1、隆線溞夏卵胚胎發(fā)育過程中形態(tài)及蛋白質(zhì),氨基酸組成和含量的變化摘要：本文系統(tǒng)地觀察了隆線溞夏卵的胚胎發(fā)育.根據(jù)胚胎外部形態(tài)學(xué)特征,將其胚胎發(fā)育分為卵期,長胚期,雙復(fù)眼期和單復(fù)眼期四個主要時期,并采用生物化學(xué)方法測定和分析了隆線溞夏卵胚胎發(fā)育過程中蛋白質(zhì)和氨基酸的組成.實驗得知，可溶性蛋白和氨基酸含量的變化趨勢與隆線溞夏卵胚胎發(fā)育的特征密切相關(guān)，卵期可溶性蛋白和氨基酸含量呈下降趨勢，而長胚期略有所上升，但從雙復(fù)眼期至胚胎準備孵化期間又持續(xù)下降。隨著隆線溞夏卵胚胎的發(fā)育，可溶性蛋白的組成由大分子量的蛋白向小分子量的蛋白轉(zhuǎn)化；在所有的氨基酸中谷氨酸的含量最高，必需氨基酸中亮氨酸的含量最高。結(jié)果表明，蛋

2、白質(zhì)和氨基酸是隆線溞胚胎發(fā)育過程中的主要營養(yǎng)物質(zhì)，不僅用于胚胎發(fā)育組織和器官的構(gòu)建，而且為胚胎發(fā)育提供能量。關(guān)鍵詞：隆線溞；胚胎發(fā)育；蛋白質(zhì)；氨基酸1引言枝角類（Cladocera）是一類優(yōu)質(zhì)天然餌料，研究枝角類的生長、發(fā)育和繁殖以進行規(guī)模化培養(yǎng)，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)意義重大。在枝角類種群、生長、繁殖、發(fā)育及環(huán)境評價等方面，已有不少報道。對枝角類胚胎發(fā)育的研究，目前國內(nèi)外學(xué)者多著眼于胚胎外部形態(tài)的發(fā)生，其發(fā)育過程中主要生化物質(zhì)的變化則未見有相關(guān)報道。本文在研究隆線溞夏卵胚胎外部形態(tài)發(fā)生的基礎(chǔ)上，對其不同發(fā)育時期蛋白質(zhì)及氨基酸的組成和含量進行了測定和分析，以期為深入研究枝角類胚胎發(fā)育的機理積累基礎(chǔ)資料，

3、也為生產(chǎn)上提高母溞的產(chǎn)卵量及幼溞的成活率提供理論依據(jù)。2材料和方法2.1 試驗材料培養(yǎng)隆線溞溞種于 2003 年 2 月購于上海市大渡河路花鳥市場。鑒定后室溫培養(yǎng)，飼以枝角類培養(yǎng)液（土壤 10.0g、兔子糞便 1.5g 和青菜2.0g 混合，加入 1L 水煮沸過濾）。根據(jù)水質(zhì)狀況定期更換培養(yǎng)液，使其大量繁殖。2.2 胚胎發(fā)育外部形態(tài)學(xué)觀察選取未懷卵的成熟孤雌溞進行培養(yǎng)，每隔半小時觀察其卵巢發(fā)育情況，待卵巢較為膨大時分離單獨培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察。母溞在蛻皮后即刻產(chǎn)卵，卵產(chǎn)入孵育囊后每隔一定時間拍照，測量胚胎的長度和寬度。卵排入孵育囊內(nèi) 3h 后，小心將胚胎從孵育囊內(nèi)取出，放在盛有蒸餾水的

4、小培養(yǎng)皿里，進行體外孵化、拍照和測量，直到幼溞從孵育囊內(nèi)孵出。根據(jù)胚胎發(fā)育的形態(tài)學(xué)特征變化，對胚胎發(fā)育進行分期。2.3 胚胎發(fā)育各時期蛋白質(zhì)的組成和含量測定取不同發(fā)育時期的胚胎，稱濕重后加入 10 倍體積預(yù)冷的 PBS 溶液，冰浴勻漿，冷凍離心(12000rmin-1)30min，取上清液，分裝保存。一部分用于胚胎可溶性蛋白含量的測定，另一部分用于胚胎可溶性蛋白組成和分子量的測定。胚胎可溶性蛋白含量的測定以牛血清白蛋白作標準，用考馬斯亮藍法測定，做 3 個平行組，取其平均值。胚胎可溶性蛋白組成和分子量的測定用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，方法如下：根據(jù)測得的胚胎各時期蛋白的濃度，用 PBS溶液

