1、題名（中英對照）：巨噬細胞IL-10和TNF-在人慢性牙周炎牙齦組織中表達的研究IL-10 and TNF- expression on macrophage in gingival tissue of human chronic periodontiti中文摘要背景及目的：牙周病（periodontitis diseases）是發生于牙齒周圍組織的炎癥性疾病，為口腔兩大疾病之一，是導致牙齒脫落的主要原因。牙周炎被認為是多因素疾病，目前認為牙周病的始動因子為牙菌斑生物膜。牙周致病菌不僅對牙周組織造成直接損傷，還可以通過刺激、調控宿主的免疫防御系統間接損傷牙周組織，目前認為這種免疫炎癥反應對牙周

2、組織的損傷遠超過了微生物對組織的直接作用。巨噬細胞（microphage, M）是機體防御反應的第一道防線，是固有免疫的重要組成部分，能對細菌或異物進行識別、吞噬以及清除。IL-10（interleukin-10）是一種多功能細胞因子，可抑制T淋巴細胞功能以及單核/巨噬細胞的活化和效應作用，對不同類型的造血細胞也發揮不同的作用。IL-10主要由Th2細胞產生，能有效抑制IL-1、IL-1、IL-6、IL-12、GM-CSF、TNF（tumor necrosis factor）等Th1細胞因子，從而發揮抑炎作用。TNF-主要由活化的M和Th1細胞分泌的細胞因子，作用于血管內皮細胞，誘導其合成黏附

3、因子，進而使白細胞尤其是中性粒細胞（neutrophil）以及單核細胞（monocytes）向血管內皮細胞（endothelial cells， EC）黏附以及向組織內游出，從而發揮抗炎的作用。IL-10、TNF-參與了Th細胞免疫應答的調控過程。目前有關M表達IL-10、TNF-在慢性牙周炎領域尚未見報道。 本研究通過觀察慢性牙周炎的牙齦組織中M表達IL-10、TNF-的情況，分析M分泌的IL-10、TNF-在牙周感染中的作用及其作用機制。研究結果將對后續以M IL-10、TNF-為靶點研究慢性牙周炎的免疫預防提供分子理論基礎和實驗依據。 方法：選取自愿接受研究的80名慢性牙周炎患者，依據慢

4、性牙周炎的分類標準分為4組：1)正常對照組20例；2)輕度慢性牙周炎組20例；3)中度慢性牙周炎組20例；4)重度慢性牙周炎組20例。牙齦標本采用10 %中性福爾馬林固定液浸泡處理，浸泡時間超過48 h，制作頰舌向5m的牙齦組織切片。H&E染色后光學顯微鏡下觀察其組織學變化。采用免疫組織化學技術（immunohistochemistry, IHC)，在光學顯微鏡下觀察組織中M（CD14+）募集以及CD14+、IL-10+、TNF-+ 的表達，并計算出平均陽性細胞率；然后采用免疫熒光雙染色（double immunofluorescence, DIF）進行染色，在熒光顯微鏡及共聚焦顯微鏡

5、下觀察牙齦組織標本中的CD14+-IL-10+及CD14+-TNF-+，并計算CD14+-IL-10+、CD14+-TNF-+的細胞密度(cells/mm2)。采取統計學軟件SPSS 13.0對計算所得數據作分析和處理，采用Wilcoxon符號秩檢驗、Kruskal-Wallis H檢驗、Nemenyi法檢驗、單因素方差分析(one-way ANOVA)和Pearson相關分析，P0.05時認為差異有統計學意義。結果：1、組織學觀察結果1）與正常對照組對比，三組慢性牙周炎患者的牙齦組織中炎癥細胞均顯著增加 (P0.01)；2）隨著牙周炎病變程度的加重，牙齦組織中炎癥細胞顯著增加 (P0.01)

