1、第十一章第十一章 蛋白質的生物合成蛋白質的生物合成 蛋白質的生物合成在細胞代謝蛋白質的生物合成在細胞代謝中占有非常重要的位置。以大腸肝中占有非常重要的位置。以大腸肝菌為例，蛋白質占細胞干重菌為例，蛋白質占細胞干重50%左左右右,每個細胞約有每個細胞約有3000種不同的蛋白種不同的蛋白質分子，每種蛋白質又有無數分子質分子，每種蛋白質又有無數分子,而大腸肝菌的分裂周期不過而大腸肝菌的分裂周期不過20分鐘分鐘,可見蛋白質合成速度之快。可見蛋白質合成速度之快。 按中心法那么按中心法那么,DNA儲存遺傳信息傳送給儲存遺傳信息傳送給mRNA,mRNA是蛋白質合成的模板是蛋白質合成的模板,但是但是mRNA蛋

2、白質之間遺傳信息的傳送并不像轉錄蛋白質之間遺傳信息的傳送并不像轉錄那樣簡單那樣簡單,從從mRNA上所攜帶的遺傳信息上所攜帶的遺傳信息,到多肽到多肽鏈上所帶的遺傳信息的傳送鏈上所帶的遺傳信息的傳送,好似從一種言語翻譯好似從一種言語翻譯成另一種言語的情形成另一種言語的情形,所以人們稱以所以人們稱以mRNA為模板為模板的蛋白質合成過程為翻譯或轉譯。的蛋白質合成過程為翻譯或轉譯。nProtein synthesis or translation is the most complex of all biosynthetic mechanisms;n60 to 90 macromolecules for

3、 making up the protein-synthesizing machine ribosomes;nOver 20 enzymes for activating the amino acids;nOver 10 auxiliary proteins for the initiation, elongation and termination of the polypeptide chains;nAccount for up to 90% of the chemical energy used by a cell for all biosynthetic reactions; nThe

4、 molecules used for translation account for more than 35% of the cells dry weight; nProteins are synthesized with extremely high efficiency: a complete polypeptide chain of 100 residues is synthesized in about 5 seconds in an E.coli cells at 37oC.第一節(jié):蛋白質合成體系的組分n翻譯的過程非常復雜翻譯的過程非常復雜,幾乎涉幾乎涉及到細胞內一切種類的及到細

5、胞內一切種類的RNA和幾十種蛋白質因子和幾十種蛋白質因子 。 有機界擁有有機界擁有1010-1011種不同的種不同的蛋白質蛋白質,構成數目這么寵大的不同的構成數目這么寵大的不同的多肽的單位卻只需多肽的單位卻只需20種種AA, AA在多在多肽中不同的陳列次序是蛋白質多樣肽中不同的陳列次序是蛋白質多樣性的根底，目前曾經清楚，多肽上性的根底，目前曾經清楚，多肽上AA的陳列次序最終是由的陳列次序最終是由DNA上核上核苷酸的陳列次序決議的，直接是由苷酸的陳列次序決議的，直接是由mRNA決議的。決議的。一、一、mRNAmRNA的發(fā)現的發(fā)現遺傳密碼遺傳密碼 不論是不論是DNA或或mRNA,根本上根本上都是由

6、都是由4種核苷酸構成。這種核苷酸構成。這4種核種核苷酸如何編制成遺傳密碼苷酸如何編制成遺傳密碼,又怎樣又怎樣被翻譯成被翻譯成20種種AA組成的多肽組成的多肽,這這就是蛋白質生物合成中的遺傳密就是蛋白質生物合成中的遺傳密碼的翻譯問題。決議碼的翻譯問題。決議Pr中中AA序列序列的核苷酸序列稱遺傳密碼。的核苷酸序列稱遺傳密碼。Amino acids in a polypeptide chain are coded by groups of three nucleotides in a mRNAEach mRNA molecule would have threepotential reading f

7、rames (for three differentpolypeptides) .Genetic studies indicated that substitution of one nucleotide usually affects only one singleamino acid: genetic codes are nonoverlapping.Genetic studies showed that genetic codons are successive triplets of nucleotidesAltered amino acid sequencesWhich condon

