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文檔簡介

1、溫州醫科大學附屬第二醫院科研中心溫州醫科大學附屬第二醫院科研中心葛仁山葛仁山 2014.8.4目錄目錄一、熒光定量PCR技術的基礎理論二、引物的設計及原則三、內參基因的選擇四、定量PCR的實驗設計和數據處理五、實時定量PCR兩種相對定量方法比較六、誤差分析及操作規范七、實驗中污染的防控八、實驗結果的分析一、熒光定量PCR技術的基礎理論1 1、熒光定量、熒光定量PCRPCR技術概論技術概論 熒光定量PCR技術產生并成熟于上世紀90年代,由于該技術實現了PCR從定性到定量的飛躍,能夠對PCR反應的全過程進行實時監控,并且自動化程度高,所以該技術從產生到現在短短的十幾年時間,在科研及檢驗領域獲得了廣

2、泛的應用,成為分子生物學領域不可或缺的一項重要技術。1 1、熒光定量、熒光定量PCRPCR技術概論技術概論 熒光定量PCR技術是在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號隨著PCR反應的積累來實時監控PCR反應的進程,并通過分析軟件對PCR的反應進行檢測分析的技術。 系統組成:定量PCR儀、電腦、分析軟件、試劑及耗材。 常規常規PCRvsPCRvs實時實時PCRPCR 常規PCR:借助電泳對擴增反應的終產物進行半定量及定性分析 定量PCR技術:利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化,最終精確的對起始模板的定量分析常規常規PCRvsPCRvs實時實時PCRPCR

3、優缺點比較 定量PCR 常規PCR靈敏度高高精確度安全省時只能進行半定量或定性分析不安全易污染費時費力2 2、熒光定量、熒光定量PCRPCR常用的三個概念常用的三個概念 擴增曲線、閾值、CT值(1)、擴增曲線及擴增曲線的兩種形式 左圖反映的是隨著PCR反應的進行相應的熒光信號的變化,比較直觀,但是指數期很短;右圖反映的是熒光信號的變化量的對數與PCR反應循環數的關系,從右圖可知,指數期很明顯,在確定閾值線時具有簡單明了的特點,所以很多軟件都采用右圖的形式,當然了,這兩種實時擴增曲線可以根據實驗的需要相互轉換。2 2、熒光定量、熒光定量PCRPCR常用的三個概念常用的三個概念(2)、閾值線 在熒

4、光定量PCR擴增的指數期,畫一條線,在此直線上,所有樣品的熒光強度與其本底熒光強度的差值全部相同。2 2、熒光定量、熒光定量PCRPCR常用的三個概念常用的三個概念(3)、CT值 PCR過程中,各樣品擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時,所經過的擴增循環數。3 3、熒光定量、熒光定量PCRPCR的化學基礎的化學基礎 熒光定量PCR是隨著PCR循環的進行,以熒光信號強度的積累來實時反映PCR反應進程的。理想的熒光物質需具備以下特點: (1)、本底低(2)、熒光強度高(3)、每輪PCR反應完成后都有熒光強度的增高,而且這種熒 光強度的增高和每輪循環后PCR產物的量成線性關系(4)、沒有PCR產物時,

5、沒有熒光(5)、該熒光物質的受激發后其發射光的波長范圍窄,各種 熒光不會產生熒光的交叉干擾3 3、熒光定量、熒光定量PCRPCR的化學基礎的化學基礎目前常用的幾種熒光物質(1)、Taqman探針類5端標記熒光基團,3端標記淬滅基團,探針完整時,沒有熒光,探針斷裂后,在激發光的作用下,熒光基團產生熒光;探針本身序列與目的基因序列互補,特異性高,退火后探針與目的基因互補序列結合,隨著PCR反應的進行,在Taq酶5-3外切酶的作用下,探針水解斷裂,熒光產生。3 3、熒光定量、熒光定量PCRPCR的化學基礎的化學基礎Taqman常用的熒光基團和淬滅基團 熒光基團:5端常用熒光基團FAM標記,最佳激發光

6、波長:494-495nm,最大 發射光波長:518-520nm。淬滅基團:TAMRA、BHQ、ECLIPSE等。 TAMRA本身也是一種熒光基團,激發光波長范圍較寬,500 560nm,最佳激發光波長在560nm附近,對FAM基團產生的發射光 具有較好的吸收作用;其發射光波長較寬,560650nm,當做 多重熒光時,容易產生熒光交叉干擾,并且本底較高,故現已 不常用。 BHQ和ECLIPSE為非熒光物質,只是一種熒光淬滅劑,本身不會 產生熒光,光吸收范圍較寬,因此本底較低,作為淬滅基團較 為常用,尤其在多重熒光定量PCR時常常被采用。3 3、熒光定量、熒光定量PCRPCR的化學基礎的化學基礎T

