1、會計學1酶聯免疫分析法酶聯免疫分析法n1971年第一屆國際免疫學會議 將免疫學與微生物學分開發展成一門獨立的學科。境穩定的一種生理性功能。第一節第一節 酶聯免疫分析概述酶聯免疫分析概述n具備上述兩種特性的物質為完全抗原，僅具有 免 疫 反 應 性 的 物 質 被 稱 為 半 抗 原（hapten）。第一節第一節 酶聯免疫分析概述酶聯免疫分析概述反應，這種反應具有高特異性（即專一性）和可逆性。第一節第一節 酶聯免疫分析概述酶聯免疫分析概述衡常數（親和常數）。Kkk21AbAgAg-Ab第一節第一節 酶聯免疫分析概述酶聯免疫分析概述用已知抗體檢測某些藥物、激素等各種半抗原物質。第一節第一節 酶聯免

2、疫分析概述酶聯免疫分析概述免疫分析標記免疫分析放射免疫分析法化學發光免疫分析法電化學免疫分析法熒光免疫分析法酶聯免疫分析法競爭性酶聯免疫分析非競爭性酶聯免疫分析均相酶聯免疫分析非均相酶聯免疫分析非標記免疫分析沉淀反應、凝集反應、免疫電泳、免疫擴散第一節第一節 酶聯免疫分析概述酶聯免疫分析概述第一節第一節 酶聯免疫分析概述酶聯免疫分析概述第一節第一節 酶聯免疫分析概述酶聯免疫分析概述第一節第一節 酶聯免疫分析概述酶聯免疫分析概述酶酶來源來源EC編號編號辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶辣根辣根1.11.1.7酸性磷酸酶酸性磷酸酶動植物動植物3.1.3.2堿性磷酸酶堿性磷酸酶牛腸牛腸3.1.3.1-D-

3、半乳糖苷酶半乳糖苷酶大腸桿菌大腸桿菌3.2.1.23葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶曲霉菌曲霉菌1.1.3.4脲酶脲酶Jack豆豆3.5.1.5青霉素酶青霉素酶3.5.2.6過氧化氫酶過氧化氫酶肝肝1.11.1.6葡萄糖淀粉酶葡萄糖淀粉酶根霉菌根霉菌3.2.1.3碳酸苷酶碳酸苷酶牛紅細胞牛紅細胞4.2.1.1乙酰膽堿酶乙酰膽堿酶3.1.1.7葡萄糖葡萄糖-6-磷酸脫氫酶磷酸脫氫酶腸系膜明串細菌腸系膜明串細菌1.1.1.49溶菌酶溶菌酶雞卵白雞卵白3.2.1.17蘋果酸脫氫酶蘋果酸脫氫酶豬心線粒體豬心線粒體1.1.1.49無機焦磷酸酶無機焦磷酸酶大腸桿菌大腸桿菌3.6.1.1熒光素酶熒光素酶發光生物發光

4、生物1.3.12.7丙酮酸激酶丙酮酸激酶哺乳動物組織哺乳動物組織2.7.1.40酶聯免疫分析常用酶酶聯免疫分析常用酶第一節第一節 酶聯免疫分析概述酶聯免疫分析概述（purpurogallinHRP1位。n用于標記的HRP比活性應大于250U/mg。第一節第一節 酶聯免疫分析概述酶聯免疫分析概述n用作標記的AP比活力應大于1000U/mg。第一節第一節 酶聯免疫分析概述酶聯免疫分析概述n葡萄糖氧化酶在4下可穩定存在612個月。第一節第一節 酶聯免疫分析概述酶聯免疫分析概述第一節第一節 酶聯免疫分析概述酶聯免疫分析概述例；加入酶反應底物，底物被酶催化為有色產物，產物量與標本中受檢物的量相關，用分光

5、光度法進行定量。g。*( )( )gbgbggbAAAAFBAAA第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法n一般蛋白質的包被濃度為0.120g/ml。第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法列于表7-2。第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法編編號號吐溫吐溫20/%組成組成稀稀釋釋液液10.05PBS 0.01mol/L，pH 7.42PBS 0.05mol/L，pH 7.43PBS 0.05mol/L，pH 7.4，含，含EDTA 10mmol/L4PBS 0.

6、05mol/L，pH 6.9，含，含EDTA 10mmol/L洗洗滌滌液液10.1PBS 0.01mol/L，pH 7.22PBS 0.01mol/L，pH 8.03Tris-HCl緩沖液緩沖液0.01mol/L，pH 8.0，NaCl 0.15mol/L表表7-2 常用的抗體稀釋液和洗滌液常用的抗體稀釋液和洗滌液第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法nTMB的，第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法-和溴麝香草酚藍（21

7、）等。第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法NH2+ HCCHOONH2+CCNHHNCCNHHNCCNHHN+圖圖7-2 戊二醛一步法反應原理戊二醛一步法反應原理一步法一步法 將戊二醛將戊二醛直接直接加入加入酶與抗體的混合物酶與抗體的混合物中，反應后即得酶標記中，反應后即得酶標記抗體。抗體。 該法操作該法操作簡便簡便、有效有效，重復性好重復性好。 缺點是交聯反應是缺點是交聯反應是隨機隨機的，酶與酶、抗體與抗的，酶與酶、抗體與抗體之間有可能交聯。體之間有可能交聯。第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法HCCHOONH2+

