1、第25章 病毒及其疫苗的生產制備技術第一節病毒的生產制備病毒需在活的敏感細胞中才能增殖，在細胞培養技術不成熟之前，人們為研究病毒，往 往采用雞胚接種或動物接種的方法來分離、鑒定病毒或制備一定量的病毒液，但這種方法因 個體和種屬差異，不僅許多病毒難以找到合適的敏感動物，而且即使在敏感動物中繁殖，往 往個體差異大而影響結果的判定，隨著細胞培養技術的發展，首先在病毒學研究方面獲得了 廣泛的應用，為病毒的繁殖、鑒定提供了來自不同動物（包括人）、不同組織的細胞來源， 通過敏感性篩選，目前絕大多數病毒均可有相應的敏感細胞，為病毒的分離、鑒定和增殖創 造了條件。同時也為病毒的大量生產提供了細胞來源，隨著細胞

2、大量生產技術的發展，因此 對病毒來說只要有敏感的細胞，就可以進行大規模生產。一、病毒生產的目的和用途1、為了制備大量的病毒抗原，以制備病毒的亞單位疫苗或表面抗原疫苗，或用病毒抗 原制備免疫血淸（抗體）。2、為了制備病毒的減毒活疫苗或滅活的死疫苗，以用于預防接種。3、為了生產基因改造后或重組有其它多肽因子的病毒，以用于基因治療或殺腫瘤治療 及基因疫苗的預防接種。4、為了制備干擾素的病毒誘生劑（NDV、仙臺病毒等），用于干擾素的生產。5、生物戰用的病毒生物戰劑。常選用毒力強、抵抗力強、對不同國家人群最敏感的病 毒，又能通過氣溶膠或昆蟲和污染的水土進行傳播的病毒。這是戰爭狂們正在開展的研究， 應警惕

3、。二、病毒生產制備的方法1、動物接種，如狂犬病毒、腦炎蟲媒病毒釆用鼠、兔腦接種后收取腦組織制成懸液。2、雞胚、鴨胚接種：如流感病毒、副流感病毒（NDV-F）.仙臺病毒等，目前尚無敏感 細胞，常采用910日胚齡的尿曩腔接種，37。C孵育72小時收荻尿液，用雞紅血球測定血 凝效價。Q熱用7日齡鴨胚進行卵黃囊接種收獲卵黃羹，馬腦炎病毒常采用IO日齡雞胚體 接種，收獲全胚體液等。3、細胞培養法（詳見第二篇第18章）不同的病毒選用相應的敏感細胞，釆用轉瓶培養、多層培養、徽載體培養或懸浮攪拌培 養等方法,先大量增殖細胞，然后接種一定量的病毒，繼續培養適當時間時，凍融細胞后，離 心收獲上清。以上病毒大量生產

4、后可制作病毒疫苗（死疫苗或減毒活疫苗），也可用來作干擾素誘生 劑或提取病毒表面抗原成分，但反對用作生物戰劑，危害人類健康和生命。第二節病毒疫苗的生產制備病毒疫苗的生產制備與病毒的生產制備基本相同，目前進行人工主動免疫，用于病毒病 預防的疫苗有滅活疫苗（KiIled VaCCine）,又稱死疫苗，減毒活疫苗（LiVe VaCCine）, 亞單位疫苗，多肽疫苗、基因缺失的減毒活疫苗，基因工程亞單位疫苗，重組牛痘多價疫苗。一、病毒疫苗的種類（一）滅活疫苗：目前常用的有流行性乙型腦炎疫苗，狂犬病疫苗（二倍體細胞與地鼠腎 細胞可用于生產狂犬病病毒固定毒滅活疫苗），流感滅活疫苗。常用甲醛為滅活劑，以滅活

5、病毒核酸而不影響其抗原性。（二）減毒活疫苗，通常采用自然法或人工法，通過動物傳代或細胞傳代篩選對人毒力低 的變異株病毒。常用的有脊髓灰質炎疫苗、麻疹疫苗、流感溫度敏感突變株疫苗、流行性腮 腺炎疫苗、風疹疫苗、黃熱病疫苗以及一些聯合疫苗（如麻疹、腮腺炎、風疹聯合疫苗）。（三）亞單位疫苗：用化學試劑裂解病毒，提取包膜或衣殼上的亞單位，除去其核酸，以 此制成的疫苗稱亞單位疫苗。如流感病毒的包膜提取后制成的血凝素和神經氨酸酶亞單位疫 苗。（四）多肽疫苗：采用乙肝攜帶者血提取的HBSAg的乙型肝炎疫苗或釆用基因工程法制備 的HBsAg基因表達產物制備的疫苗。（五）基因缺失的減毒活疫苗：在病毒的基因組中，

