1、響應面法優化植物乳桿菌和凝結芽孢桿菌凍干保護劑的研究摘 要:采用單因素實驗和響應面實驗設計聯用的方法，篩選優化植物乳桿菌和凝結芽孢桿菌真空冷凍干燥的保護劑配方。單因素實驗結果表明: 脫脂奶粉、麥芽糖和谷氨酸鈉 3 種保護劑效果較好，能夠顯著提高菌種對冷凍干燥環境的耐受能力。以細胞存活率為響應值，混合保護劑的最佳配方為脫脂奶粉 7. 06%、麥芽糖 6. 46%和谷氨酸鈉 6. 70%，植物乳桿菌冷凍干燥存活率達到 92. 95%，凝結芽孢桿菌的冷凍干燥存活率達到 94. 1%。關鍵詞:植物乳桿菌; 凝結芽孢桿菌; 真空冷凍干燥; 保護劑; 響應面法直投式發酵劑是一種不需活化和擴增便能直接應用于

2、生產的新型發酵劑，具有活菌含量高、菌種保質期長等優點，也防止了菌種退化和污染，提高了發酵制品工業的勞動生產率和產品質量1。由于菌種對熱刺激的敏感性，直投式發酵劑工藝上多采用真空冷凍干燥法，冷凍和干燥過程中會使部分細胞損傷、死亡及某些蛋白酶分子鈍化2。為了提高菌種凍干后的存活率，凍干前加入保護劑減少凍干損傷是必要的，使其最大限度發揮保護功能，提高發酵菌劑的存活率3。不同的保護劑各有優缺點，單一保護劑往往不能滿足菌體抵抗外界惡劣環境的條件，而復配保護劑中各保護劑在冷凍干燥中則發揮各自的特性并能起到增效作用4。本研究以凝結芽孢桿菌和植物乳桿菌為試驗菌株，采用單因素實驗選擇幾種效果較好的凍干保護劑，再

3、以植物乳桿菌為試驗菌株，采用 Design Expert 軟件的中心組合設計方法設計響應面試驗對幾種保護劑的最佳水平和交互作用進行研究探討5，然后對凝結芽孢桿菌進行冷凍干燥實驗，從而篩選出適用于兩菌種的優良復合保護劑。1 材料與方法1. 1 材料與設備凝結芽孢桿菌 ( Bacillus coagulans) ，四川理工學院實驗室保藏; 植物乳桿菌 ( Lactobacillus plantarum) ，購于四川微生物菌種中心; MS 固體培養基; MS 液體培養基; MJ 250 生化培養箱( 上海美譜達儀器有限公司) ; LGJ 02 冷凍干燥機( 上海久世環保科技有限公司) ; 0. 22

4、 m 濾膜( 上海海凡濾材有限公司) ; TDL 5C型離心機( 上海安亭科學儀器廠) 。1. 2 試驗方法1. 2. 1 工藝流程菌種活化富集培養離心收集菌體加保護劑活菌計數預凍真空冷凍干燥凍干粉活菌計數1. 2. 2 試驗設計通過單因素試驗確定對細胞凍干存活率影響突出的幾個因素; 然后利用響應面設計方法中的 Box Behnken Design 進行試驗。1. 2. 3 菌體制備菌種以 5% 的接種量接種于 MS 液體培養基中，30 下培養 18 22 h，鏡檢無雜菌后，等量分裝于無菌離心管中，4000 r/min，4 離心15 min，棄上清液收集菌體。1. 2. 4 保護劑的制備預先將

5、脫脂奶粉、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、硫酸錳、甘露醇、谷氨酸鈉、L 半胱氨酸分別取一定量溶解于 100 mL 無菌水的試管中，其中，氨基酸類和糖類保護劑溶液用 0. 22 m 孔徑的濾膜過濾除菌，其它保護劑溶液 115 ，滅菌 15 min，備用。1. 2. 5 活菌計數平板混菌計數法( 參照 GB/T4789. 2 2003) 。1. 2. 6 真空冷凍干燥在無菌操作臺上，將離心所得菌泥樣品用滅菌后的保護劑溶液沖洗到無菌培養皿中，放在 80 條件下預凍 2 h，待樣品完全凍結后迅速轉移到冷凍干燥機中冷凍干燥 24 h，菌粉含水量 3% 5%即可收獲成品。1. 3 菌種存活率的計算存活率 =凍干

