1、冬蟲夏草子座發(fā)育前后轉(zhuǎn)錄冬蟲夏草子座發(fā)育前后轉(zhuǎn)錄組基因文庫的構(gòu)建以及表達(dá)組基因文庫的構(gòu)建以及表達(dá)差異的研究差異的研究專業(yè)：微生物學(xué)專業(yè)：微生物學(xué)導(dǎo)師：謝放導(dǎo)師：謝放 副教授副教授姓名：常黎明姓名：常黎明1、轉(zhuǎn)錄組的特點及意義、轉(zhuǎn)錄組的特點及意義What？ Why？ How？轉(zhuǎn)錄組是指在某一生理條件下某物種產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄組是指在某一生理條件下某物種產(chǎn)生的所有轉(zhuǎn)錄本的集合。所有轉(zhuǎn)錄本的集合。廣義的轉(zhuǎn)錄組主要包括信使廣義的轉(zhuǎn)錄組主要包括信使 RNA（mRNA）、）、非編碼非編碼 RNA、轉(zhuǎn)運、轉(zhuǎn)運 RNA（t RNA）及核糖體）及核糖體 RNA（r RNA）。）。狹義的轉(zhuǎn)錄組主要指信使狹義的轉(zhuǎn)錄組主要指

2、信使 RNA（mRNA）。）。與基因組是的靜態(tài)不同，轉(zhuǎn)錄組可以隨物種自與基因組是的靜態(tài)不同，轉(zhuǎn)錄組可以隨物種自身發(fā)育或外部環(huán)境條件的變化而有所轉(zhuǎn)變，同身發(fā)育或外部環(huán)境條件的變化而有所轉(zhuǎn)變，同一物種在不同發(fā)育階段或不同環(huán)境中其基因表一物種在不同發(fā)育階段或不同環(huán)境中其基因表達(dá)情況存在很大差異，具有很強的時間和空間達(dá)情況存在很大差異，具有很強的時間和空間特性。轉(zhuǎn)錄水平的變化是生物基因組與外部物特性。轉(zhuǎn)錄水平的變化是生物基因組與外部物理特征的動態(tài)聯(lián)系，可反映生物個體在某一發(fā)理特征的動態(tài)聯(lián)系，可反映生物個體在某一發(fā)育或生理階段所有基因的表達(dá)水平。育或生理階段所有基因的表達(dá)水平。因此，掌握了特定生物轉(zhuǎn)錄水

3、平的變化，就可因此，掌握了特定生物轉(zhuǎn)錄水平的變化，就可以深入了解其生命活動特征和調(diào)控機制。以深入了解其生命活動特征和調(diào)控機制。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究內(nèi)容主要包括以轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究內(nèi)容主要包括以下幾個方面下幾個方面：新基因的預(yù)測新基因的預(yù)測基因結(jié)構(gòu)分析（基因結(jié)構(gòu)分析（SNP分析、轉(zhuǎn)錄組中存在的分析、轉(zhuǎn)錄組中存在的可變剪接分析、基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化等）可變剪接分析、基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化等）物種差異表達(dá)基因注釋和富集分析物種差異表達(dá)基因注釋和富集分析差異表達(dá)基因表達(dá)蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測差異表達(dá)基因表達(dá)蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測UTR（untranslated region）分析）分析2、研究背景、研究背景 冬蟲夏草是由冬蟲夏草菌侵染青藏高

4、原高山草甸土冬蟲夏草是由冬蟲夏草菌侵染青藏高原高山草甸土中的鱗翅目蝙蝠蛾（主要為鉤蝠蛾屬中的鱗翅目蝙蝠蛾（主要為鉤蝠蛾屬 Thitarodes Viette）幼蟲并在蟲體內(nèi)生長產(chǎn)生子座而形成的幼蟲尸體與真菌幼蟲并在蟲體內(nèi)生長產(chǎn)生子座而形成的幼蟲尸體與真菌的復(fù)合體。的復(fù)合體。 作為一種未能實現(xiàn)人工化栽培的名貴藥用真菌，冬作為一種未能實現(xiàn)人工化栽培的名貴藥用真菌，冬蟲夏草相關(guān)的研究都只是集中在菌種的分離鑒定、寄主蟲夏草相關(guān)的研究都只是集中在菌種的分離鑒定、寄主昆蟲種類的確定和人工繁殖昆蟲種類的確定和人工繁殖、菌株培養(yǎng)特性菌株培養(yǎng)特性、代謝產(chǎn)物代謝產(chǎn)物分離分析及活性成分藥理作用分離分析及活性成分藥理