6、使其有毒力的相關基因發生缺失而制 成的減毒活疫苗稱基因缺失的減毒活疫苗，如狂犬病毒的胸昔激酶（TK）缺失株（第一代） 和卯3區缺失株（第二代），單純皰疹病毒的22基因缺失株，目前有待進一步研究。（六）基因工程亞單位疫苗：將病毒表面抗原基因，通過基因重組，在酵母或CHO細胞中 進行表達亞單位多肽抗原成分而制成的疫苗，稱基因工程亞單位疫苗，如乙型肝炎病毒的表 面抗原HBSAg的基因在酵母和CHO細胞中表達而提取獲得的純品HBSAg多肽。即將上市。（七）重組牛痘多價活疫苗。以牛痘苗為載依來表達數十種外源性病毒抗原基因，如：HAV、 HBV、麻疹病毒、I型和II型HSV、EBV,狂犬病毒等抗原基因，經

7、基因重組后而制成的牛痘 苗病毒，經一次劃痕接種可使機體同時能獲得對多種病毒的免疫力，大大減少了接種次數。 此外腺病毒和脊施灰質炎病毒的活疫苗也可作為載體與輪狀病毒的抗原基因重組后的活疫 苗，經口服后可同時獲得兩種病毒的免疫力，有待于進一步研究、開發。上述病毒疫苗有的是采用細胞培養技術和細胞工程來進行生產制備的，現將采用細胞工 程制備病毒疫苗種類和敏感細胞以及生產方式規于下表。二、細胞培養法制備的常用疫苗（如表25-1 ）o表25-1采用細胞培養法生產的常用病毒疫苗疫苗制備疫苗 的細胞培養方法名稱活/死（疫苗株）脊髓灰 質炎疫苗滅活（SaIk株） 活（Sabin 株）猴腎細胞（原代/2-3代）V

8、erO細胞轉瓶培養 微載體培養腮腺 疫炎苗活（ME株）幼地鼠、狗腎 豚鼠腎細胞轉瓶培養 羅氏瓶培養麻疹活疫苗EdOnIOnSte、Ll6、滬 191、Moraten、SChWar2 株原代雞胚纖維母 細胞，人二倍體人羊膜、狗腎、羊腎 豚鼠腎細胞羅氏瓶培養 轉瓶培養單純瘡疹 病毒疫苗死（72株）兔腎、豚鼠腎 豚鼠胚成纖維細胞羅氏瓶培養 轉瓶培養巨細胞病毒疫 苗活（TOWne 株）WI-38人胚肺細胞轉瓶培養狂犬病毒疫苗死(V01V02 株)(CUS 株)人二倍體細胞微載體培養流行性乙型 腦炎疫苗滅活（5-3株）人二倍依細胞多層滋養增殖券森林腦炎病毒疫苗滅活雞胚纖維母細胞 幼地鼠腎細胞轉瓶培養三、

9、用細胞培養制備病毒疫苗的優點：病毒疫苗的制備開始多用動物臟器、禽類胚胎（第一代疫苗）。然而因來源困難，很不 經濟，制作麻煩，數量受限，更危險的是這些組織中間可能含有潛在致癌病毒和慢性病毒， 后改用原代細胞來制作疫苗（第二代疫苗），如麻疹疫苗、乙腦疫苗等，隨著細胞培養的發 展，特別是自70年代后我國二倍體細胞株相繼建立，為疫苗生產創造了極為有利的基礎， 這比用原代細胞制備疫苗更優越。如：（1）在細胞傳代期間可進行比較全面的檢查，特別是對潛在病毒和致癌性的檢查，確 保安全。（2）可使逐漸適應于無血清（或無蛋白）培基中生產繁殖，以排除過敏因素。（3）可挑選對病毒敏感的細胞克隆。以利病毒在細胞量增殖，