8、 which AA ?兩個關鍵的技術：兩個關鍵的技術：1.蛋白質體外合成系統(tǒng)；蛋白質體外合成系統(tǒng)；2.核酸人工合成技術。核酸人工合成技術。nWhen poly(G) was added, no polypeptides were detected.Polyribonucleotides of defined repeating sequences of two to four bases helped to end the decoding workCopolymer of repeating dinucleotides alwayslead to synthesis of polypepti

9、des of repeatingdipeptides:ABABABABABABAB- aa1-aa2-aa1-aa2- Copolymer of repeating trinucleotides will lead to the synthesis of three homopolypeptides:構成多少怎樣的肽鏈？構成多少怎樣的肽鏈？ABCDABCDABCDABCDABCDABCDABCDABCD-ABCDABCDABCDABCDABCDABCDABCDABCD-ABCDABCDABCDABCDABCDABCDABCDABCD-ABCDABCDABCDABCDABCDABCDABCDAB

10、CD-ABCDABCDABCDABCDABCDABCDABCDABCD-Copolymer of repeating tetranucleotides will leadto the synthesis of a single type of polypeptide with repeatingtetrapeptides.Many trinucleotides promote the binding of specific aminoacyl-tRNA to ribosomesThe filter-binding assayfor detecting the bindingof a trinu

11、cleotide to a specific aminoacyl-tRNAmolecule: about 50 codons were assigned bythis method.All 64 triplet codes were deciphered by 1966n61 of the codons code for the 20 amino acids and three (UAA, UAG, UGA) for chain termination, called termination codons, stop codons, or nonsense codons);nAUG is a

12、dual codon coding for initiation and Met;Established thechemicalstructure oftRNAEstablished the in vitro system for revealing the genetic codesDevised methodsto synthesizewell definednucleic acids1.遺傳密碼的通用性遺傳密碼的通用性 原核生物與真核生物都運用同原核生物與真核生物都運用同樣的密碼子編碼氨基酸。到目前樣的密碼子編碼氨基酸。到目前為止，只發(fā)現個別的例外，線粒為止，只發(fā)現個別的例外，線粒體中的

13、遺傳密碼有個別的變化。體中的遺傳密碼有個別的變化。P:344.遺傳密碼遺傳密碼線粒體遺傳密碼的差別線粒體遺傳密碼的差別二、遺傳密碼的根本特點二、遺傳密碼的根本特點:2.密碼的簡并性密碼的簡并性: 一個一個AA可以被可以被1個以上的個以上的密碼子編碼的性質。密碼子編碼的性質。e.g. Glu CAA CAG ASP GAU GAC 編碼同一種編碼同一種AA的密碼子的密碼子稱為同義密碼子。稱為同義密碼子。 18 of the amino acids are coded by more than one codon: the genetic codes are degenerate。3.變偶性：一種

14、變偶性：一種tRNA可以識別可以識別一種以上的同一氨基酸的密碼子。一種以上的同一氨基酸的密碼子。 tRNA的反密碼子中的反密碼子中5含有含有I、I對對mRNA密碼子的密碼子的3堿基要求不嚴堿基要求不嚴厲。厲。 I 能與能與U、C、A構成氫鍵配構成氫鍵配對，對，e.g. tRNAArg 5ICG3反密碼子反密碼子 3 G C I G C I G C I密碼子密碼子 5 C G A C G U C G C 均為均為Arg4.延續(xù)性：密碼子是無標點符號延續(xù)性：密碼子是無標點符號的，密碼是不重疊的，即相鄰的的，密碼是不重疊的，即相鄰的密碼子互不重疊。密碼子之間沒密碼子互不重疊。密碼子之間沒有任何信號加