6、。2、免疫組織化學染色結果1）與正常組對比，三組慢性牙周炎患者的CD14平均陽性細胞率均顯著上升(P0.01）；2）與正常組對比，三組慢性牙周炎患者的IL-10平均陽性細胞率表達水平均顯著下降 (P0.01)；3）與正常組對比，三組慢性牙周炎患者的TNF-平均陽性細胞率表達水平均顯著上升 (P0.01)。3、免疫熒光雙染色結果1）與正常組對比，三組慢性牙周炎患者的CD14+-IL-10+細胞密度均顯著下降(P0.01)；2）與正常組對比，三組慢性牙周炎患者CD14+-TNF-+細胞密度均顯著上升(P0.01)。4、慢性牙周炎的病變程度與M平均陽性細胞率、CD14+-IL-10+細胞以及CD14

7、+-TNF-+細胞三者之間的相關性經Pearson相關分析，結果顯示：1）慢性牙周炎的病變程度與各組M平均陽性細胞率、CD14+-TNF-+細胞密度之間的相關性為顯著的正相關的關系；2）慢性牙周炎的病變程度與CD14+-IL-10+細胞密度之間的相關性為顯著的負相關的關系。結論： 1、M平均陽性細胞率隨著牙周炎的嚴重程度的加重而顯著上升。 2、CD14+-TNF-+細胞密度隨著牙周炎的嚴重程度的加重而顯著上升。 3、CD14+-IL-10+細胞密度隨著牙周炎的嚴重程度的加重而顯著下降。 在牙周炎的過程中，牙齦組織中的M參與了牙周的抗感染免疫應答；M分泌的IL-10、TNF-在慢性牙周炎過程中，

8、通過抑炎和抗炎作用在免疫調控中可能起到關鍵性因子的作用。關鍵詞：慢性牙周炎；巨噬細胞；IL-10；TNF-Abstract Background and objectivePeriodontitis are inflammatory diseases that occur in periodontal tissues, leading to the loss of teeth. Periodontitis is considered to be a multifactorial disease, and it is currently believed that the plaque biof

9、ilm is a factor in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontal pathogens not only cause direct damage to the periodontal tissues, but also indirectly damage the periodontal tissues by stimulating and regulating the host's immune defense system. At present, it is believed that the damage

10、 of the periodontal tissue by this immune and inflammatory reaction far exceeds the direct effect of the microorganism on the tissue. Although much research has been conducted on the immune mechanisms of periodontal disease, the type of immune cells involved in periodontal disease and the immune mec

11、hanisms has not been elucidated.M (Macrophage) is the first line of defense of the body's defense response which is an important component of innate immunity. It can recognize, phagocytose, and remove bacteria or foreign bodies. IL-10 (interleukin-10) is a multifunctional cytokine that inhibits

12、T lymphocyte function and the activation of monocytes/macrop-ages. There are also differences in the effects of different types of hematopoietic cells. IL-10 is mainly produced by Th2 cells and can effectively inhibit IL-1, IL-1, IL-6, IL-12, GM-CSF, TNF (tumor necrosis factor) and other cytokines,

13、thus playing an anti-inflammatory role. TNF- is mainly composed of activation of M and Th1 cells secrete cytokine secretion in vascular endothelial cells, inducing the synthesis adhesion factor, thus makes leucocyte especially neutrophils and mononuclear cells, monocytes to vascular endothelial cell

14、s(EC) adhesion and swam out to the organization, so as to play the role of anti-inflammatory. Il-10 and TNF- were involved in the regulation of Th cell immune response. At present, there is no report on the expression of Il-10 and TNF- M in chronic periodontitis. In this study, We observed the expre

15、ssion of Il-10 and TNF- M in chronic periodontitis gingival tissue,and analyzed the role and mechanism of IL-10 and TNF- in periodontal infection. The results of the study will provide theoretical basis and experimental basis for the follow-up study on the immune control of chronic periodontitis, wh

16、ich is targeted by M IL-10 and M TNF-.Methods Eighty patients with chronic periodontitis who volunteered to receive the study were divided into four groups according to the classification criteria of chronic periodontitis: 1)20 patients in the normal control group; 2)20 patients in the mild chronic

17、periodontitis; 3)20 patients in the moderate chronic periodontitis; 4)20 patients in the severe chronic periodontitis. Gingival specimens were soaked in 10% neutral formalin and soaked for more than 48 hours, and the buccal tongue was made to the gingival tissue of 5m. After H&E staining, histol