5、作用、冬蟲夏草菌有性發(fā)育及冬蟲夏草菌有性發(fā)育及其相關(guān)基因的研究等方面其相關(guān)基因的研究等方面。特別對于冬蟲夏草菌有性發(fā)特別對于冬蟲夏草菌有性發(fā)育及其相關(guān)基因的研究一直是近年來國內(nèi)為研究的熱點育及其相關(guān)基因的研究一直是近年來國內(nèi)為研究的熱點。2、研究背景、研究背景 由于冬蟲夏草菌特殊的生境和本身的復(fù)雜性導(dǎo)由于冬蟲夏草菌特殊的生境和本身的復(fù)雜性導(dǎo)致對其系統(tǒng)全面的研究面臨困難，因而讓其在人工致對其系統(tǒng)全面的研究面臨困難，因而讓其在人工條件下長出子座遇到巨大的挑戰(zhàn)，況且到底哪種或條件下長出子座遇到巨大的挑戰(zhàn)，況且到底哪種或哪幾種菌哪幾種菌是是其正確的無性型學(xué)界眾說風(fēng)云。其正確的無性型學(xué)界眾說風(fēng)云。因此因

6、此對對于冬蟲夏草子座有性發(fā)育的研究一般都停留在天然于冬蟲夏草子座有性發(fā)育的研究一般都停留在天然冬蟲夏草的研究。冬蟲夏草的研究。冬蟲夏草菌能夠長出子座完成有冬蟲夏草菌能夠長出子座完成有性生殖過程說明它的基因組中的某些基因一定發(fā)生性生殖過程說明它的基因組中的某些基因一定發(fā)生著時空表達(dá)，到底是某些基因的表達(dá)量的變化引起著時空表達(dá)，到底是某些基因的表達(dá)量的變化引起了有性生殖還是冬蟲夏草菌生長到某一個階段后一了有性生殖還是冬蟲夏草菌生長到某一個階段后一些基因在時間或空間的誘導(dǎo)下突然表達(dá)亦或是二者些基因在時間或空間的誘導(dǎo)下突然表達(dá)亦或是二者共同作用共同作用；這一有性發(fā)育過程中受到哪些因素的影這一有性發(fā)育過

7、程中受到哪些因素的影響以及怎樣響以及怎樣的的影響影響到目前都沒有確定的答案。到目前都沒有確定的答案。3、目的和意義、目的和意義通過對冬蟲夏草子座發(fā)育前后轉(zhuǎn)錄組基因文庫的表達(dá)差異研究旨在：（1）構(gòu)建冬蟲夏草長出子座的實驗體系；（2）從分子層面揭示冬蟲夏草子座發(fā)育的原因；（3）用生物信息學(xué)的方式預(yù)測冬蟲夏草有性生殖的關(guān)鍵基因；（4）發(fā)掘冬蟲夏草有性發(fā)育過程中未注釋的基因區(qū)和新的轉(zhuǎn)錄本；（5）通過對子座發(fā)育前后差異表達(dá)基因以及轉(zhuǎn)錄本的功能注釋和功能富集分析，為后續(xù)的生物信息學(xué)研究提供分子水平的依據(jù)。4 4、實驗流程、實驗流程冬蟲夏草菌的活化 批量接種菌種營養(yǎng)生長培養(yǎng)處理組：低溫誘導(dǎo)使處理組：低溫誘導(dǎo)

8、使其進(jìn)入子實體發(fā)育階段其進(jìn)入子實體發(fā)育階段末端修復(fù)、末端修復(fù)、3 3端加端加PolyPoly（A A）連接接頭連接接頭取樣取樣樣品總樣品總RNARNA的提取及純度檢測的提取及純度檢測對照組：保持營養(yǎng)對照組：保持營養(yǎng)生長生長SMART cDNA Library Construction Kit試劑盒構(gòu)建cDNA文庫PCRPCR富集富集文庫質(zhì)控文庫質(zhì)控上機測序獲得原始測序數(shù)據(jù)上機測序獲得原始測序數(shù)據(jù)4.14.1、樣品培養(yǎng)和獲取、樣品培養(yǎng)和獲取將保藏的以前長出過子座的菌種經(jīng)活化后重新接種到錐形瓶在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)過2-3個月開始低溫誘導(dǎo)使其長出子座。在無菌環(huán)境中以子實體發(fā)育啟動前正常營養(yǎng)生長的菌落和

9、萌發(fā)一周左右的子實體原基作為對照組，用手術(shù)刀小心切取菌落。各3個生物學(xué)重復(fù)。4.2、提取總、提取總RNA用RNA提取試劑盒提取Total RNA，并進(jìn)行樣品的純度、濃度和完整性檢測，以保證使用合格的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。4 4、實驗流程、實驗流程4.3、 mRNA的富集以及的富集以及cDNA文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建 將上述檢測合格后的總RNA用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，接著以mRNA為模板用SMART cDNA Library Construction Kit試劑盒構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA文庫，并進(jìn)行末端修復(fù)、3端加Poly（A）和加上連接接頭，然后將cDNA文庫進(jìn)行PCR富集，最后通過

10、QIAquick PCR Purification Kit試劑盒純化純化PCR產(chǎn)物，取一部分保存到-80保藏。 文庫構(gòu)建完成后，分別使用Qubit 2.0和Agilent 2100對文庫的濃度和Insert Size進(jìn)行檢測，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫質(zhì)量。4 4、實驗流程、實驗流程4.4、上機測序上機測序庫檢合格后，用HiSeq2500進(jìn)行高通量測序，測序讀長為PE100。最后獲得轉(zhuǎn)錄組的原始數(shù)據(jù)（Raw Data），每個測序樣品的Raw Data包括兩個FASTQ文件，分別包含所有cDNA片段兩端測定的Reads 。4 4、實驗流程、實驗流程 對Raw Da

