1、馬仕洪馬仕洪Tel: 010 - 6709 5509中國藥品生物制品檢定所中國藥品生物制品檢定所2022-3-23中國藥品生物制品檢定所2驗證實驗的幾點體會驗證實驗的幾點體會 無菌檢查法驗證實驗要點無菌檢查法驗證實驗要點 微生物限度檢查法驗證實驗要點 驗證實驗實例2022-3-23中國藥品生物制品檢定所3無菌檢查法驗證實驗要點無菌檢查法驗證實驗要點 樣品樣品 菌種和實驗用菌液菌種和實驗用菌液 標準化操作標準化操作 實驗器材實驗器材2022-3-23中國藥品生物制品檢定所4無菌檢查樣品無菌檢查樣品無菌檢查樣品無菌檢查樣品取樣量取樣量（量）（量）樣品特性樣品特性（質）（質）抗菌活性抗菌活性劑型劑型

2、檢驗數量檢驗數量檢驗量檢驗量側重驗證實驗側重驗證實驗側重無菌檢查側重無菌檢查敏感菌選擇敏感菌選擇去除抗菌活去除抗菌活性方法選擇性方法選擇前處理方法前處理方法2022-3-23中國藥品生物制品檢定所5無菌檢查樣品無菌檢查樣品 主要是取樣量的問題主要是取樣量的問題 中國藥典中國藥典20052005年版對無菌檢查的年版對無菌檢查的“檢驗數量檢驗數量”和和“檢驗量檢驗量”作了明確的作了明確的解釋和規定。解釋和規定。2022-3-23中國藥品生物制品檢定所6表表2 2中上市抽驗樣品（液體制劑）的最少檢驗量中上市抽驗樣品（液體制劑）的最少檢驗量供試品裝量供試品裝量V V(ml)(ml)每支樣品接入每管培每

3、支樣品接入每管培養基的最少樣品量養基的最少樣品量最少檢驗數量最少檢驗數量( (瓶或支瓶或支) ) 1 1 1V5 1V5 5 V20 5 V20 20 V50 20 V50 50 V100 50 V100 50 V100( 50 V500 V500全量全量半量半量2ml2ml5ml5ml10ml10ml半量半量半量半量500ml500ml2020* *101010101010101010106 66 6* * 每種培養基各接種每種培養基各接種1010支供試品支供試品2022-3-23中國藥品生物制品檢定所7 表表3 3中上市抽驗樣品（固體制劑）的最少檢驗量中上市抽驗樣品（固體制劑）的最少檢驗量

4、 供試品裝量M/支、瓶或個每支樣品接入每管培養基的最小樣品量最少檢驗數量（瓶或支） M50mg 50mgM300mg 300mgM5g/袋9g以1H3PO4溶液溶解，轉移至400ml 0.1%蛋白胨溶液，振搖，平均分配至三個濾筒，濾過鹽酸加替沙星原料5g/袋9g轉移至400ml 0.1%蛋白胨溶液，振搖，平均分配至三個濾筒，濾過注射用加替沙星0.4g/瓶12瓶轉移至400ml 0.1%蛋白胨溶液，振搖，平均分配至三個濾筒，濾過注射用加替沙星0.2g/瓶15瓶轉移至400ml 0.1%蛋白胨溶液，振搖，平均分配至三個濾筒，濾過加替沙星氯化鈉注射液100ml/袋9袋平均分配至三個濾筒，濾過加替沙星

5、氯化鈉注射液20ml/支8支平均分配至三個濾筒，濾過2022-3-23中國藥品生物制品檢定所74加替沙星無菌檢查法驗證實驗加替沙星無菌檢查法驗證實驗加替沙星原料溶解液的選擇與驗證加替沙星原料溶解液的選擇與驗證 由于加替沙星原料不易溶于水，無菌檢查前應先進行溶解。0.1mol/L鹽酸是溶解加替沙星的良好溶劑，但鹽酸是揮發性酸，滅菌時容易腐蝕不銹鋼材質的高壓鍋，所以選用1H3PO4溶液。 取500ml 1H3PO4 濾過三個濾筒，每筒加入100ml硫乙醇酸鹽流體培養基，分別加入1ml金葡球菌、枯草桿菌和銅綠假單胞菌菌液，35培養逐日觀察，24小時生長正常。2022-3-23中國藥品生物制品檢定所7