15、以隔開，假設在中有任何信號加以隔開，假設在中間插入一個堿基，就會呵斥這一間插入一個堿基，就會呵斥這一位點以后的讀碼發(fā)生錯誤，這叫位點以后的讀碼發(fā)生錯誤，這叫移碼。移碼。AUGGCGCGUUUUAGUUGA5.方向性：密碼子的閱讀方向是方向性：密碼子的閱讀方向是5 3，不，不能反過來。能反過來。6.特殊密碼子特殊密碼子 64個個code中，有中，有61個編碼個編碼AA 3個終止密碼子：個終止密碼子：UAG、UAA、UGA 起始密碼子：起始密碼子：AUG 獨一密碼子：獨一密碼子：AUGMet)、UGG(Trp) 二、二、tRNAAll tRNAs have common structural fe

16、atures:cloverleaf in secondary, “L in 3-D structures.Codon-anticodonpairing(1)被氨酰被氨酰-tRNA合成酶識別，合成酶識別，運輸氨基酸；運輸氨基酸； (2)反密碼子反密碼子,識別識別mRNA鏈上的鏈上的密碼子；密碼子；(3)銜接多肽鏈與核糖體。銜接多肽鏈與核糖體。tRNA功能功能Role of 3types ofRNA intranslation經過一系列調查，經過一系列調查，Crick得出結論得出結論: 大多數密碼子的第三個堿基大多數密碼子的第三個堿基與它的反密碼子相對應的堿基與它的反密碼子相對應的堿基之間配對是比

17、較疏松的，這些之間配對是比較疏松的，這些密碼子的第三個堿基具有擺動密碼子的第三個堿基具有擺動性，稱為擺動假說，也叫變偶性，稱為擺動假說，也叫變偶假說。假說。 密碼子由前兩個堿基構成密碼子由前兩個堿基構成Wastson-Crick配對，決議專注性。配對，決議專注性。 反密子的第一個堿基決議反密子的第一個堿基決議tRNA識別密碼的數目。識別密碼的數目。C A 識別一種識別一種 G U 識別二種識別二種 I 識別三種識別三種 翻譯翻譯20種種AA的的61個密碼子最少個密碼子最少需求需求32種種tRNA。三、核糖體三、核糖體Ribosomes are ribonucleoprotein particl

18、es for synthesizing proteins. 核糖體含有：核糖體含有：mRNA結合部位結合部位tRNA結合部位結合部位 1.氨酰基氨酰基:A位位 氨酰氨酰-tRNA結合結合部位；部位； 2.肽基部位肽基部位:P位位 正在延伸的多正在延伸的多肽基肽基 A位、位、P位有一小部分在位有一小部分在30S亞基內亞基內,大部分在大部分在50S亞基內。亞基內。 3.出口位：出口位：E位。位。催化肽鍵構成的部位催化肽鍵構成的部位四、輔助因子四、輔助因子起始起始 IF1 IF2 e1F2 參與起始參與起始 IF3 e1F3、e1F4c CBPI 與與5-帽子結合帽子結合, e1F4A、B、F 參與

19、尋覓第一個參與尋覓第一個AUG e1F5 協(xié)助協(xié)助e1F2、e1F3、e1F4c的的釋放釋放 e1F6 協(xié)助協(xié)助60S亞基從無活性的核亞基從無活性的核糖體上解離糖體上解離 2. 延伸因子延伸因子:EF-TU： eEF1a 協(xié)助氨酰協(xié)助氨酰-tRNA進進入核糖體入核糖體EF- TS eEF1Y： 協(xié)助協(xié)助EF-Tu、eEF1a周轉移位因子周轉移位因子3. 終止因子終止因子 RE1UAA、UAG RE2UAA、UGA， eRF 釋放完好釋放完好的肽鏈。的肽鏈。第二節(jié)第二節(jié) AA的活化的活化n真核生物中起始是真核生物中起始是Metn原核生物中起始是原核生物中起始是fMetnAA之間直接構成肽鍵，這在