18、ogical changes were observed under a light microscope. Immunohistochemical staining was used to observe the recruitment of M (CD14+) and the expression of CD14+, IL-10+ and TNF-+ in the tissue under an optical microscope, and the average positive cell rate was calculated. The CD14+-IL-10+ and CD14+-

19、TNF-+ in the tissue samples of the gingival tissue were observed under fluorescence microscope and confocal microscopy, and the density of CD14+-IL-10+ and CD14+-TNF-+ (cells/mm2) was calculated.The statistical software SPSS 13.0 was used to analyze and deal with the computed data, using Wilcoxon sy

20、mbol rank test, Kruskal-wallis H test, Nemenyi method test, Single factor variance analysis (one-way ANOVA) and Pearson correlation analysis, P0.05 the difference was regard as statistically significant.Results1. Histological observations1) Compared to the normal control group, inflammatory cells in

21、 the gingival tissues of three groups of chronic periodontitis were significantly increased (P<0.01); 2) inflammatory cells in the gingival tissue increased significantly with the severity of periodontitis (P<0.01).2. Immunohistochemical staining results1) Compared to the normal group, the exp

22、ression standard of CD14 average positive cells in three groups of chronic periodontitis remarkably increased (P<0.01);2) Compared to the normal group, the expression standard of IL-10 average positive cells in three groups of chronic periodontitis reduced remarkably (P<0.01);3) Compared to th

23、e normal group, the expression standard of TNF- average positive cells in three groups of chronic periodontitis increased significantly (P<0.01).3. Immunofluorescence double staining results1) Compared with the normal group, the CD14+-IL-10+ cells density in the three groups of chronic periodonti

24、tis was significantly reduced (P<0.01); 2) Compared with the normal group, the density of CD14+-TNF-+ cells in the three groups of patients with chronic periodontitis increased significantly (P<0.01).4. Correlation between the degree of chronic periodontitis and the average positive rate of M,

25、 CD14+-IL-10+ cells and CD14+-TNF-+ cellsBy Pearson correlation analysis, the results showed that:1) The correlation between the degree of chronic periodontitis and the average positive cell rate of M and CD14+-TNF-+ cell density was a significant positive correlation; 2) The correlation between the

26、 degree of chronic periodontitis and the average positive cell rate of CD14+-IL-10+ cell density was a significant negatively correlation.Conclusion1. The average positive cell rate of M increased significantly with the severity of periodontal inflammation.2. The CD14+-TNF-+ cell density increased s

27、ignificantly with the severity of periodontal inflammation.3. The CD14+-IL-10+ cell density decreased significantly with the severity of periodontal inflammation.The process of periodontitis, M in gingival tissue participates in the periodontal anti-infectious immune response. IL-10 and TNF- secrete

28、d by M may play a key role in immune regulation through anti-inflammatory and anti-inflammatory effects during chronic periodontitis.KeywordsChronic periodontitis; Macrophage; IL-10; TNF-目 錄中文摘要.英文摘要. 目錄.前言.11. 牙周病的病因和發病機制.12. M分泌的IL-10與牙周炎關系的研究進展.33. M分泌的TNF-與牙周炎關系的研究進展.84. 本課題的研究目的和意義.10材料與方法.121.

29、 實驗器材122. 病例選擇、分組及標本收集.143. 實驗操作方法.154. 統計學分析.20結果.211. 組織學觀察結果212. 免疫組織化學染色觀察結果223. 免疫熒光雙染色染色觀察結果.254. 免疫陽性細胞與慢性牙周炎程度相關性分析結果28討論.311. 巨噬細胞參與人慢性牙周炎的免疫調節過程312. 雙陽性巨噬細胞在慢性牙周炎牙齦組織中的表達及意義32結論.35參考文獻.36附錄一.45附錄二（附圖）.48附錄三知情同意書.72VIII前 言1.牙周病的病因和發病機制牙周病（periodontitis diseases）是發生于牙齒周圍組織的炎癥性疾病，為口腔兩大疾病之一，是導