11、ta進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，去除其中的接頭序列及低質(zhì)量reads獲得高質(zhì)量的Clean Data。 將Clean Data與指定的參考基因組進(jìn)行序列比對，獲得Mapped Data。基于Mapped Data，進(jìn)行插入片段長度檢驗、隨機性檢驗等測序文庫質(zhì)量評估；進(jìn)行表達(dá)量分析、可變剪接分析、新基因發(fā)掘和基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化等基礎(chǔ)分析。根據(jù)基因在不同樣品或不同樣品組中的表達(dá)量進(jìn)行差異表達(dá)分析、差異表達(dá)基因功能注釋和功能富集等高級分析。5 5、生物信息學(xué)分析、生物信息學(xué)分析測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制與玉米赤霉基因組比對與玉米赤霉基因組比對轉(zhuǎn)錄組文庫質(zhì)量評估轉(zhuǎn)錄組文庫質(zhì)量評估差異表達(dá)基因富集分析差異表達(dá)基因富集

12、分析（GOGO、KEEGKEEG富集分析）富集分析）基因表達(dá)量分析基因表達(dá)量分析表達(dá)大差異分析表達(dá)大差異分析基因結(jié)構(gòu)分析基因結(jié)構(gòu)分析差異表達(dá)基因注釋差異表達(dá)基因注釋生物信息學(xué)生物信息學(xué)分析流程圖分析流程圖新基因分析新基因分析差異表達(dá)基因蛋白互作差異表達(dá)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析網(wǎng)絡(luò)分析差異表達(dá)基因功能注釋差異表達(dá)基因功能注釋（GOGO、COGCOG、KEEGKEEG）重復(fù)相關(guān)性分析差異表達(dá)基因聚類分析差異表達(dá)基因篩選可變剪接預(yù)測基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化SNP分析6 6、預(yù)期成果、預(yù)期成果建立在人工培養(yǎng)基上長出冬蟲夏草子座的實驗體系；建立在人工培養(yǎng)基上長出冬蟲夏草子座的實驗體系；對冬蟲夏草子座發(fā)育前后的轉(zhuǎn)錄組基因

13、文庫分別進(jìn)對冬蟲夏草子座發(fā)育前后的轉(zhuǎn)錄組基因文庫分別進(jìn)行測序；行測序；運用生物信息學(xué)對上述所得數(shù)據(jù)進(jìn)行深度分析；運用生物信息學(xué)對上述所得數(shù)據(jù)進(jìn)行深度分析；找到冬蟲夏草子座發(fā)育前后轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)差異以及找到冬蟲夏草子座發(fā)育前后轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)差異以及子座發(fā)育的啟動基因；子座發(fā)育的啟動基因；運用生物信息學(xué)對冬蟲夏草子座啟動基因表達(dá)的蛋運用生物信息學(xué)對冬蟲夏草子座啟動基因表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測；白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測；發(fā)表發(fā)表1-2篇篇學(xué)術(shù)學(xué)術(shù)論文；論文；完成完成學(xué)位學(xué)位論文。論文。7 7、進(jìn)度安排、進(jìn)度安排2015.08-2015.10 查閱文獻(xiàn)和書籍2015.10-2015.11 菌種活化

14、和培養(yǎng)撰寫開題報告2015.12-2016.01提取子實體發(fā)育啟動前正常營養(yǎng)生長菌落的mRNA并送 基因公司進(jìn)行高通量測序2016.02-2016. 04 提取子實體原基發(fā)育期的mRNA并送基因公司高通量測序2016.05 -2016.08 獲得兩次樣品的序列數(shù)據(jù)2016.9 -2016.12 對測序獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行深度的生物信息學(xué)挖掘2017.1-2017. 3 撰寫學(xué)位論文8 8、可行性分析、可行性分析 本實驗所用到的測序技術(shù)和生物信息學(xué)方法本實驗所用到的測序技術(shù)和生物信息學(xué)方法比較比較成成熟，前人已經(jīng)做過大量野生冬蟲夏草菌和其他物種的熟，前人已經(jīng)做過大量野生冬蟲夏草菌和其他物種的cDNA文庫的構(gòu)建和生物信息學(xué)分析；前人在其他真菌文庫的構(gòu)建和生物信息學(xué)分析；前人在其他真菌子實體發(fā)育機制的研究取得了一定進(jìn)展子實體發(fā)育機制的研究取得了一定進(jìn)展可作為借鑒；可作為借鑒；實實驗過程中出現(xiàn)的各種參數(shù)都有較為完備的論證和評價標(biāo)驗過程中出現(xiàn)的各種參數(shù)都有較為完備的論證和評價標(biāo)準(zhǔn)；本實驗室長期進(jìn)行冬蟲夏草的研究工作，在長出冬準(zhǔn)；本實驗室長期進(jìn)行冬蟲夏草的研究工作，在長出冬蟲夏草菌