5、將各時期的蛋白溶液稀釋成相同的濃度，各取 30L 在沸水浴加熱 3min。電泳時用 15%的分離膠和 4%的濃縮膠，上樣量為 20L，在電泳槽中加 Tris-甘氨酸電泳緩沖液，60120V 電泳 2h，直到指示劑跑至膠板底部。用銀染法染色。選用低分子量標準蛋白質(zhì)，其組成為兔磷酸化酶 B(97400)、牛血清白蛋白(66200)、兔肌動蛋白(43000)、牛碳酸酐酶(31000)、胰蛋白酶抑制劑(20100)和雞蛋溶菌酶(14400)。以標準蛋白分離膠起點到蛋白帶中線距離作橫坐標，標準分子量換算對數(shù)值作縱坐標，畫標準曲線，然后根據(jù)待測蛋白遷移率計算蛋白分子量。2.4 胚胎發(fā)育各時期氨基酸組成和含

6、量的測定將各時期胚胎置于 70烘箱中烘干至恒重，精確稱重后放入玻璃水解管中，采用鹽酸消解法，在 H853-50型氨基酸自動分析儀上測定氨基酸的組成和含量。同時做 3 個平行組，取平均值。利用統(tǒng)計學(xué)方法計算氨基酸含量的平均值( X )、方差(S)和變異系數(shù)(CV)。3結(jié)果3.1 胚胎發(fā)育的外部形態(tài)學(xué)特征在水溫 26下，從夏卵排入孵育囊到胚胎孵化，隆線溞胚胎發(fā)育共經(jīng)歷約 31h。根據(jù)胚胎發(fā)育的主要形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，將隆線溞夏卵的胚胎發(fā)育分為四個時期，其間又根據(jù)每個時期的發(fā)育特點，將隆線溞胚胎發(fā)育分為八個時期（-期）。3.1.1 卵期自夏卵排入孵育囊到外層卵膜破裂為止，共經(jīng)歷約 11h，可分為三個時期。

7、期 產(chǎn)出期。夏卵從卵巢排入孵育囊內(nèi)，外包一層透明卵膜，長卵形，隨之變圓，直徑約 0.219mm。約半小時后，可見胚胎外圍一圈較透明，卵內(nèi)大部分區(qū)域較暗，不透明，中央有數(shù)個油滴狀物。該時期持續(xù)約 2h(圖版-1)。期 胚胎顯著增大為卵圓形，長約 0.290mm，寬約 0.250mm。胚胎外圍一圈更透亮，中央油滴狀物愈加明顯，數(shù)量增多。整個期持續(xù)約 3h(圖版-2)。期 胚胎長約 0.299mm，寬約 0.259mm。此時明顯可見內(nèi)外兩層卵膜，外圍亮帶逐漸消失，油滴狀物不明顯。約 2h 后，不透明的中央?yún)^(qū)域外周出現(xiàn)一圈球形的卵黃顆粒。持續(xù)約 45min 后，胚胎外圍出現(xiàn)第一個凹陷，隨后凹陷逐漸增多

8、，凹陷之間逐漸形成的許多突起，即為頭原基和附肢原基等。整個期持續(xù)約h(圖版-3)。3.1.2 長胚期胚胎從最外層卵膜破裂發(fā)育至出現(xiàn)兩個紅色眼點，共經(jīng)歷約8h，其間又可分為兩個時期。期 胚胎不斷長大，外層卵膜從一端開始快速破裂，瞬間將胚胎彈出，外層卵膜脫落。此時胚胎仍外包一層很薄的卵膜，即內(nèi)層卵膜。胚胎開始縱向伸長，長約0.342mm，寬約 0.241mm。胚胎內(nèi)卵黃顆粒量增多。中央的油滴開始消散。此時胚胎外圍的頭原基與附肢原基已清晰可辨，第二觸角原基明顯且分節(jié)。此后胚胎不斷縱向增長，卵黃顆粒不斷增多，并向頭原基移動，頭部增長明顯。期持續(xù)約h(圖版-4)。期 胚胎停止增長，隨后開始收縮，胚內(nèi)物質(zhì)