30、致牙齒脫落的主要原因。依據累及部位的不同分為累及牙齦組織的牙齦病，以及累及牙周支持組織的牙周病兩種1。牙周炎被認為是多因素疾病，目前認為牙周病的始動因子為牙菌斑生物膜及其產物，部分牙周致病菌所形成的抗原成分以及在其代謝的過程中所生成的酶以及毒素均可直接對牙周組織造成損傷，因此牙菌斑與牙周炎病程的進展密切相關2。牙周致病菌不僅對組織造成直接損傷，還可以通過刺激、調控宿主的免疫防御系統間接損傷牙周組織。牙周致病菌本身無法誘發產生牙周炎，已經有越來越多的研究結果顯示，在疾病的發展過程中，機體的免疫系統處理感染因子的過程起到主要的作用。Th1以細胞免疫為主而Th2細胞以體液免疫為主，Th1、Th2之間

31、的平衡狀態被認為是維持全身免疫系統內環穩定的重要因素，它們的異常分泌將引起炎癥過程的失衡3-8。在相關的慢性牙周炎的臨床資料中以及實驗中顯示，在牙周炎的早期穩定階段，Th1細胞及其細胞因子起到主要的作用，在牙周組織病變程度加重時，Th2細胞起到主要作用 9-11。通過對牙齦溝液中所含的細胞因子的濃度加以分析對比，研究顯示前列腺素2(prostaglandin, PGE2)、IL-1、干擾素（interferon-, IFN-）以及IL-2的濃度是增加的，IL-4、IL-6的濃度是減少的，可以推斷在牙周組織的病變過程中，Th1型細胞因子的表達水平比Th2型細胞高12。在牙周炎形成、發展以及轉歸過

32、程中，以IFN-、TNF-為代表的Th1型細胞因子和以IL-4、IL-10為代表的Th2型細胞因子起到十分重要的作用。根據醫學調查相關數據顯示，我國輕度或重度牙周炎的成年人患者達80%-97% 13。研究表明，牙周炎不僅僅是引起牙齒脫落的重要因素，并且易影響全身健康而引起呼吸道疾病、心血管疾病以及風濕性關節炎等疾病14-15。有學者研究認為慢性牙周炎產生的細菌酶可能破壞了口腔粘膜表面，改變了呼吸道上皮通透性，從而降低宿主非特異性防御機制對潛在呼吸道病原菌的抵抗作用16-17。根據相關醫學調查報告中的數據，口腔的衛生情況對于口腔疾病和呼吸道疾病有著較大的影響，其中口腔衛生狀況差的患病幾率要比有著

33、良好口腔衛生習慣的人群的患病幾率高出450%。研究發現，導致呼吸道疾病的因素可能是因為牙周炎的炎癥介質進一步感染。此外，當前有研究認為其他疾病也可能導致牙周炎的發生，如糖尿病患者病程后期多伴隨牙周炎，因此牙周炎被認為是糖尿病的并發癥之一18。牙周炎是由多類牙周致病菌、大量的炎性介質和多種不同的免疫細胞之間共同作用的結果，主要特點為牙周結締組織的破壞、牙槽骨的吸收以及牙周附著水平的喪失。當前，在牙周炎的免疫應答機制上盡管已經作了大量的實驗研究，但是，在引起牙周炎的感染的細胞因子以及相關的免疫機制仍未明確。2、M分泌的IL-10與牙周炎關系的研究進展 2.1 IL-10的結構IL-10是一種多功能

34、細胞因子，可以抑制T淋巴細胞以及單核細胞、M的活化與效應，對不同類型的造血細胞的作用也存在差異19。在以往的研究中發現IL-10最早是由Th2細胞所誘導生成的，其抑制IL-2、TNF-、INF-等細胞因子的產生。有研究報道，B細胞和B細胞淋巴瘤也發現產生IL-10，由此可推斷在對宿主的免疫應答機制的抑制作用上，IL-10以及其同源物起到關鍵性作用。人類hIL-10基因由相應染色體上的5個外顯子編碼，激活的IL-10基因導致2kbhIL-10mRNAs表達20-25。IL-10可以由多種細胞表達，它的表達受到不同細胞類型不同機制的調控，在T細胞、單核細胞及M中，IL-10轉錄可以被轉錄信號肽1(

