良好的通氣性能，然后包扎一層報紙。試管應先捆成一捆后再于棉塞外包扎報紙，貼上標簽，注明培養基名稱、日期、組別。根據上述步驟配制7種培養基，分別編號A-G:A牛肉膏蛋白胨培養基B高氏培養基C反硝化細菌培養基試管D硝化細菌培養基E MRS培養基F光合細菌培養基G馬鈴薯培養基2無菌水的制備。用移液管取4mL蒸餾水于6支小試管中，塞上棉塞，包扎報紙。3器皿的準備。（1）培養皿的包裝：每10套一包，用舊報紙包扎。（2）移液管的包裝：首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用長紙條包扎、打

8、結。（3）玻璃涂布棒的包裝：方法同移液管的包裝。4高壓滅菌。（1）滅菌：將所要滅菌物品放入高壓蒸汽滅菌鍋內，根據需要設定滅菌溫度和時間121，20min滅菌（MRS培養基中含有葡萄糖等成分，滅菌溫度和時間分別為113 ，30min）。（2）斜面培養基：滅菌完畢，將試管培養基擱成斜面，擱置的斜面長度以不超過試管總長度的一半為宜。（3）倒平板：在超凈工作臺將培養基冷至50左右，點燃酒精燈，在火焰旁倒平板。5微生物的分離與純化。（1）稀釋平板分離法：將5支4ml的無菌水試管排列好，按1/5、10-1、1/15、10-2及1/25、10-3依次編號（由于菌懸液本身濃度不是很高，實驗初期采用10-1、1

9、0-2、10-3、10-4、10-4、10-5、10-6效果不好，特別是10-5以后基本看不出長菌,。因此實驗采用1:5稀釋）。在無菌操作條件下，用1ml的無菌移液管吸取1ml菌懸液置于第一支試管中，持移液管吹洗三次，用手搖1分鐘將顆粒狀樣品打散。即為1/5濃度的菌液。用l毫升無菌移液管吸取lml 1/5濃度的菌液于第二支試管，將移液管吹洗三次，搖勻即為10-1濃度菌液。同樣方法，依次稀釋到10-3。稀釋過程如圖 （2）平板的制作 取6套無菌培養皿編號1、2、3、4、5、6，吸取0.5mL菌液于相應編號的培養皿內加熱融化培養基，當培養基冷至45左右時，右手拿裝有培養基的錐形瓶，左手拿培養皿，以

10、中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋靠近火焰，將皿蓋掀開，倒入培養基后將培養皿平放在桌上，順時針和反時針來回轉動培養皿，使培養基和菌液充分混勻，冷凝后即成平板，倒置于30培養2448h，然后觀察結果。倒平板 （3）稀釋平板涂布法：由于實驗的目的、所研究的微生物種類、所用的培養基及容器的不同，因此，接種方法也有多種，如斜面接種技術 、液體培養基中的菌種被接入液體培養基、液體接種 、穿刺接種、稀釋平板涂布法等 。本實驗中采用稀釋平板涂布法。稀釋平板涂布法與稀釋平板法、平板劃線法的作用一樣，都是把聚集在一起的群體分散成能在培養基上長成單個菌落的分離方法（此法接種量不宜太多，只能在0.5ml

11、以下）。培養時起初不能倒置，先正擺一段時間等水分蒸發后倒置。 分別將培養好的細菌、真菌進行平板分離。分別在適宜溫度培養，本實驗所用的培養箱的溫度是35。（4）菌種保藏（留作鑒定）：將分離得到的菌種進行斜面保藏。每株菌保存2支斜面。5 分離菌株的鑒定。（1）觀察菌種的培養特征。 （2） 細菌的革蘭氏染色，記錄菌體特征與染色特性。制片：制片方法與簡單染色相同。初染：加適量（以剛好覆蓋菌為宜）的結晶紫染色液染色1.5min，水洗。媒染：碘液媒染1min，水洗。脫色：連續滴加95%乙醇脫色2030s至流出液無色，立即水洗。復染：滴加番紅復染1.5min，水洗。 晾干：將染色好的涂片放空氣中晾干，用吸水

12、紙吸干載玻片上的水。鏡檢：鏡檢時先用低倍，再用高倍，最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色反應性。實驗完畢后的處理：將浸過油的鏡頭按下述方法擦干凈，a先用擦凈紙將油精頭上的油擦去。B用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦23次。C再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦23次。注意擦鏡頭是向一個方向擦拭。看后的染色玻片用廢紙將香柏油擦干凈。（3）細菌的芽孢染色。制片：按常規方法涂片、干燥及固定。加熱染色：向載玻片滴加數滴5%孔雀綠水溶液覆蓋涂菌部位，用夾子夾住載玻片在微火上加熱染液冒蒸氣計時并維持5min，加熱時注意補充染液，切勿讓涂片干涸。脫色：待玻片冷卻后，用緩流自來水沖洗至流出水無色為止。復染：用0.5%番紅水溶