9、與內(nèi)層卵膜間間距增大，縱向收縮明顯。經(jīng)h 左右，胚胎與內(nèi)層卵膜間隙達到最大，整個胚胎長約 0.364mm，寬約 0.250mm。此時胚胎頭部已形成，五對胸肢原基和殼瓣原基已清晰可辨，第二觸角內(nèi)、外肢分開。隨后胚胎又開始增長，與卵膜間的距離減小。約h后，第二觸角變粗壯，卵黃顆粒向頭部推進，殼瓣原基越發(fā)顯著，將胸肢原基蓋住。整個期持續(xù)約h(圖版-5)。3.1.3 雙復(fù)眼期胚胎出現(xiàn)兩個紅色的眼點發(fā)育至兩個眼點愈合變黑，共經(jīng)歷h，其間可分為兩個時期。期 胚胎頭部出現(xiàn)一對紅色眼點，二者分開。胚胎開始略微地旋轉(zhuǎn)，30min 后，胚胎在縱向上已經(jīng)將卵膜頂滿，胚胎長約 0.386mm，寬約 0.259mm。此

10、時心臟在背部輕微博動，接著第二觸角開始抖動。整個期持續(xù)約h(圖版-6)。期 一側(cè)的第二觸角伸出卵膜，3min 后，另一側(cè)的第二觸角也伸出，此時第二觸角發(fā)育基本完全，內(nèi)、外肢均已分節(jié)，并有觸角剛毛。整個胚胎開始不斷運動。接著殼刺出現(xiàn)，兩個紅色眼點逐漸靠近，胚胎頭部開始變尖。數(shù)分鐘后，眼點更加靠攏，心臟博動加快，殼瓣基本發(fā)育完全，兩側(cè)伸長變?yōu)橄蚋姑婧媳В眢w成為側(cè)扁，此時胚胎長約 0.518mm，寬約 0.263mm。胚胎已經(jīng)十分活潑，且能夠快速游動。此期末，胚體中央卵黃顆粒逐漸變少；胚胎尾部向后突出；眼點逐漸愈合變黑。整個期持續(xù)約h(圖版-7)。3.1.4 單個復(fù)眼期期 即準備孵化期，胚胎長約

11、0.536mm，寬約0.307mm。眼點已完全愈合變黑成單個復(fù)眼。彎曲的殼刺彈出，內(nèi)膜脫落。身體中央的腸管已經(jīng)基本成型。第二觸角和胸肢已經(jīng)長成，殼瓣變硬，邊緣已出現(xiàn)小刺。胚胎發(fā)育成熟，即將從孵育囊內(nèi)孵出成為第一齡幼體。此期約經(jīng)歷3h(圖版-8)。3.2 胚胎發(fā)育各期可溶性蛋白質(zhì)含量和組成的變化 3.2.1 可溶性蛋白含量的變化隆線溞夏卵整個胚胎發(fā)育過程中，可溶性蛋白含量總體呈下降的趨勢（圖 1）。在產(chǎn)出期，胚胎的蛋白含量最高，占樣品濕重的 19.68。從產(chǎn)出期到第期蛋白含量迅速降低了 4.05%，到第期下降至 13.04%。但至長胚期（第、期），蛋白含量逐漸上升，分別升至 15.11%、17.

12、38%。隨后的胚胎發(fā)育期，蛋白含量又逐漸下降，至準備孵化期下降到最低點，僅占胚胎濕重的8.80%，比產(chǎn)出期下降了 10.88%3.2.2 可溶性蛋白組成和分子量的變化隆線溞胚胎發(fā)育八個時期可溶性蛋白 SDS-PAGE 電泳結(jié)果表明(圖 2)，從胚胎產(chǎn)出期至準備孵化期，電泳圖譜上的條帶逐漸增多，即可溶性蛋白的種類或組成都逐漸增加，但胚胎發(fā)育各時期主要蛋白的組成都極為相近，只是同分子量的蛋白條帶在不同的發(fā)育時期含量不同。卵期的第、和時期，蛋白條帶數(shù)明顯較少，即蛋白質(zhì)的種類相對較少，僅分子量在 105.6119.7KD 間的蛋白帶含量特別高，而分子量小的蛋白條帶不明顯。其中，第期的蛋白質(zhì)圖譜中，分子

13、量約為 58.7KD 和 24.4KD 的兩蛋白條帶在后面幾個時期未出現(xiàn)，即使出現(xiàn)含量也極低，第、時期蛋白組成基本相似。從長胚期開始，蛋白條帶數(shù)明顯增多。長胚期的第、時期除個別蛋白條帶有差異外，大多數(shù)蛋白條帶較為相似，僅含量有所差異，分子量在 106.6120.7KD 和 19.823.4KD 間的蛋白帶含量較高。雙復(fù)眼期的第、時期蛋白條帶基本相一致，和長胚期一樣在分子量約為 19.823.4KD 間的蛋白帶含量較高。到單復(fù)眼期，即準備孵化期(期)，蛋白條帶與前面幾個發(fā)育時期差異較大，大分子量的蛋白條帶(分子量66.2KD)明顯減少，以小分子量(分子量4.3 隆線溞胚胎發(fā)育過程中氨基酸含量及組