6、后樣品測得的活菌數凍干前樣品測得的活菌數× 100%2 結果與分析2. 1 保護劑單因素實驗根據保護劑對菌體冷凍干燥的保護機理，結合有關文獻報道6-7，選取脫脂奶粉、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、硫酸錳、1 甘露醇、谷氨酸鈉、L 半胱氨酸作為冷凍干燥保護劑，以存活率為指標，考察對凝結芽孢桿菌與植物乳桿菌的凍干保護作用，結果見表 1。表 1 保護劑單因素實驗結果保護劑植物乳桿菌存活率( %)凝結芽孢桿菌存活率( %)脫脂奶粉 10% 78. 3 82. 5麥芽糖 10% 70. 4 74. 6蔗糖 10% 25. 6 42. 1可溶性淀粉 10% 22. 8 34. 7硫酸錳 5% 33.

7、 7 56. 9甘露醇 10% 52. 3 47. 6谷氨酸鈉 5% 51. 2 65. 3L 半胱氨酸 5% 23. 3 17. 6由表 1 可以看出，8 種保護劑對植物乳桿菌的保護作用影響大小次序為: 脫脂奶粉 麥芽糖 甘露醇 谷氨酸鈉 硫酸錳 蔗糖 L 半胱氨酸 可溶性淀粉;對凝結芽孢桿的影響大小次序為: 脫脂奶粉 麥芽糖 谷氨酸鈉 硫酸錳 甘露醇 蔗糖 可溶性淀粉 L 半胱氨酸，其中脫脂奶粉、麥芽糖和谷氨酸鈉對兩種菌種都有較好的凍干保護作用，存活率均能達到 50% 以上，進而對這三種物質組成的復配保護劑的比例做更深入的研究。2. 2 響應面優化設計結果與分析根據單因素實驗結果，選取脫脂

8、奶粉、麥芽糖和谷氨酸鈉為試驗因素，以植物乳桿菌為試驗菌種，利用Box Behnken 中心組合設計，設計 3 因素 3 水平的響應曲面試驗，以存活率作為考核指標，試驗因素與水平見表 2，結果見表 3。表 2 響應面試驗因素與水平水平實驗因素A 脫脂奶粉 B 麥芽糖 C 谷氨酸鈉 1 5% 6% 2%0 10% 9% 6%1 15% 12% 10%表 3 響應曲面實驗結果序號A 脫脂奶粉( w/v)B 麥芽糖( w/v)C 谷氨酸鈉( w/v)存活率實測值( %)存活率預測值( %)1 10 12 10 81. 2 81. 02 5 9 2 78. 3 80. 23 10 12 2 74. 5

9、73. 54 10 9 6 89. 8 90. 55 15 6 6 85. 6 86. 56 15 9 2 76. 7 77. 97 5 9 10 89. 3 88. 08 5 6 6 92. 1 92. 39 10 9 6 91. 2 90. 510 15 9 10 84. 7 82. 811 10 6 10 86. 4 87. 412 15 12 6 81. 2 83. 413 5 12 6 83. 5 82. 614 10 6 2 87. 0 84. 8對表 3 中數據進行回歸擬合分析，得出冷凍干燥存活率對脫脂奶粉、麥芽糖、谷氨酸鈉冷凍保護劑的二次多項回歸方程模型:Y = + 90. 5

10、 1. 88A 3. 84B + 3. 14C + 1. 05AB 0. 75AC + 1. 82BC 2. 46A2 2. 44B2 5. 79C2其中，Y 為響應值冷凍干燥菌種存活率，A、B、C分別為脫脂奶粉、麥芽糖、谷氨酸鈉單位體積溶質質量濃度。為了檢驗模型的有效性，對模型進行方差分析結果表明( 表 4) ，多元相關系數為 2= 0. 9344，對方程的系數顯著性進行檢驗，結果表明各因子系數均有意義; 表明冷凍干燥存活率的實測值與預測值之間具有較好的擬合度; Prob( p) F 值并且 0. 0001 模型顯著，可用來進行響應面分析。2 4四川理工學院學報( 自然科學版) 2013 年

11、 10 月表 4 響應面法對冷凍保護劑選擇的 ANOVA 分析結果因素 平方和 自由度 均方和 F 值 P 值 顯著性模型 491. 40 9 20. 16 26. 33 0. 0001 A 98. 13 1 98. 13 11. 43 0. 0103 *B 137. 81 1 137. 81 22. 56 0. 0041 C 118. 75 1 118. 75 18. 41 0. 0052 AB 41. 07 1 41. 07 4. 43 0. 1031AC 22. 25 1 22. 25 3. 22 0. 1536BC 63. 32 1 63. 32 9. 10 0. 0480 *A255