6、5加替沙星無菌檢查法驗證實驗加替沙星無菌檢查法驗證實驗沖洗方法和條件沖洗方法和條件 采用0.1蛋白胨溶液沖洗樣品濾筒，每個濾筒50ml/次，每次沖洗充分振搖，抽干，加入100ml規定培養基，通過分別接種1ml陽性菌菌液驗證沖洗的效果。 2022-3-23中國藥品生物制品檢定所76沖洗方法和條件沖洗方法和條件圖圖 分別沖洗分別沖洗800800、12001200、16001600mlml體積的體積的348348號樣品接種生孢梭菌與空白和陰性號樣品接種生孢梭菌與空白和陰性實驗相同條件培養后的生長情況比較實驗相同條件培養后的生長情況比較圖圖 與上圖同時進行的與上圖同時進行的4 4組陽性對照實驗接種生孢

7、梭菌的生長情況組陽性對照實驗接種生孢梭菌的生長情況2022-3-23中國藥品生物制品檢定所77加替沙星無菌檢查法驗證實驗加替沙星無菌檢查法驗證實驗中和劑的選擇中和劑的選擇據文獻報道，金屬離子的絡合作用，可以降低加替沙星的活性。選擇FeCl3和MnSO4進行篩選實驗。2022-3-23中國藥品生物制品檢定所78加替沙星無菌檢查法驗證實驗加替沙星無菌檢查法驗證實驗中和劑的選擇中和劑的選擇分別配制0.1mol/L的FeCl3和MnSO4溶液。0.1mol/L的FeCl3溶液在濕熱滅菌時即渾濁，故采用薄膜過濾除菌；而0.1mol/L的MnSO4溶液濕熱滅菌后澄清透明。培養基加1ml金葡球菌再加5ml

8、0.1mol/L MnSO4溶液生長良好；相同條件加5ml 0.1mol/L的FeCl3溶液5日內仍無菌生長。顯示FeCl3溶液對細菌生長有抑制作用，故選擇MnSO4溶液作為中和劑進一步驗證。2022-3-23中國藥品生物制品檢定所79加替沙星無菌檢查法驗證實驗加替沙星無菌檢查法驗證實驗中和劑的加入時機中和劑的加入時機用0.1mol/L MnSO4溶液或者0.01mol/L MnSO4溶液沖洗樣品濾筒以及把MnSO4溶液與樣品溶液混合過濾均造成液流不暢，所以，選擇以5ml 0.1mol/L MnSO4溶液直接添加到培養基中作為中和劑添加方法。2022-3-23中國藥品生物制品檢定所80加替沙星

9、無菌檢查法驗證實驗加替沙星無菌檢查法驗證實驗中和劑驗證中和劑驗證 取240號樣品，沖洗100和300ml后加入100ml培養基，在培養基中加入5ml 0.1mol/L MnSO4溶液，再加入1ml陽性菌菌液。實驗結果見下表2022-3-23中國藥品生物制品檢定所81陽性陽性菌菌沖洗體積沖洗體積1 1d d2 2d d2 2d d4 4d d5 5d d生孢生孢梭菌梭菌陽性對照陽性對照100100mlml300300mlml大腸大腸埃希埃希菌菌陽性對照陽性對照100100mlml300300mlml2022-3-23中國藥品生物制品檢定所82幾個微生物限度檢查法的驗證幾個微生物限度檢查法的驗證序

10、號序號檢品名稱檢品名稱供試液制備供試液制備細菌計數細菌計數霉菌計數霉菌計數控制菌檢查控制菌檢查1氨酚氫可酮口服液取原液10ml稀釋成1：10供試液常規法常規法常規法2醋酸可的松滴眼液取原液作為供試液簿膜過濾法,沖洗300ml簿膜過濾法,沖洗300ml簿膜過濾法,沖洗300ml3復方地塞米松乳膏取10g加十四烷酸異丙酯20ml分散均勻，加稀釋劑100ml充分振搖，靜止至分層，取下層水層部分作為供試液 簿膜過濾法,沖洗800ml簿膜過濾法,沖洗800ml簿膜過濾法,沖洗800ml4復方丹參片取10g，加100ml稀釋液，電動勻漿2000r/ min、2分鐘簿膜過濾法,沖洗400ml常規法簿膜過濾法,沖洗400ml5清開靈片取10g，加100ml稀釋液，電動勻漿2000r/ min、2分鐘簿膜過濾法,沖洗400ml常規法常規法6銀杏葉片取10g，加100ml稀釋液，電動勻漿2000r/ min、2分鐘簿膜過濾法,沖洗300ml常規法膽鹽乳糖增菌液采用500 ml稀釋培養；乳糖發酵采用40ml稀釋培養7消糖靈膠囊取10g，加100ml稀釋液，電動勻漿2000r/ min、2分鐘培養基稀釋法0.5ml/皿常規法常規法2022-3-23中國藥品生物制品檢