20、熱力學之間直接構成肽鍵，這在熱力學上是不允許的，這一能障是經過活上是不允許的，這一能障是經過活化化AA的羧基，構成活化中間體的羧基，構成活化中間體-氨氨酰酰tRNA加以抑制。在蛋白質合成中，加以抑制。在蛋白質合成中，必需經過活化才干構成肽鍵。必需經過活化才干構成肽鍵。一、一、AA的活化的活化 AAtRNAATP氨酰氨酰tRNA合合成酶，成酶， Mg2+氨酰氨酰-tRNA+AMP+PPi有三個意義有三個意義:1.AA必需由必需由tRNA攜帶進入核攜帶進入核糖體，由糖體，由tRNA識別密碼子。識別密碼子。2.氨酰鍵儲存了能量，具有氨酰鍵儲存了能量，具有相當高的轉移勢能，用于相當高的轉移勢能，用于以

21、后肽鍵的構成，不需求以后肽鍵的構成，不需求另外的能量。另外的能量。aminoacylThe amino acids arelinked either to the 2- or 3-OH group of the terminal adenosineof tRNAs.Aminoacyl-tRNA synthetase3.氨酰氨酰tRNA合成酶合成酶是蛋白質合成的準確是蛋白質合成的準確性的重要控制環(huán)節(jié)。性的重要控制環(huán)節(jié)。 tRNAGlnGln-tRNA synthetaseAmino acidarmAnticodonarmATPTOXIC PLANTSCommon Name: Alfalfa or

22、 LucerneScientific Name: Medicago sativa Most affected: cattle, chickens, humans, sheep Part: The entire plant 刀豆氨酸刀豆氨酸有毒有毒AA，通常，通常0.25%的含的含量就足以使昆蟲致死。量就足以使昆蟲致死。According to an updated checklist for Belize, D. megacarpa is the correct synonym for D. relexa var. grandiflora. The attractive seeds of th

23、is pantropic species wash ashore on tropical beaches throughout the world. Dioclea megacarpa刀豆氨酸含量刀豆氨酸含量達達8，劇毒，劇毒無比！無比！Caryedes brasiliensis whose larvae infest and feed on Dioclea violacea seeds containing up to 13% canavanine 南美洲的花生豆南美洲的花生豆象象Caryedes brasiliensis 其精氨酰其精氨酰-tRNA合成酶能區(qū)分精氨酸和刀豆氨酸。合成酶能區(qū)分

24、精氨酸和刀豆氨酸。只需一個AUG，有兩種tRNA。tRNAfMet 識別起始密碼子fMet-tRNAffMet N-甲酰甲硫氨酰-tRNAffMettRNAmMet 識別內部AUG密碼子，用于內部合成，Met-tRNAmMet 。二、起始氨酰二、起始氨酰-tRNA的構成的構成:甲酰甲硫氨酸的構造甲酰甲硫氨酸的構造分兩步構成分兩步構成:(1)Met + tRNAfMet + ATP Met tRNAfMet + AMP + PPi(2)轉甲酰酶以四氫葉酸為甲酰基供轉甲酰酶以四氫葉酸為甲酰基供體構成體構成fMet-tRNAfMet 這兩者都帶有一樣的反這兩者都帶有一樣的反密碼子密碼子3UAC5，兩

25、者均能，兩者均能被同一種甲硫被同一種甲硫aa-tRNA合成合成酶所作用，那么，是如何識酶所作用，那么，是如何識別起始和內部的別起始和內部的AUG？A purine-rich Shine-Dalgarno sequence and a AUGcodon marks the start site of polypeptide synthesis on bacterial mRNA molecules. Translation start codonRBS第三節(jié)第三節(jié) 多肽鏈的合成多肽鏈的合成分為三個階段分為三個階段:肽鏈合成的起始肽鏈合成的起始肽鏈的延伸肽鏈的延伸肽鏈合成的終止和釋放肽鏈合成的終止

26、和釋放一、肽鏈合成的起始一、肽鏈合成的起始30S-mRNA復合物的構成：復合物的構成： 完好的核糖體不能直接與完好的核糖體不能直接與mRNA結結合起始多肽的合成，合起始多肽的合成，IF3參與、參與、IF1協(xié)助。協(xié)助。(1)必需先解離成必需先解離成30S、50S兩個亞基兩個亞基;(2)IF3與與30S亞基首先結合使亞基首先結合使30S與與50S不不再結合再結合; (3)30S結合到結合到mRNA上上,使使AUG正確定位正確定位于于P位內位內,構成構成30S- mRNA復合物復合物, mRNA的的SD序列與序列與16S rRNA 3互補。互補。30S預起始復合物的構成：預起始復合物的構成：fMet