35、signal petide, SP)和轉錄因信號肽3調控，轉錄因子SP1和SP3由許多不同的細胞類型組成表達26-27。研究顯示，IL-10抑制M的信號通路需要信號轉導和轉錄激活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3，stat3），IL-10受體末端15個氨基酸片段與Stat3一起在IL-10發揮作用，抑制M的活化，目前認為stat3是所有IL-10應答細胞中信號傳導所必須的，但必須激活一種或多種途徑實現IL-10對M活化的抑制28-30。2.2 IL-10的生物學效應IL-10對于單核細胞、M以及樹突狀細胞（dendrit

36、ic cells, DCs）都存在影響。IL-10能有效抑制IL-1、IL-1、IL-6、IL-12、GM-CSF、TNF等細胞因子的表達。在抗炎過程中，IL-10占據主要的作用，并且能夠抑制TNF和IL-1的產生。在炎癥的發生發展過程中，以上的細胞因子起到相互協同的作用，并且能夠誘導炎癥介質前列腺素（prostaglandin, PGE）、單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1, MCP1）、M炎癥蛋白1（macrophage inflammatory proteins 1, Mip-1）、Mip-1、M衍生趨化因子（macrophage-d

37、eprived chemokine, MDC），由此可推斷IL-10抑制大多數炎癥細胞因子的表達 31-32。IL-10通過抑制基質金屬蛋白酶2生成的作用從而抑制單核細胞及M外基質轉換的能力，反而使金屬蛋白酶組織抑制劑以及透明質酸（hyaluronic acid）的作用增加，進而促使血管的生成以及遷移。IL-10上調FcR (fc-gamma receptors)的表達可增強單核細胞及M吞噬細菌和真菌的能力33-35。IL-10還可下調了Toll樣受體細胞4（toll-like receptors, TLR4）的表達，并增強了CD14、CD16、CD64和CD13的表達36-37。以上結果可推

38、斷，IL-10可誘導巨噬細胞分化，并且限制正在進行的免疫反應和炎癥，同時有助于增強吞噬作用消除感染。動物實驗顯示，在缺乏IL-10小鼠中發現自發性小腸炎、結腸炎等癥狀，也可說明IL-10主要功能是限制免疫應答的強度38-39。2.3 M分泌的IL-10在牙周免疫病理中的作用IL-10的主要由Th2細胞、活化B淋巴細胞、單核細胞、M生成，另外，還存在一些其他的細胞也可以誘導分泌IL-10，如CD8+T細胞、Th1細胞、角質細胞（Keratinocyte）以及肥大細胞（mast cell）等。IL-10的抑制作用主要是針對B淋巴細胞、T淋巴細胞、單核細胞、M以及肥大細胞，通過對促炎因子的抑制作用進

39、而抑制CD4+T細胞合成、從而抑制TNF-、IL-1產生。M首先通過對TNF- 、IL-1的釋放促使免疫應答的增強，再通過調節IL-10的釋放，反饋性抑制相關炎癥細胞因子的釋放，從而達到免疫反應的平衡40-41。IL-10對牙周所起到的保護機制可能是由于抑制促炎因子及粘附因子、趨化因子的生成，減少了中性粒細胞及單核細胞遷移到炎癥組織從而促使牙周修復。牙周炎中IL-10呈彌散式分布，且分布的十分廣泛，在正常牙齦組織的M中檢出IL-10表達明顯，在牙周炎組織的M中只能檢出少量的IL-10表達。實驗研究顯示，在牙周炎中，IL-10mRNA細胞呈陽性的較少，且一般情況下以牙齦的固有層的分布為主，其中有

40、的著色清晰易識別，有的集中分布在血管的周圍，于上皮層無法見到較為明顯的陽性表達的信號。 Lappin等42認為IL-10細胞在牙周組織中的表達增多即為牙周炎靜止期的組織損傷特征，通過使用刮治及根面平整等對牙周炎進行治療， 使得IL-10表達增加，表明其促使了牙周的修復。通過逆轉錄PCR反應對牙齦健康組以及牙周炎組中IL-10mRNA的表達情況進行對比研究，可知牙周炎組的IL-10mRNA表達水平較健康組顯著減少43。通過采取多克隆抗體檢測法對牙周炎的炎癥組織中的IL-10的表達情況進行檢測，可以發現Th2細胞在牙周炎的早期穩定期以及成人牙周炎的炎癥組織中的表達水平較高42。因為沒有系統性的對M

