1、生物學實驗之凝膠回收基礎及操作 膠回收基礎知識一一目 錄2 試劑耗材與設備三三 操作流程四四 常見問題解答五五 方法及應用二二 膠回收基礎知識一一目 錄3 試劑耗材與設備三三 操作流程四四 常見問題解答五五 方法及應用二二1.膠回收的概念2.膠回收的原理1.1 膠回收概念從電泳后的凝膠中回收目的DNA的過程，其目的是將目標DNA重新利用。Lane M:1kb DNA MarkerLane 1:膠回收前的2.7kb DNA段Lane 2:膠回收后的2.7kb DNA段切割Lane 1后，經處理回收DNA，經電泳得到Lane 2。切割回收41.2 膠回收原理利用核酸在裂解液下與硅膠膜吸附柱特異性結

2、合，在洗脫液條件下被洗脫，從而達到核酸純化回收的目的。電泳后 ，切下凝膠稱重后，加入等體積溶膠液上柱吸附DNA除膠脫鹽洗脫5 膠回收基礎知識一一目 錄6 試劑耗材與設備三三 操作流程四四 常見問題解答五五 方法及應用二二1.分類2.應用2.1 分類1硅膠柱法2玻璃奶/純化填料法3低熔點瓊脂糖法4透析帶電洗脫法5DEAE纖維素膜紙片法72.1.1 硅膠柱法采用可以高效、專一結合DNA的硅基質材料和獨特的緩沖液系統，從凝膠中回收DNA片段，同時除去蛋白質、其它有機化合物、無機鹽離子等雜質。最簡單快速的回收方法。不適合用于大片斷的回收。82.1.2 玻璃奶/純化填料法利用特殊玻璃微珠吸附DNA的特性

3、，根據每次回收實驗時預期回收量來調整純化填料的量，使得實驗不受限于柱子的載量，也不會造成浪費。適合各種不同大小的片斷，特別是大片斷的回收。玻璃奶/純化填料法92.1.3 低熔點瓊脂糖法傳統手工操作方法之一，低熔點瓊脂糖制備凝膠，電泳后切割目的條帶，在TE溶液中65保溫融化，用傳統的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。這個方法需要用到酚氯仿等有機試劑，由于乙醇沉淀需時較長，現已較少使用。102.1.4 透析帶電洗脫法切下的條帶放在充滿TAE的透析帶中電泳，讓 DNA跑出凝膠，跑向溶液中，再通過反向電泳，將附在透析帶上的DNA趕回溶液中，取溶液部分，再用TAE洗洗袋子，合并溶液后傳統方法酚抽沉淀。再次電泳后的膠

4、通常還要再染色看看殘留。由于綁透析帶很難操作，只有在回收非常大的片斷時才會考慮的。丙烯酰胺電泳凝膠產物回收的方法之一。112.1.5 DEAE纖維素膜紙片法將DEAE纖維素膜裁成小條活化處理。電泳后在目的條帶前切一刀，將比條帶略寬的DEAE 纖維素膜插入切口，不留氣泡，繼續電泳，條帶上的DNA被膜片截留，取出膜片沖洗后轉移到離心管中加緩沖液65保溫洗脫，直到膜上DNA被完全洗脫，將溶液用酚氯仿抽提沉淀。 早期實驗室最常用方法之一。這個方法不適合做較大的DNA，因為洗脫比較困難。122.2 應用13 膠回收基礎知識一一目 錄14 試劑耗材與設備三三 操作流程四四 常見問題解答五五 方法及應用二二

5、1.試劑2.耗材3.設備3.1 試劑產品組成產品組成平衡液BL（Buffer BL）溶膠液PN（Buffer PN）漂洗液PW（Buffer PW)洗脫緩沖液EB（Buffer EB）吸附柱CA2（Spin Columns CA2）收集管（2mL）（Collection Tubes 2mL)153.2 耗材各種規格移液槍、槍頭 離心管163.3 設備離心機17 水浴鍋3.3 設備凝膠成像系統 水平電泳儀18 膠回收基礎知識一一目 錄19 試劑耗材與設備三三 操作流程四四 常見問題解答五五 方法及應用二二1.實驗流程2.注意事項4.1 實驗流程 向吸附柱CA2柱加入500L平衡液BL1 1200

6、0rpm,離心1min2 棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中3204.1 實驗流程 將目的條帶從瓊脂糖凝膠中切下1放入干凈的離心管中2 稱取重量3214.1 實驗流程向膠塊中加入等體積溶液PN1 50水浴，不斷溫和地上下翻轉離心管，確保膠塊充分溶膠。2224.1 實驗流程 將所得溶液加入 一個吸附柱CA2中，室溫放置2min1 12000rpm,離心3060sec2 棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中3234.1 實驗流程 向吸附柱CA2中加入L漂洗液PW1 12000rpm,離心3060sec2 棄廢液，將吸附 柱重新放回收集管中。重復操作1,2,33244.1 實驗流程 將吸附柱CA2放回收集

7、管中1 12000rpm,離心2min2 將吸附柱CA2置于室溫放置數分鐘，晾干3254.1 實驗流程 將吸附柱CA2放到一個干凈離心管中1 向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB，室溫放置2min2 12000rpm,離心2min收集DNA溶液326原理：帶電顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動稱為電泳。 利用帶電粒子在電場中移動速度不同而達到分離的技術稱為電泳技術。4.1 實驗流程27不同濃度大小瓊脂糖的有效分離范圍瓊脂糖濃度（）DNA有效分離范圍（Kb）0.53010.7120.81.0100.51.270.41.530.24.1 實驗流程28在錐形瓶中加入1mL 50 xT