27、-tRNAfMet與與GTP+IF2結合到結合到30S-mRNA的復合物上，構成預起的復合物上，構成預起始復合物。始復合物。fMet-tRNAfMet坐落在坐落在P位，起始位，起始tRNA的反密碼子與的反密碼子與mRNA的的AUG配對。配對。70S起始復合物的構成起始復合物的構成 50S結合到結合到30S預起始物上，結合預起始物上，結合在在IF2上的上的GTP被水解成被水解成GDP和和Pi并并被釋放。被釋放。IF3、IF2也分開核糖體，結也分開核糖體，結果便構成了一個包含有果便構成了一個包含有mRNA和起始和起始fMet-tRNAfMet在內的有功能的在內的有功能的70S核糖體，稱為核糖體，稱

28、為70S起始復合物。起始復合物。由于由于GTP的水解使結合在一同的兩個的水解使結合在一同的兩個亞基構成有活性的亞基構成有活性的70S核糖體，核糖體，P位占位占滿，滿，A位空著。位空著。Shine-Dalgarnosequence二、肽鏈的延伸二、肽鏈的延伸 參與的組分參與的組分:(1)有功能有功能70S核糖體核糖體; (2)氨酰氨酰-tRNA; (3)延伸因子延伸因子EF-Tu, EF-Ts、EF-G; (4)GTP。肽鏈的延肽鏈的延伸是以循伸是以循環(huán)的方式環(huán)的方式將將AA加到加到正在合成正在合成的肽鏈羧的肽鏈羧基端，合基端，合成方向是成方向是NC。每一循環(huán)分為四步每一循環(huán)分為四步: 進位、轉

29、肽、移位、零進位、轉肽、移位、零落落1.進位：新的第進位：新的第2個氨酰個氨酰-tRNA進入核糖進入核糖體體A位位 (1) EF-Tu、GTP與氨酰與氨酰tRNA結合構成三元結合構成三元復合物：氨酰復合物：氨酰-tRNA.EF-Tu.GTP, 然后進入然后進入A位。位。 氨酰氨酰-tRNA的反密碼子與的反密碼子與mRNA上處于上處于A位的密碼子配對位的密碼子配對,GTP水解成水解成GDP和和Pi。同時。同時EF-Tu.GDP釋放出來。釋放出來。(2)EF-Tu.GDP復合物再生時復合物再生時,EF-Ts將將GDP置換下來，生成置換下來，生成EF-Tu.Ts，GTP又又將將EF-Ts置換下來生成

30、置換下來生成EF-Tu.GTP參與參與下一個氨酰下一個氨酰-tRNA結合進入結合進入A位。位。 EF-Tu.GDP + EF-Ts EF-Tu.EF-Ts + GDP EF-Tu.EF-Ts + GTP EF-Tu.GTP + EF-Ts 耗費耗費1個個GTP(3) fMet-tRNAfMet不能與不能與EF-Tu.GTP結合，所以結合，所以fMet不會摻與到肽鏈的合成不會摻與到肽鏈的合成中。中。 2.轉肽：肽鍵的構成轉肽：肽鍵的構成 氨酰氨酰-tRNA進入核糖體進入核糖體A位以后，位以后，P位與位與A位占滿，位占滿，P位上的位上的fMet-tRNAfMet在肽基轉移酶的作用下轉移到在肽基轉移

31、酶的作用下轉移到A位中位中AA的氨基上，從而構成肽鍵。的氨基上，從而構成肽鍵。 結果結果A位上構成一個二肽基位上構成一個二肽基-tRNA，P位是空載的位是空載的tRNAfMet。 原先以為肽基轉移酶是原先以為肽基轉移酶是50S中的一種中的一種Pr，1992年，發(fā)現是年，發(fā)現是23S rRNA，它具，它具有核酶的作用。有核酶的作用。3.移位移位:肽鍵構成以后肽鍵構成以后:(1)EF-G、GTP與核糖體結合推進核糖體與核糖體結合推進核糖體沿沿mRNA 53方向挪動一個密碼子的間方向挪動一個密碼子的間隔隔; (2)由于核糖體的移位，二肽基由于核糖體的移位，二肽基tRNA從從A位移至位移至P位，仍與位