41、中的IL-10的表達情況作出研究，所以，對于牙周組織中M的IL-10對牙周致病菌抗原的識別過程以及對牙周病的調節免疫機制的闡述仍不明確。3、M分泌的TNF-與牙周炎關系的研究進展3.1 TNF-的結構Carswell等44于1975年在實驗研究中發現，在小鼠的血清中發現腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF）。在此之后，通過對TNF的進一步研究，發現其不僅具有針對腫瘤細胞的細胞毒性作用，還可以參與免疫調節以及多個炎癥反應過程。依據不同的來源以及結構組成，TNF分為TNF-和TNF-。其中，TNF-即惡液素（cachectin），生成部位為活化的單核巨噬細胞；TNF-

42、即淋巴毒素（lytnphotoxin），生成部位是淋巴細胞。在宿主的免疫防御系統中，TNF具有廣泛的致炎作用以及免疫調節作用，并且在病理狀態下如敗血癥、牙周炎等皆出現表達過度的情況。TNF基因與主要組織相容性復合物基因緊密連鎖。TNF-基因位于HLA-DR（human leukocyte antigens, HLA）和HLA-B位點之間的HLA-抗原基因簇，即染色體6p21.4區域44-46。TNF-與TNF-基因的組成均是3個內含子和4個外顯子，除了第四個外顯子之間高度同源之外，其余內含子及外顯子都是不同源的47。TNF基因簇具備多中類型的多態性，如單個核苷酸的多態性（single nucl

43、eotide polymorphisms , SNP）、限制片段長度的多態性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）以及微衛星的多態性48-49。Udalova等45已經發現在TNF中存在五種微衛星即TNFae，TNFa、b、d是多等位基因，具有高度的多態性，TNFc是雙等位基因，TNFe是三等位基因，此外有研究表明，上述等位基因和人類的MHC、位點之間存在著連鎖不平衡性。有實驗研究顯示，TNF-的含量與個體的牙周炎的患病易感性以及病變的程度相關50-51。Calbraith等52-53研究認為在重度牙周炎的患者中存在的TNF2（G/A）

44、基因型人數比例較大。TNF通過與TNF受體（TNFR）進行結合發揮作用，TNF-家族中最早被發現的TNF受體為TNFR1及TNFR2，TNFR1參與了TNF-所有的活性功能，包括細胞凋亡、分化、增殖、抗菌和PGE的合成，TNFR2則介導部分特定細胞的功能如胸腺T細胞的增殖以及胰島素的拮抗作用等54-56。3.2 TNF-的生物學效應TNF-通過與其受體相結合，從而啟動鞘磷脂酶-神經酞胺（Sphingomyelinase-ceramide）信號轉導通路、激活轉錄因子NF-K（nuclear factor- K）的信號通路、蛋白激酶（protein kinases）通路等，促進單核細胞及M對IL-

45、1、 IL-6、IL-8、以及TNF-的分泌，形成細胞因子級聯反應。依據有關研究可知，TNF還能夠通過增強激活中性粒細胞，從而使其表達的白細胞分化出抗原復合物CD11+/CD18+。另外TNF-還能激活EC使其表達細胞間粘附分子1與內皮細胞豁附分子1，使白細胞與EC之間產生作用，促進活性氧以及彈性蛋白酶的大量釋放，并將損傷EC以及器官組織細胞，刺激EC細胞釋放凝血因子III（blood coagulation factor III），進而啟動凝血機制57-58。3.3 M分泌的TNF-在牙周免疫病理中的作用目前，通過大量的實驗研究均可顯示TNF-是由活化M分泌，但在中性粒細胞、自然殺傷細胞（n

46、atural killer cells, NK）、成纖維細胞（fibroblast）以及肥大細胞中也可誘導分泌TNF-59。在牙周炎中，TNF-作用于EC，誘導其合成黏附因子，進而使白細胞尤其是中性粒細胞以及單核細胞向EC黏附以及向組織內游出。TNF-還能介導生成各類效應T細胞、抗體以及促進B細胞的分化，通過對成纖維細胞的刺激而進一步生成PGE以及膠原酶，提升破骨細胞的活性60。TNF-的骨吸收的機制為使破骨細胞含量增多，同時降低骨基質的鈣化程度。TNF-還能夠通過對纖維細胞的組織結構進行改變，從而重組細胞骨架，并且介導合成膠原酶（collagenase）而促進膠原纖維(collagen fi