8、AE 、49mL蒸餾水、0.4g瓊脂糖，混勻；放入微波爐中加熱，約煮沸三次，冷卻至不燙手；加入2.5LNuclleic Acid Stain核酸染料，輕輕搖勻，避免產生氣泡，倒入已垂直插好梳子的鋪膠版中，待凝固。瓊脂糖凝膠制作上樣電泳取1L上樣緩沖 液 與5 L產物混勻垂 直 加 入 上 樣孔中。電泳條件：140V，20min。4.1 實驗流程294.2 結果分析瓊脂糖凝膠電泳將電泳結束后的凝膠放在凝膠成像 系統中拍照保存。對結果進行分析：看有無目的帶看是否存在非特異帶看條帶亮度切割回收304.2 注意事項1.洗脫體積不應小于30L，體積過少影響回收效率。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。

9、若后續做測序，需使用ddH2O做洗脫液，并保證其pH值在7.08.5范圍內，pH值低于7.0會降低洗脫效率。314.2 注意事項2.平衡液BL的加入能夠改善吸附柱的吸附能力并提高吸附柱的均一性和穩定性，消除高溫/潮濕或其他不良環境因素對吸附柱造成的影響。使用前請先檢查平衡液BL是否出現渾濁，如有渾濁現象，可在37水浴中加熱幾分鐘，即可恢復澄清。324.2 注意事項3.電泳時最好使用新的電泳緩沖液，以免影響電泳和回收效果。4.如下一步實驗要求較高，則應盡量使用TAE電泳緩沖液。.如果回收率較低，可在膠充分溶解后檢測pH值，如pH值大于7.5，可向含有DNA的膠溶液中加1030L3M醋酸鈉（pH5

10、.2)將pH值調制57之間。334.2 注意事項.切膠是，紫外照射時間應盡量短，以免對DNA造成損傷。7.回收10kb的DNA片段時，應加大溶膠液的體積，延長吸附和洗脫的時間。8.回收率與初始DNA量和洗脫體積有關，初始量越少、洗脫體積越少，回收率越低。34 膠回收基礎知識一一目 錄35 試劑耗材與設備三三 操作流程四四 常見問題解答五五 方法及應用二二5 常見問題解答3636問題問題可能原因可能原因 用膠回收試劑 盒從凝膠中回 收DNA得率低 是什么原因？ 膠溶解不完全，可適當延長水浴時間和上下顛倒的次數以及增加溶膠液的比例 膠體積太大，可用槍頭搗碎，若不能充分溶解則先將其切為小塊，分多次回

11、收 紫外燈下切膠時間過長，導致DNA部分降解，應盡量把切膠時間控制 在30s以內 洗滌液使用后未及時蓋嚴瓶蓋，乙醇揮發，影響回收效率 TAE電泳緩沖液不新鮮，失去了緩沖能力，導致pH值升高，降低DNA和膜的吸 附力，應及時更換電泳緩沖液，最好使用新鮮配制的電泳緩沖液，效果更好 回收前的樣品量太少，加大點樣量 洗脫前，預先65預熱洗脫液、延長室溫靜置時間、增加洗脫次數可 以有效提高回收率30%以上5 常見問題解答37問題解決方法加入溶膠液溫浴后，液體仍很粘稠或后續步驟有堵柱子現象？膠塊溶解不充分，可再補加一些溶膠液或延長水浴時間并增加上下顛倒次數幫助溶膠膠塊體積過大，應盡量切除多余部分，并將其切

12、為小碎塊，分幾次回收水浴溫度是否達到規定溫度65，用溫度計檢測瓊脂糖凝膠塊不溶？瓊脂糖質量不好含目的片斷的凝膠在空氣中放置過久，使膠塊失水干躁，建議切膠后立即進行回收或將膠塊保存于4 或-20制膠的電泳緩沖液濃度過高或陳舊38膠回收標準實驗流程試劑耗材與設備試劑產品組成試劑產品組成平衡液BL（Buffer BL）溶膠液PN（Buffer PN）漂洗液PW（Buffer PW)洗脫緩沖液EB（Buffer EB）吸附柱CA2（Spin Columns CA2）收集管（2mL）（Collection Tubes 2mL)耗材耗材移液槍槍頭離心管設備設備凝膠成像系統離心機水浴鍋水平電泳儀39膠回收標

13、準實驗流程實驗流程 向吸附柱CA2柱加入500L平衡液BL1 12000rpm,離心1min2 棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中3 將目的條帶從瓊脂糖凝膠中切下1放入干凈的離心管中2 稱取重量340膠回收標準實驗流程實驗流程向膠塊中加入等體積溶液PN1 50水浴，不斷溫和地上下翻轉離心管，確保膠塊充分溶膠。2 將所得溶液加入 一個吸附柱CA2中，室溫放置2min1 12000rpm,離心3060sec2 棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中341膠回收標準實驗流程實驗流程 向吸附柱CA2中加入L漂洗液PW1 12000rpm,離心3060sec2 棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。重復操作1,2,33 將吸附柱CA2放回收集管中1 12000rpm,離心2min2 將吸附柱CA2置于室溫放置數分鐘，晾干342膠回收標準實驗流程實驗流程 將吸附柱CA2放到一個干凈離心管中1 向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB，室溫放置2min2 12