14、成的變化和蛋白質(zhì)含量變化趨勢大體相同，隆線溞胚胎發(fā)育過程中總氨基酸的含量變化也大致呈下降趨勢，這與兩者的水解順序，即氨基酸來源于蛋白質(zhì)水解有關(guān)。總氨基酸含量在隆線溞胚胎發(fā)育的卵期呈下降趨勢，而在長胚期略微升高，可能是胚胎經(jīng)過快速卵裂，消耗了大量的營養(yǎng)物質(zhì)，很可能利用這個休息期積累和合成一些關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)(如氨基酸)，從而為胚胎進一步的快速發(fā)育作物質(zhì)和能量準備，這與蛋白質(zhì)含量在此時期增長的原因是相同的。總氨基酸含量從雙復(fù)眼期到準孵化期呈下降趨勢，可能是胚胎構(gòu)建組織與器官消耗了大量的營養(yǎng)物質(zhì)。隆線溞胚胎發(fā)育過程中必需氨基酸和非必需氨基酸的變異系數(shù)相對較大，其含量變化也較大，但總體呈下降趨勢，與總氨基

15、酸的變化趨勢大體相接近。在所檢測的必需氨基酸中，亮氨酸 Leu 和賴氨酸 Lys 的含量最高(占總氨酸的5.06%和 3.94%)。這是因為生物體的代謝中，二者均可分解成乙酰輔酶 A 和乙酰乙酸，它們是溝通糖類與脂類代謝的重要中間物質(zhì)。隆線溞胚胎內(nèi)的非必需氨基酸中谷氨酸 Glu 含量最高，胱氨酸 Cys 最低。這是因為 Glu 可與水產(chǎn)動物的蛋白代謝物 NH3 結(jié)合，經(jīng)谷氨酰胺酶分解成游離 NH3 排出體外；另外 Glu 在酶的催化下，可生成相應(yīng)的酮戊二酸，而酮戊二酸又是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵中間代謝產(chǎn)物。Glu 很可能在胚胎發(fā)育時期溝通糖、脂、核酸、蛋白質(zhì)代謝的三羧酸循環(huán)反應(yīng)比較活躍，因此含量最高

16、。Cys 的疏基是一種不太穩(wěn)定的基團，反應(yīng)性能高，在胚胎發(fā)育的各種代謝活動中，或在氨基酸測定的過程中易轉(zhuǎn)化成其它物質(zhì)。因此 Cys 較大的變異系數(shù)且與總氨基酸的相關(guān)性不明顯，很可能與其自身的特點有關(guān)。根據(jù)隆線溞胚胎形態(tài)發(fā)育以及胚胎發(fā)育過程中生化成分變化規(guī)律的研究，隆線溞胚胎發(fā)育的全部營養(yǎng)物質(zhì)均是由卵巢累積的，為提高母溞的產(chǎn)卵量和幼溞的成活率，建議在母溞的培育中要保證充足的食物供給，以提高卵子的數(shù)量和質(zhì)量；同時溞卵排入孵育囊后，盡可能保持水環(huán)境的穩(wěn)定，以免發(fā)育未成熟的胚胎自孵育囊內(nèi)排出，降低胚胎成活率。京都名師論文中心成立于 2000 年，是中國最頂級的論文工作平臺，致力于為全國各類客戶提供論文

17、指導(dǎo)、發(fā)表論文服務(wù)，以提供高品質(zhì)職稱論文服務(wù)為己任，是全國唯一一家依托北京各大高校學(xué)術(shù)資源、設(shè)置在北京大學(xué)校內(nèi)的論文發(fā)表服務(wù)機構(gòu)。一直以來，京都名師論文網(wǎng)致力于對高品質(zhì)教師職稱論文、教師職稱論文范文的傳承與傳播，對中國高品質(zhì)原創(chuàng)論文事業(yè)的推動，已得到社會各界的廣泛認可和贊譽。參考文獻1 施心路, 史新柏，微齒喜馬拉雅低額溞的生殖與發(fā)育，動物學(xué)報,42(3): 287-296，19962 N. N. Khmeleva, A. P. Golubev, A. Kidava, Growth andreproduction of Daphnia magna under changingphotoperi

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