1、現代免疫分析技術及展望現代免疫分析技術及展望湖北省臨床檢驗中心湖北省臨床檢驗中心黃黃 鵬鵬不適當的評價限及分組方法不適當的評價限及分組方法對能力驗證對能力驗證/ /室間質評結果所造成的影響室間質評結果所造成的影響（以腫瘤標志物檢測為例，適合內分泌檢測）（以腫瘤標志物檢測為例，適合內分泌檢測） 一、湖北省腫瘤標志物能力驗證一、湖北省腫瘤標志物能力驗證/ /室間質評活動指室間質評活動指定值（靶值）確定進程定值（靶值）確定進程 自自20072007年始，依年始，依北京科臨易檢軟件公司北京科臨易檢軟件公司提供的室間質評軟件，提供的室間質評軟件，借鑒借鑒部臨檢中心對腫瘤標志物采用的相關評價方法部臨檢中心

2、對腫瘤標志物采用的相關評價方法，在指定值（靶，在指定值（靶值）確定上經歷了如下進程：值）確定上經歷了如下進程： 二、不同類型檢測試劑盒、儀器及實驗檢測方法二、不同類型檢測試劑盒、儀器及實驗檢測方法分組統計結果間的比較分組統計結果間的比較 三、湖北省腫瘤標志物檢測三、湖北省腫瘤標志物檢測能力驗證能力驗證/ /室間質評活動指定值（靶值）確定的發展趨勢室間質評活動指定值（靶值）確定的發展趨勢 對現代免疫分析技術進行系統性回顧尤為必要對現代免疫分析技術進行系統性回顧尤為必要 （一）酶聯免疫吸附試驗（一）酶聯免疫吸附試驗（ELISAELISA） 1 1、待檢標本（、待檢標本（抗體或抗原抗體或抗原）與）與

3、酶標記抗原或抗體酶標記抗原或抗體按一定按一定程序與結合在固相載體上的抗原或抗體發生特異免疫反應；程序與結合在固相載體上的抗原或抗體發生特異免疫反應； 2 2、反應終止時，固相載體上酶標抗原或抗體被結合，與、反應終止時，固相載體上酶標抗原或抗體被結合，與待檢抗體或抗原量成一定比例；待檢抗體或抗原量成一定比例； 3 3、加酶反應底物后，底物可在酶作用下出現、加酶反應底物后，底物可在酶作用下出現顏色反應顏色反應，顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。 ELISAELISA方法方法: : 既特異又敏感。既特異又敏感。 應用此技術的自動化儀器設備

4、包括：應用此技術的自動化儀器設備包括： 羅氏公司羅氏公司: : ES300ES300、 Cobas CoreCobas Core（IIII） Bio-Rad Bio-Rad 公司：公司： CODACODA、EVOLISEVOLIS （三）（三） 酶促放大時間分辨熒光免疫分析酶促放大時間分辨熒光免疫分析（EATRF IAEATRF IA） 引入了時間分辨熒光免疫技術，有利于排除特異熒光的引入了時間分辨熒光免疫技術，有利于排除特異熒光的干擾，并經酶促信號放大，增強了測量的特異性。干擾，并經酶促信號放大，增強了測量的特異性。 見于美國見于美國 M D M D 公司公司（Molecular Devic

5、es CorporationMolecular Devices Corporation）的）的SPECTRA max GEMINI XSSPECTRA max GEMINI XS。 （一）（一） 透射濁度法（透射濁度法（TurbidimetryTurbidimetry） 1 1、抗原抗體復合物，使介質濁度發生改變；、抗原抗體復合物，使介質濁度發生改變； 2 2、光線通過抗原抗體反應后的溶液，被復合物微粒吸、光線通過抗原抗體反應后的溶液，被復合物微粒吸收；收； 3 3、透射光被吸收的量（吸光度）與免疫復合物的量呈、透射光被吸收的量（吸光度）與免疫復合物的量呈正相關；正相關； 4 4、測量透射光強