32、，仍與mRNA結合結合;(3)而原來在而原來在P位中的位中的tRNAfMet便分開便分開P位位零落下來，這時零落下來，這時mRNA上的下一個密碼上的下一個密碼子恰益處于核糖體的子恰益處于核糖體的A位，供下一個氨酰位，供下一個氨酰-tRNA的進位。的進位。 移位需求移位需求EF-G(也稱移位也稱移位酶酶)以及以及GTP參與，參與，EF-G、GTP與核糖體結合，便推進與核糖體結合，便推進核糖體移位，然后核糖體移位，然后GTP水解水解為為GDP和和Pi釋放下來，釋放下來，EF-G也解離下來，至止，一輪肽也解離下來，至止，一輪肽鏈的延伸循環(huán)便完成。鏈的延伸循環(huán)便完成。又耗費一個又耗費一個GTP三、肽鏈

33、合成的終止及釋放三、肽鏈合成的終止及釋放 當核糖體沿當核糖體沿mRNA挪動至終止挪動至終止密碼子密碼子(UAA、UAG、UGA)位于位于A位時肽鏈的延伸便停頓。位時肽鏈的延伸便停頓。終止因子終止因子: RF1, 識別識別UAA、UAG RF2, 識別識別UAA、UGA RF3能夠是與能夠是與GTP結合結合并水解并水解GTP，促進多肽鏈釋放。，促進多肽鏈釋放。分三個階段分三個階段:1.釋放因子進入釋放因子進入A位位 RF1 or RF2進入進入A位與終止密碼子結合。位與終止密碼子結合。2.多肽鏈的釋放多肽鏈的釋放 RF1 or RF2誘導肽基轉移酶行使水解作用誘導肽基轉移酶行使水解作用,將將位于

34、位于P位位tRNA上的肽基轉移到水分子上上的肽基轉移到水分子上,多肽鏈多肽鏈分開核糖體分開核糖體,釋放因子與空載的釋放因子與空載的tRNA也分開。也分開。3.70S核糖體解離核糖體解離 在在IF3存在下，解離成存在下，解離成50S和和30S，以便投入，以便投入另一條多肽鏈的合成。另一條多肽鏈的合成。Releasing factors recognize the stop codons and promotethe termination of the polypeptide synthesis: releasing the peptide chain, the tRNA and the two

35、 ribosomal units. Exitsite假設要合成一個由假設要合成一個由n個個AA組成的組成的多肽，需求耗費多少多肽，需求耗費多少ATP分子？分子？合成肽鏈的能量耗費：合成肽鏈的能量耗費：多肽合成所需的能量：多肽合成所需的能量： 氨基酸活化氨基酸活化 2 ATP ATPAMP 起始起始 1 GTP 延伸延伸 2 GTP進位進位1、移、移位位1 終止終止 1 GTPn個個AA的多肽：的多肽：2N+2N-1+2 = 4NA single mRNA is usually translated by multipleribosomes (polysomes)simultaneously.F

36、ormation of circular eukaryotic mRNA by protein-protein interactions of eIF4E and eIF4G (binding to the m7G cap), poly(A)-binding protein I (PABI) Force-fieldelectron micrographModel of protein synthesis on circular polysomes and recycling of ribosomal subunits.真核生物多肽鏈的合成真核生物多肽鏈的合成:一、真核生物多肽鏈合成起始的根本過程一、真核生物多肽鏈合成起始的根本過程1.Met-tRNAMet 、GTP.eIF2, 再與再與40S、eIF3、eIF4c構成三元復合物、構成三元復合物、43S核糖體復合物。核糖體復合物。2.帽子結合帽子結合Pr與與