47、bers)的降解，因此可知，TNF-是促進牙槽骨吸收的一個重要的細胞因子61。有報道稱：如果對牙周組織中TNF-及其受體的結合過程加以抑制，那么可以降低牙槽骨炎癥部分的骨吸收能力62。4、本課題的研究目的和意義本次研究通過收集病變程度不同的牙周炎患者牙齦組織樣本，制作組織學切片，采用H&E染色法、免疫組織化學以及免疫熒光雙染色法，對牙齦組織的炎癥程度、M以及雙陽性M的表達情況進行觀察。通過對牙周炎牙齦組織的炎癥程度等級評分、計算M、CD14-IL-10和CD14-TNF-雙陽性M的表達密度。分析M、CD14-IL-10和CD14-TNF-雙陽性M與慢性牙周炎的病變程度的相關性及其在牙周

48、感染中的作用和作用機制；闡明M、CD14-IL-10和CD14-TNF-雙陽性M在宿主免疫反應中的功能特征。研究結果將對后續以CD14-IL-10和CD14-TNF-雙陽性M為靶點的研究慢性牙周炎的免疫預防提供分子基礎和實驗根據。材料與方法1.1實驗器材11主要實驗儀器及設備（表1）1.2主要實驗試劑及藥品（表2）2. 病例選擇、分組及標本收集2.1牙周炎病例選擇收集2015年12月-2016年6月就診于中山市人民醫院的牙周科門診并自愿加入本研究的80例患者，年齡在2060歲，其中男47例（46歲±15歲），女33例(39歲±13歲)，患者年齡以及性別均不存在統計學差異。研

49、究對象納入標準：一年內未進行過牙周手術的治療；患有糖尿病的患者要被排除；排除處于妊娠期者；患有其他系統性疾病的患者也不能參與研究；短時間內服用過避孕藥的患者要進行排除；同時，研究對象需要滿足三個月內沒有服用過抗生素類的藥品的條件；在進行收集中重度慢性牙周炎患者牙齦組織之前，其必須作牙周基礎治療，且在療程結束后牙周袋底仍存在出血（bleeding on probing ，BOP）現象者。2.2分組及標本收集2.2.1 分組依據 依據于1999年的美國牙周病學會制定的牙周病新分類作為標準63，將本次研究的80例患者平均分為四組，分別通過牙齦指數（GI）、牙周附著水平(AL)、牙周探診深度（PD)作

50、為評估標準。2.2.2 確定分組，收集標本1)正常對照組：收集由于口腔正畸治療需拔除但健康的前磨牙牙齦組織：無炎癥、附著喪失、牙周袋以及牙槽骨吸收且BOP(-)。2)輕度慢性牙周炎組：收集臨床牙冠延長術治療的牙齦組織：輕度炎癥、附著喪失不超過3 mm、牙周袋深度不超過4 mm以及X線片可見牙槽骨吸收程度在根長為1 /3 以內且BOP(+)。3)中度慢性牙周炎組：收集需進行牙周翻瓣術治療的內斜切口牙齦組織：炎癥較為明顯、牙周袋深度在4-6 mm、附著喪失水平在3-5 mm且X線片可見牙槽骨吸收程度超過根長的1/3但在根長的2/3以內、患牙根部存在輕度松動以及分叉處輕度病損的可能且BOP（+）。4

51、)重度慢性牙周炎組：收集必須拔除的患牙或預后不良的患牙的牙齦組織：明顯炎癥、附著喪失水平超過5 mm、牙周袋深度超過6 mm、X線片可見牙槽骨吸收程度超過根長的2/3、患牙根分叉區域存在較嚴重的病損，其牙齒有多數松動且BOP(+)。3.實驗操作方法3.1配制濃度為10%中性福爾馬林固定液使用電子天平進行稱重獲得16.4 g的NaH2P04.12 H20以及5.2 g的NaH2P04.2H20，采用100 ml 40 %甲醛溶液溶解配置好的NaH2P04.12H20、NaH2P04.2H20，再倒入純凈蒸餾水900 ml，而后通過精準度高的pH計對溶液的酸堿度進行測定，且依據測定的pH值逐滴加入