6、度，與已知濃度的抗原對照，計算被、測量透射光強度，與已知濃度的抗原對照，計算被檢測溶液抗原的含量。檢測溶液抗原的含量。 優點：優點：合適的試劑，可在生化分析儀中作全自動分析。合適的試劑，可在生化分析儀中作全自動分析。 （二）（二） 散射濁度法散射濁度法（NepHelometryNepHelometry） 1 1、一定波長的光沿水平軸照射，通過溶液時遇到抗原、一定波長的光沿水平軸照射，通過溶液時遇到抗原抗體復合物微粒；抗體復合物微粒； 2 2、光線被微粒折射，發生偏轉，光線偏轉的角度與發、光線被微粒折射，發生偏轉，光線偏轉的角度與發射光的波長和抗原抗體復合物大小、多少密切相關；射光的波長和抗原抗

7、體復合物大小、多少密切相關； 3 3、散射光的強度與復合物的含量成正比，即待測物越、散射光的強度與復合物的含量成正比，即待測物越多，形成的復合物越多，散射光強度越強；多，形成的復合物越多，散射光強度越強； 4 4、儀器通過微電腦對測量數據自動分析處理，即可得、儀器通過微電腦對測量數據自動分析處理，即可得知待測抗原的含量。知待測抗原的含量。 此原理研發的全自動分析系統有：此原理研發的全自動分析系統有： Beckman-Coulter Beckman-Coulter 公司：公司：ArrayArray和和ImmageImmage SIEMENS SIEMENS的的 BNBN系列產品系列產品 三三 、

8、熒光免疫分析（、熒光免疫分析（FIA） 是抗原是抗原- - 抗體結合反應與熒光物質發光分析相結合的免抗體結合反應與熒光物質發光分析相結合的免疫分析技術。疫分析技術。 以雙抗夾心法為例：以雙抗夾心法為例： 1 1、首先將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體；、首先將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體； 2 2、除去未結合抗體，加受檢標本，使其中的蛋白抗原、除去未結合抗體，加受檢標本，使其中的蛋白抗原與固相抗體形成抗原抗體復合物；與固相抗體形成抗原抗體復合物； 3 3、洗滌除去未結合物，加入熒光標記的抗體，使之與、洗滌除去未結合物，加入熒光標記的抗體，使之與抗原特異性結合，形成抗體抗原特異性

9、結合，形成抗體- -抗原抗原- -抗體復合物；抗體復合物； 4 4、最后根據熒光強度，即可對蛋白抗原進行定量。、最后根據熒光強度，即可對蛋白抗原進行定量。 普通的熒光檢測水平能達到普通的熒光檢測水平能達到ng/Lng/L至至mg/Lmg/L。 熒光免疫分析系統（熒光免疫分析系統（FIAFIA系統）的分析技術包括：系統）的分析技術包括： 熒光偏振免疫分析熒光偏振免疫分析（FPIAFPIA）；）； 熒光酶免疫分析熒光酶免疫分析（FEIAFEIA）；）； 時間分辨熒光免疫分析時間分辨熒光免疫分析（TRFIATRFIA）。）。（二）熒光酶免疫分析（二）熒光酶免疫分析（FEIAFEIA） 1 1、利用酶

10、標記抗原（或抗體）與待檢抗原（或抗體）反、利用酶標記抗原（或抗體）與待檢抗原（或抗體）反應；應； 2 2、借助、借助酶反應熒光底物酶反應熒光底物，經酶促反應生成穩定、高效的，經酶促反應生成穩定、高效的熒光物質；熒光物質； 3 3、通過測定熒光強度確定待檢抗原或抗體的含量、通過測定熒光強度確定待檢抗原或抗體的含量。 代表性儀器為：代表性儀器為： 法國梅里埃公司的法國梅里埃公司的VIDASVIDAS全自動熒光酶免疫分析系統等。全自動熒光酶免疫分析系統等。 五、五、 流式細胞分析流式細胞分析 流式細胞分析是綜合流式細胞分析是綜合激光技術、計算機技術、顯微熒光激光技術、計算機技術、顯微熒光光度測定技術