8、CCNOHHCCNHHNNH2圖圖7-3 戊二醛二步法反應原理戊二醛二步法反應原理兩步法兩步法 先將先將酶與戊二醛酶與戊二醛作用作用，透析透析除去多余的除去多余的戊二醛后，再與戊二醛后，再與抗體抗體作作用而形成酶標抗體；用而形成酶標抗體；或或先將抗體與戊二醛作用先將抗體與戊二醛作用，再與酶聯結。，再與酶聯結。 兩步法的產物中絕大部兩步法的產物中絕大部分的酶與蛋白質是以分的酶與蛋白質是以1:1的比例結合的，的比例結合的，有助于有助于本底的改善本底的改善。第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法n圖7-4 過碘酸鹽氧化法第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法第二節第二節 酶聯

9、免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法圖圖7-5 雙抗體夾心法雙抗體夾心法第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法圖圖7-6 間接法間接法第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法圖圖7-7 競爭法競爭法第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法圖圖7-8 異種動物抗體夾心法異種動物抗體夾心法第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法和IgG連接起來。n最后讓酶與抗酶抗

10、體結合，通過對底物的作用而揭示在固相載體上待測抗原的存在。第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法。n因為制備抗酶抗體必須在動物中進行，故抗酶抗體法多適用于檢測動物中的抗體。第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法圖圖7-9 抗酶抗體法抗酶抗體法第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法光度。n選擇吸光度為1的稀釋度作為酶標抗體最適濃度。圖圖7-10 酶標抗體濃度的選擇酶標抗體濃度的選擇第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法n的飽和包被濃度。圖圖7-11 抗原包被量和抗原包被量和ELISA反應的關系反應的關系 第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附

11、分析法包被質量濃度（包被質量濃度（mg/mlmg/ml）ELISAELISA測定結果（測定結果（A A492492SDSD）（n n=4=4）4 41.0981.0980.06280.06281 1* *1.0111.0110.03020.03020.50.50.9690.9690.08760.08760.250.250.7920.7920.10230.1023第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法時，IgG量為0.62mg/ml；0.94表示酶、戊二醛結合后，A280nm增加約6。403/0.4nmmg mLA酶量（）62. 09

12、4. 0)42. 0(/IgG403280nmnmAAmLmg）量（第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法結果。）結合物溶液量（）每毫升溶液中的酶量（）結合物中酶量（mLmLmgmg/%100%）標志時加入的酶量（）結合物中酶量（酶結合率mgmgHRPHRP/HRPHRP/160000IgGIgG/IgGIgG/40000mg mLmg mLmg mLmg mL（）分子量（）（摩爾比）（）分子量（）第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法n采用放大系統是提高ELISA靈敏度的主要途徑。第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法ELISAn生物素-親和素標記體系有靈

13、活多變的運用方式，可以適應不同的分析設計。第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法蛋白，靈敏度放大兩個數量級。第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法體、酶結合物、底物和各種濃縮的稀釋液、緩沖液等。n這些試劑在冰箱中可保存半年以上，因此實驗室中只需要用蒸餾水稀釋全套試劑即可。第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法nELISA測定125SerIL-2中青霉噻唑蛋白的結果如下（見表7-4）：第二節第二節 酶聯免疫吸附分

14、析法酶聯免疫吸附分析法表表7-4 ELISA實驗測定實驗測定125SerIL-2*中青霉噻唑蛋白中青霉噻唑蛋白第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法指每摩爾反應物輻射出光子的量。第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析+D*C B+AhvC*C 第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析、。 第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析 第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析 圖圖7-12 吖啶酯氧化反應過程吖啶酯氧化反應過程第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析 第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免

15、疫分析 圖圖7-13 光澤精的氧化反應光澤精的氧化反應第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析。 第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析 第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析 圖圖7-14 魯米諾、異魯米諾及其某些衍生物的結構式魯米諾、異魯米諾及其某些衍生物的結構式第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析 圖圖7-15 魯米諾化學發光反應過程魯米諾化學發光反應過程第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析 第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析 圖圖7-16 咯吩堿的化學發光反應咯吩堿的化學發光反應第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析獲化學能

16、，使熒光體處于激發態，退激至基態時，放出光子。 第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析疫測定過程。 第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析 第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析n光反應。 第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析 第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析n某些酸類衍生物尤其是對碘酸、苯甲酸等的增強效果更佳，可使其發光強度提高1000倍，且延長發光持續時間。 第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析度大，持續時間長，發光穩定，故生物發光分析靈敏度高，容易測定。第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析 n越廣泛地引起人們的重視。 第

17、三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析 第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析 第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析max=490nm，從而可以進行生物發光酶聯免疫檢測。 第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析n以鄰苯三酚-H2O2為底物測定登革熱型病毒b、傷寒桿菌、細菌內毒素等物質。 第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析 第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析 第三節第三節 發光酶聯免疫分析發光酶聯免疫分析么要求？HRP的常用底物有哪些？AP的常用底物有哪些？-D-半乳糖苷酶的常用底物有哪些？青霉素酶的常用底物有哪些？ 思考題思考題些？化學發光酶聯免疫分析常用的發光增強劑有哪些？17、最常用于生物發光酶聯免疫分析的生物發光反應有哪些？ 思考題思考題第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法和IgG連接起來。n最后讓酶與抗酶抗體結合，通過對底物的作用而揭示在固相載體上待測抗原的存在。第二節第二節 酶聯免疫吸附分析法酶聯免疫吸附分析法光度。n選擇吸光度為1的稀釋度作為酶標抗體最適濃度。圖圖7-10 酶標抗體濃度的選擇酶標抗