52、高濃度的NaOH或者HCl溶液，進而將溶液逐漸調至中性。3.2標本的處理將所收集的牙齦組織標本加以處理，使用生理鹽水對標本進行蕩洗2-3次，每次2-3 sec，然后再將制備完成的標本于10 %中性福爾馬林固定液即pH=7.0至少放置48 h。3.3制備組織切片玻片的處理：首先將載玻片與蓋玻片在清潔液中放置24 h，再使用蒸餾水沖洗3 min，共沖洗5次，之后置于95 %酒精中進行浸泡2 h,干燥后放置在干燥箱中以作備用。1)脫水：將使用梯度酒精對已制備好的標本進行脫水處理，過程依次為：流動水進行漂洗4-5 h，再依次置于75 %酒精3 h、80 %酒精2 h、90 %酒精1 h、95 %酒精(

53、I)1 h、95 %酒精(II)1 h、無水乙醇(I)1 h以及無水乙醇(II)1 h浸泡處理；2)透明：運用二甲苯處理，使切片呈透明狀態，過程依次為：二甲苯乙醇(1：1) 浸漬15 min、二甲苯(I)浸漬20 min、二甲苯(II) 浸漬20 min；3)浸蠟以及包埋，過程為：將組織置入熔點65 的石蠟浸漬1 h，然后再采用熔點62 的石蠟進行包埋。3.4 組織學染色及觀察1)將石蠟切片加以常規脫蠟：先將切片放于62 烤箱中30 min，再使用二甲苯(I)浸漬15 min、二甲苯(II)15 min；2)采用梯度酒精對切片作復水，過程依次為：分別浸漬在無水乙醇(I)15 min、無水乙醇（

54、II）15 min、95 %酒精5 min、90 %酒精5 min、80 %酒精5 min、75 %酒精5 min后，取出切片再使用蒸餾水進行沖洗3 min后將水分甩干；3)蘇木素染色：先將切片放在蘇木素液中浸漬10-15 min，取出后再使用流動水對其進行漂洗3 min，再使用1 %鹽酸酒精快速分化12 sec，然后使用蒸餾水進行對切片繼續漂洗1 min，再把甩干水分，并且放在中和堿溶液中浸漬1 min，最后使用流動水漂洗3 min后將水分甩干；4)酒精脫水，過程依次為：分別置于80%酒精35 min、95%酒精（）35 min、95 %酒精（）35 min進行脫水處理；5)伊紅染色：先將切

55、片放在1 %酒精伊紅液浸漬10 min，然后依次繼續使用無水乙醇（）5 sec、無水乙醇（）5 sec、無水乙醇（）5 sec加以洗滌，將水分甩干；6)透明、封片：先使用二甲苯（）以及二甲苯（）對切片進行作透明處理各3min，再使用中性樹脂進行封片；3.5 免疫組織化學染色及觀察1)將石蠟切片加以常規脫蠟：先將切片放于62 烤箱中30 min，再使用二甲苯(I)浸漬15 min、二甲苯(II)15 min；2)采用梯度酒精對切片作復水，過程依次為：分別浸漬在無水乙醇(I)15 min、無水乙醇（II）15 min、95 %酒精5 min、90 %酒精5 min、90 %酒精5 min、80 %酒精5 min、75 %酒精5 min后，取出切片再使用蒸餾水進行沖洗3 min后將水分甩干；3)PBS緩沖液對切片進行洗滌3次，每次3 min；4)微波輻射抗原修復：在檸檬酸鹽緩沖液中將切片完全浸沒，使用微波爐高火加熱至100 ，改用中火繼續加熱切片20 min，然后放在室溫下冷卻至常溫；5)再次使用PBS緩沖液對切片進行洗滌3次，每次3 min；6)內源性過氧化物：在全部的組織切片上滴加3 %H2O2去離子水（SP免疫組化檢測試劑盒），在室溫下對切片進行孵育10 min；7)PBS緩沖液洗滌3次，每次3 min；8)封閉：將組織切片上的PBS磷酸鹽緩沖液