12、. 40 1 55. 40 17. 06 0. 0253 *B256. 01 1 56. 01 16. 00 0. 0285 *C2127. 18 1 127. 18 44. 89 0. 0001 殘差 25. 39 4 6. 35失擬 24. 41 3 8. 14 5. 30純誤差 0. 98 1 0. 98總和 386. 79 13圖 1、圖 2、圖 3 是由多元回歸方程式所作的響應曲面三維圖和等高線圖。可以對任何兩個因素的交互作用進行分析和評價，以確定最佳因素水平范圍。圖 1 脫脂奶粉和麥芽糖對冷凍干燥存活率交互影響利用 Expert Design 7. 0 軟件以存活率最大值為目標優化

13、出方案，得出唯一最優方案為: 脫脂奶粉 7. 06%，麥芽糖 6. 46%，谷氨酸鈉 6. 70% 為組合保護劑使用時，能使植物乳桿菌冷凍干燥存活率達到 92. 95%。圖 2 脫脂奶粉和谷氨酸鈉對冷凍干燥存活率交互影響的等高線圖和三維曲面圖圖 3 麥芽糖和谷氨酸鈉對冷凍干燥存活率交互影響的等高線圖和三維曲面圖第 26 卷第 5 期 王世寬等: 響應面法優化植物乳桿菌和凝結芽孢桿菌凍干保護劑的研究252. 3 凝結芽孢桿菌冷凍干燥實驗對植物乳桿菌優化的最優復合保護劑組合，脫脂奶粉 7. 06%，麥芽糖 6. 46%，谷氨酸鈉 6. 70%，應用于凝結芽孢桿菌冷凍干燥，進行存活率的檢測，得出凝結

14、芽孢桿菌冷凍干燥存活率為 94. 1%，可見優化得出的保護劑組合配方對凝結芽孢桿菌的冷凍干燥也具有較好的保護效果。3 結束語通過響應面分析方法，利用 Expert Design 7. 0 軟件以存活率最大值為目標，確定對植物乳桿菌和凝結芽孢桿菌具有最佳凍干保護作用的配方為脫脂奶粉 7. 06%，麥芽糖 6. 46%，谷氨酸鈉 6. 70%，使物乳桿菌冷凍干燥存活率達到 92. 95%，凝結芽孢桿菌的冷凍干燥存活率達到 94. 1%。此項研究為植物乳桿菌和凝結芽孢桿菌的復合發酵劑菌粉的實際生產提供了理論參考。參 考 文 獻:1 陳 功，余文華，張其圣，等 泡菜直投式菌劑制備及應用研究J 四川食品

15、與發酵，2008(4) :19-232 umian N，Tsvetkov T D，Angelov M Investigation of lac-tobacilli strains during lyophilizationJ Cryobiology，1993( 30) : 536-5403 李寶坤，田豐偉，劉小鳴，等 冷凍干燥對乳酸菌代謝活力的影響J食品工業，2011(9) :203-2054 袁亞宏，岳田利，高振鵬，等 凍干高活力乳酸菌粉保護劑的研究J 西北農林科技大學學報，2003( 31) : 82-845 潘 明，謝仁有，洪玉程 響應面法優化甘薯葉 SOD 的提取工藝J四川理工學院學報

16、: 自然科學版，2012，25(2) :5-76 張澤生，王婧宜，王 馨，等 保加利亞乳桿菌冷凍干燥保護劑的篩選J食品工業，2011(6) :48-507 熊 濤，黃錦卿，宋蘇華，等 植物乳桿菌真空冷凍干燥保護劑配方優化J 南昌大學學報: 理科版，2010( 6) :561-565Optimization of Cryoprotectants for Bacillus Coagulans and Lactobacillus Plantarum byesponse Surface MethodsWANG Shi-kuan，HONG Yu-cheng，YUAN Xian-ling( School

17、of Biotechnology Engineering，Sichuan University of Science Engineering，Zigong 643000，China)Abstract: The formula of the freeze-dried protectants for Bacillus coagulans and Lactobacillus plantarum is optimizedand selected by the method that combines single factor experiment and response surface exper

18、iment design The single factorexperiment shows that the skim milk，maltose and sodium glutamate have outstanding protective effect，which contribute toimprove the cell's endurance capacity in freeze-dried environment By response surface analysis，the quadratic model for thethree significant factors is established with cell survival rate as the target response The optima formula is: the skim milk7. 06% ，maltose 6. 46% an