10、有助于疫苗產量的提高。（4）易于大量生產和進行連續自動化工業生產，以滿足量的需求。國外已建立的二倍體細胞WI-38、MRC-5、IMR-90等，國已建立KMB-17, 2BS, SL-7等 均已用于疫苗生產，如麻疹活疫苗、乙型腦炎疫苗、脊髓灰質炎疫苗、腮腺炎疫苗等，從目 前發展來看，用二倍體細胞制備疫苗將有取代其他原代細胞和傳代細胞的趨勢，但目前仍有 一些病毒疫苗的制備還需用原代細胞，近年來有人主用腫瘤細胞制備人用滅活疫苗。四、提高疫苗的效力常釆用的方法：（1）細胞的藥物處理：用某些藥物處理細胞后可以刺激病毒繁殖（如下表），其方法為：在 細胞形成單層后，用一些化學藥物來處理，然后洗去，再接種病

11、毒，就可使病毒提前成熟， 產量高，現列表如下：處理細胞的藥物刺激的病毒5-碘-2-脫氧尿核忒風疹、腺病毒、巨細胞病SV-40維生素A或TWeen-80脊髓灰質炎病毒、濾泡性口腔炎病毒膽固醇或卵磷質脊髄灰質炎病毒DEAE-dextran脊髓灰質炎病毒、風疹痘類病毒，付流感病毒胰酶痘類病毒、呼吸道腸道病毒，流感病毒、鼻病毒二甲亞楓脊髄灰質炎病毒、流感、皰疹病毒放線菌素D麻疹、脊髓灰質炎病毒、付流感病毒（2）在維持液中補充某些物質也有利于某些病秦的復制、列表如下:增加的藥物刺激的病毒TWeen-80或油酸鈉乙型腦炎谷氨酰胺麻疹、脊髓灰質炎病毒、仙臺病毒精氨酸痘類病毒、皰疹病毒脯氨酸、賴氨酸乙型腦炎（

12、3）毒種的選擇：經過空斑挑選產量高的大空斑毒株，精制毒種可提高病毒產量。（4）病毒液的濃縮：經濃縮后，病毒濃度增高，從而效價也隨之上升。五、影響疫苗質量的因素：（1）毒種：毒種的優劣不僅影響疫苗的產量，而且也影響疫苗的質量，毒種不純會產 生相互干擾，減毒活疫苗毒種若毒力回升易造成事故，因此毒種的選擇應挑選那些致病性低, 免疫效價高而持久，抗原譜廣的，易增殖，便于生產，可在傳代細胞上傳代的毒種。（2）培養病毒的細胞：細胞若有潛在的致癌性病毒或慢病毒，以及有支原體污染均不 能用作疫苗生產。對此因素應嚴格檢查。此外若細胞本身發生轉化后，不宜于制備活疫苗， 只能制備一些滅活疫苗或亞單位疫苗。（3）培養

13、液：培養細胞的營養液中多少含有一定量的血清蛋白，在疫苗使用中常會出 現某種程度的過敏反應，為此，應盡量使細胞適應于無血清蛋白的培養基中，以消除過敏源。（4）甲醛滅活劑的使用：甲醛能使病毒滅活，但仍保持其抗原性，因此普遍用來制備 滅活病毒疫苗，但要控制含量。病毒被滅活的程度與滅活的溫度和甲醛的濃度等因素有密切關系。一般用熱滅活的方 法，采用在37。C滅活一定時間。經熱滅活疫苗，不但其免疫原性、免疫效力和穩定性不受 影響，而且滅活病毒的溫度提高以后，滅活時間相對可以縮短，滅活劑的用量也可以減少。甲醛能刺激局部而引起疼痛和紅腫，并有釋放組織胺的作用。因此制備疫苗時減少甲醛 濃度是必要的。如果疫苗游離