13、液復染2min。水洗：用緩流自來水沖洗至流出水無色為止。鏡檢：鏡檢時先用低倍，再用高倍，最后用油鏡觀察芽孢和菌體的形態。結果：芽孢呈綠色，菌體呈紅色。（4）查伯杰氏手冊3，初步對細菌菌種進行鑒定。（5）進行以下細菌的生理生化試驗：淀粉水解試驗 將固體淀粉培養基溶化后冷卻至50左右，無菌操作制成平板。 用記號筆在平板底部劃成4個部分。 將選取的各菌分別在不同的部分點一下，在平板的反面分別在4個部分標明所接種細菌。 將平板倒置在37溫箱中培養24h。 觀察各種細菌的生長情況，打開平板蓋子，滴入少量盧戈氏碘液于平板中，輕輕旋轉平板，使碘液均勻鋪滿整個平板。如菌苔周圍出現無色透明圈，說明淀粉已被水解，

14、為陽性。根據透明圈的大小可初步判斷該菌水解淀粉能力的強弱，即產生胞外淀粉酶活力的高低。過氧化氫酶試驗菌體培養：將各菌接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養基，28培養24h。結果觀察：用接種環各取一小環涂抹于已滴有5過氧化氫的玻片上，如有氣泡則為陽性，無氣泡則為陰性。明膠液化試驗接種：用穿刺接種法接種各菌于明膠培養基中。培養：放20恒溫箱中培養48h。觀察結果：觀察培養基有無液化情況及液化后的形狀。五、實驗結果1細菌的形態觀察：2細菌的生理生化試驗：表一：淀粉水解試驗 結果菌名實驗現象結論混合菌液產生大量氣泡+放線菌不產生氣泡-硝化細菌產生氣泡+乳酸菌光合細菌酵母菌符號說明：在平板上滴加路哥氏碘液呈藍色，

15、而菌落周圍如有無色透明圈出現，記為“+”，稱為試驗陽性；否則，記為“-”，稱為試驗陰性。表二：過氧化氫酶試驗 結果菌名實驗現象結論混合菌液產生大量氣泡+放線菌不產生氣泡-硝化細菌產生氣泡+乳酸菌光合細菌酵母菌符號說明：試驗菌產氣泡記為“+”，稱試驗陽性；否則記為“-”，稱試驗陰性。表三：明膠液化試驗 結果菌名實驗現象結論混合菌液產生大量氣泡+放線菌不產生氣泡-硝化細菌產生氣泡+乳酸菌光合細菌酵母菌符號說明：置于冰箱30min,取出后立即傾斜試管，觀察試管培養基的狀態，若部分或全部呈液化狀態，記為“+”，稱為試驗陽性；否則，記為“-”，稱為試驗陰性。結論：待測菌 分解明膠。六、附：本實驗用到的各

16、種培養基配方。A 牛肉膏蛋白胨培養基牛肉膏 1.25g蛋白胨 2.5gNaCl 1.25g瓊脂 4 g水 200mLpH 7.07.2121C滅菌20minB 高氏1號可溶性淀粉 4 gK2HPO4 0.1 g NaC1 0.1 g MgSO4 0.1 g KNO3 0.2 g FeSO4 0.002 g水 200mL 瓊脂 4 g PH 7.2-7.4C 反硝化細菌培養基KNO3 0.4 g MgSO4 0.02 gK2HPO4 0.1 g 酒石酸鈉 4 g水 200mL 瓊脂 4 g PH 7.2-7.4D 硝化細菌培養基NaC1 0.06g (NH4)2SO4 0.1 g K2HPO4

17、0.2 g MgSO4 0.02 g FeSO4 0.03 g CaCl2 1.5 g 水 200mL 瓊脂 4 g PH 7.2-7.4E MRS培養基蛋白胨 2 g牛肉膏 2 g、酵母膏 1 g 檸檬酸氫二銨 0.4 g葡萄糖 4 g 吐溫 80 0.2 mL乙酸鈉 1 g、K2HPO4 0.4gMgSO4 0.02 gMnSO4 0.05 g水 200mL 瓊脂 4 gPH 7.2-7.4當MRS培養基冷卻至4550時,加入已滅菌的碳酸鈣, 充分混勻,倒平板。F 光合細菌酵母膏 0.06 g蛋白胨 0.2 g NaAC 0.4 g NaHCO3 0,2 g NH4C1 0.2 g NaC1 0.2 gKH2PO4 0.1 g K2HPO4 0.04 g MgSO4 0.O4 g CaC12 0.01 g 水 200mL 瓊脂 4 gPH 7.2-7.6G 馬鈴薯培養基馬鈴薯 40 g葡萄糖 4 g瓊脂 5 g水 200mLpH 自然馬鈴薯去皮，切成塊煮沸半小時，然后用紗布過濾，再加糖及瓊脂，溶化后補足水至2