11、、流體噴射技術、分子生物學和免疫學多門學光度測定技術、流體噴射技術、分子生物學和免疫學多門學科科的科學技術。的科學技術。 流式細胞儀的原理流式細胞儀的原理 1 1、采用激光作為激發光源，保證其具有更好的單色性、采用激光作為激發光源，保證其具有更好的單色性與激發效率；與激發效率； 2 2、利用熒光染料與單克隆抗體技術結合的標記技術，、利用熒光染料與單克隆抗體技術結合的標記技術，保證檢測的靈敏度和特異性；保證檢測的靈敏度和特異性； 3 3、用計算機系統對流動的單細胞懸液中單個細胞的多、用計算機系統對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數信號進行數據分析，保證檢測速度與統計分析的精確個參數信號進行數據

12、分析，保證檢測速度與統計分析的精確性。性。 代表的分析儀有：代表的分析儀有： 貝克曼的貝克曼的EPICSEPICS流式細胞儀流式細胞儀 BD BD的的 FACSCaliburFACSCalibur流式細胞儀流式細胞儀 六六 、生物芯片、生物芯片 生物芯片（生物芯片（BiochipBiochip）又稱微陣列（）又稱微陣列（MicroarrayMicroarray），是），是一種通過微加工技術和微電子技術，在固相載體芯片表面構一種通過微加工技術和微電子技術，在固相載體芯片表面構建的微型生物化學分析系統。建的微型生物化學分析系統。 在面積很小（可達幾個平方毫米）的固相材料（玻片、在面積很小（可達幾個

13、平方毫米）的固相材料（玻片、硅片、金屬片、尼龍膜等）芯片表面，有序地點陣固定排列硅片、金屬片、尼龍膜等）芯片表面，有序地點陣固定排列一定數量的可尋址分子（一定數量的可尋址分子（DNADNA、抗體或抗原等蛋白質及其他、抗體或抗原等蛋白質及其他分子）。分子）。 這些成分與待測成分及相應的標記分子結合或反應這些成分與待測成分及相應的標記分子結合或反應，結，結果以熒光、化學發光或酶顯色等指示，果以熒光、化學發光或酶顯色等指示，再用掃描儀或再用掃描儀或CCDCCD攝攝像等技術記錄，像等技術記錄，經計算機軟件處理和分析，最后得到所需要經計算機軟件處理和分析，最后得到所需要的信息。的信息。 生物芯片能夠在短

14、時間內分析大量的生物分子，快速準確生物芯片能夠在短時間內分析大量的生物分子，快速準確地獲取樣品中的生物信息，地獲取樣品中的生物信息，效率是傳統檢測手段的成百上千倍效率是傳統檢測手段的成百上千倍。 由于生物芯片技術在疾病篩查和早期診斷上的優勢，已經由于生物芯片技術在疾病篩查和早期診斷上的優勢，已經成為檢驗醫學發展的熱點之一。成為檢驗醫學發展的熱點之一。 英國朗道公司（英國朗道公司（RANDOXRANDOX）生產的）生產的EVIDENCE180EVIDENCE180全自動生物全自動生物芯片分析儀，在一張芯片分析儀，在一張9mm9mm2 2的正方形固相載體芯片上，可同時進的正方形固相載體芯片上，可同

15、時進行多種腫瘤標志蛋白質或細胞因子檢測。行多種腫瘤標志蛋白質或細胞因子檢測。ImmunoAssayImmunoAssay）。）。生物芯片分析儀生物芯片分析儀七、七、 展望展望 隨著各種免疫技術及其他科學技術的進步，使得臨床免疫隨著各種免疫技術及其他科學技術的進步，使得臨床免疫分析向分析向自動化、規范化、標準化、集成化、微型化、網絡化、自動化、規范化、標準化、集成化、微型化、網絡化、系統化與一體化系統化與一體化，不斷提高實驗結果的靈敏度、精密度和速度，不斷提高實驗結果的靈敏度、精密度和速度，促進實驗室之間結果互認的方向發展。促進實驗室之間結果互認的方向發展。 隨著免疫檢驗的自動化，檢驗同仁們應注重隨著免疫檢驗的自