14、甲醛含量降低到一定程度后，可考慮不需再用亞硫酸氫鈉來中 和甲醛。這對減少注射后疼痛及便于推廣預防接種有重要意義。六、生產病毒和制備病毒疫苗的常用方法（一）制備工藝流程（1）脊髓灰質炎病毒活疫苗制備工藝猴腎細胞培養-接種病毒（測0%正常細胞對照）收獲病毒，合并，加MgCl2-* 無菌試驗一B病毒檢查（兔腎細胞）一分亞批一 病毒滴定一 B病毒復檢（家兔）-* 分裝病毒滴定一結核桿菌檢查一 分裝一 病毒滴定一-猴病毒檢查（獲腎細胞）（SV40）-病毒效價滴定-合并，過濾加MgCl2-無菌試驗-柯薩奇病毒檢查（乳鼠）-型特異性檢查-T特征試驗-猴體殘余致麻痹力試驗（安全試驗）病理切片-無菌試驗保存于-

15、2（C待檢定合格后加工糖丸脊髄灰質炎活疫菌工藝流程2、流行性乙型腦炎病毒死疫苗制備工藝地鼠腎J剪碎，腹酶消化地鼠腎細胞懸液370C,3天J細胞培養液，pH7.0pH7.2單層細胞洗滌細胞，去除牛血清10 l105濃度病毒感染細胞3234cC培養23天收獲病毒液（收二次）按1:2000加入甲醛220C, 8 天滅活病毒液J合并，安全及效力試驗 原液加入亞硫酸氨鈉半成品分裝成品檢定（包括理化性質，無菌試驗、安全試驗,防腐劑、試劑及殘余牛血清含量等）合格成品（二）生產方法：病毒和病毒疫苗的生產方法基本相同，其規模取決于細胞生產規模，因此上述介紹的細 胞大量生產的方法和工藝均可用來生產病毒和病毒疫苗，

16、可根據需要及適宜生產條件來選用 培養裝置，如轉瓶培養，因設備簡單，便于生產單位采用。而多層培養，微載體培養，目前 國外已用于生產，我國仍在研究中。懸浮攪拌培養的簡易裝置已應用于疫苗生產，全自動懸 浮發酵罐，在干擾素生產中有應用，但在疫苗生產中正在試用，下面著重介紹微載體培養法 生產病毒的技術。1、微載體懸浮培養細胞的病毒生產工藝作者選VSV病毒來接種經微載體培養的敏感細胞，病毒的效價測定用549細胞（也可 用WiSh或HeP-2細胞或雞胚纖維母細胞測TCIDG,病毒的效價為6 LOg TCID5m L, 用雞胚細胞空斑法測定一般為IOTfUILO VSV在方瓶貼壁細胞中的增殖（IOOnlL方瓶

17、,IomL培養基）待BHK21、BHKl3、CHO-KI 細胞長滿單層，棄上清加入10 2VSV病毒懸液0. 2ml, 37。C吸附1小時，加病毒維持液培養 20小時，于-30。C凍存，待測效價。 VSV在微載體懸液培養的細胞中增殖。微載體培養的BHK21或BHKl3、或CHO-Kl細胞，34天后細胞密度已達IXlOli細胞mLI靜置30分鐘盡量吸去原培養基I 37eC將10 2VSV病毒按50mL培養體積加入ImL病毒液于微載體細胞中I 37eC 50rmin 攪拌 5 分鐘靜置吸附1小時（每20分鐘攪拌2分鐘）I加入病毒維持液至原體積37cC繼續攪拌培養20小時于-3（C凍融后I 2000

18、 r/min低溫離心10分鐘收集上清，即為YSV增殖的病毒液，分裝凍存，待測效價結果，在微載體懸浮培養的三株細胞所繁殖VSY病毒不僅產量大，而且病毒效價平均高 ILogTCIDso,尤以CHO-KI效價最高，平均可達7. 75IogTCIDso比原先的毒種效價還要高 1.75LOgTClDa>,又起到了提高病毒效價的作用。此方法也可應用于生產病毒疫苗，只要疫苗株病毒的敏感細胞能在微載體上大量生產。 若疫苗株是減毒活疫苗株，此法生產的病毒可直接制備活疫苗。若疫苗株為非減毒活疫苗株, 此法生產的病毒可用甲醛滅活法制備死疫苗。2、轉瓶培養法此法是目前各大生物制品研究所常用于生產疫毒疫苗的方法，如生產脊髓灰質炎病毒疫 苗，麻疹疫苗等。將細胞制備成懸液后，在溫室（37。C）使支架以812轉/小時緩慢轉動，以