7、aqman探針的特點及應用(1)、特異性強、準確性高 本身具有序列特異性,保證了所檢測目的基因的特異 性;其結構特點保證了其所產生的熒光強度與PCR產物 的量成正比關系,因此準確性極高。(2)、對引物及試劑要求不高,配套的普通引物就可以使 用,普通的Taq酶就能滿足實驗的要求。(3)、常被用作基因含量的精確檢測(精確度可達幾十個拷貝) 及基因表達變化的精確分析(精確度可達0.1倍的變 化)。(4)、目前價格也不是太貴,2OD 1000.00左右3 3、熒光定量、熒光定量PCRPCR的化學基礎的化學基礎(2)、熒光染料類 目前常用的熒光染料為SYBR Green、SYBR Green、 SYTO

8、9、HRM等。其共同性質為: (a)、結合于雙鏈核酸的小溝處 (b)、與雙鏈DNA結合后受激產生熒光 (c)、在變性條件下雙鏈分開,熒光消失3 3、熒光定量、熒光定量PCRPCR的化學基礎的化學基礎熒光染料的特點及應用(1)、能夠與所有的核酸雙鏈結合,受激后產生熒光,其熒光的強度與 雙鏈核酸的含量及長度成正比,因此本底較高;(2)、可做雙鏈核酸的熔解曲線分析;(3)、SYBR Green染料本身價格便宜,但是做熒光定量PCR時對引物設 計的要求很高;對Taq酶要求較高,最好是HotStar Taq酶,或者操 作時需要嚴格的冷啟動,冰上操作,否則引物二聚體及非特異性擴 增會嚴重干擾結果的準確性,

9、尤其是模板含量較低時;(4)、適合于基因含量及基因表達變化的粗略分析或初篩;(5)、在分析的基因種類很多,但是樣品量很少時,尤其適用。(6)、對PCR反應的毒性,能抑制PCR反應,降低PCR反應的效率。兩種化學試劑的比較兩種化學試劑的比較化學試劑化學試劑工作原理工作原理有否淬滅劑有否淬滅劑信號檢測階段信號檢測階段SYBR Green ISYBR Green I結合于雙鏈結合于雙鏈DNADNA的小溝中的小溝中否否延伸延伸TaqManTaqMan水解型雜交探針水解型雜交探針(5-35-3外切)外切)有有任何步驟任何步驟4 4、熒光定量、熒光定量PCRPCR的數學原理的數學原理 對于普通的PCR反應

10、來說 n Xn=X0(1E)上式中, Xn為n輪PCR循環后,目的基因PCR產物的量;n為PCR循環數;X0 為目的基因的初始模板量,E為PCR的反應效率,0E1。4 4、熒光定量、熒光定量PCRPCR的數學原理的數學原理 由于PCR反應體系中熒光物質的熒光強度與PCR產物的量成正比,所以用熒光強度來代替PCR產物的量,我們可以得到: Rn= RB+ X0(1+ E) Rsn總熒光信號強度=本底信號+分子數量單位信號強度Rn:第n個循環時的總信號RB:本底RS:單位信號強度X0:起始DNA數目E: PCR效率4 4、熒光定量、熒光定量PCRPCR的數學原理的數學原理 當循環數n等于CT值時,所

11、有樣品熒光信號強度變化量的對數全部一致,都達到了閾值。 RT= RB+ X0(1+ E) Rs lg(RT -RB) = lgX0 + CT lg(1+ E) + lg Rs CT lg(1+ E) = -lgX0 + lg(RT -RB) lg Rs 此時,PCR反應處于指數期階段,所有樣品的反應效率E穩定且近似相等; lg(RT -RB)、Rs也都相同,只有CT值和-lgX0為變量,且這兩個變量之間成一次性方程。 也就是說, 所有樣品的lgX0與到達閾值時的循環數n(Ct值)呈線性關系,根據樣品擴增達到域值的循環數即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量CT5 5、熒光定量、熒光定量PCRPC

12、R線性關系成立的條件分析線性關系成立的條件分析CT lg(1+ E) = -lgX0 + lg(RT -RB) lg Rs(1)、PCR效率相等,在PCR擴增的指數期,E穩定且為常數;(2)、RT RB 要相等;也就是說到達閾值時樣品的熒光強度與樣品的熒 光本底之差要相等;(3)、樣品的單位信號強度Rs要相等,用熒光染料做熒光基團時,Rs 就 是每條PCR產物結合熒光染料后所發出的熒光強度,此熒光強度和 PCR產物的長短有關,PCR產物越長,結合的熒光染料越多, Rs 值 越大;用探針做熒光基團時,Rs 就等于PCR反應時,Taq酶水解掉 探針,探針的發光基團所發出的熒光強度,和PCR產物的長

13、度沒有 直接關系。5 5、熒光定量、熒光定量PCRPCR線性關系成立的條件分析線性關系成立的條件分析左圖橫坐標是PCR循環次數,縱坐標是總的熒光強度Rn,改圖反映的是各個樣品隨著每輪PCR反應,其總的熒光量的實時變化;右圖橫坐標也是PCR循環次數,縱坐標是總的熒光強度與熒光本底的差值RT RB即Rn的對數,在右圖中確定閾值線,該直線上所有樣品的RT RB的對數都相同,熒光定量PCR的線性關系才會成立。5 5、熒光定量、熒光定量PCRPCR線性關系成立的條件分析線性關系成立的條件分析 LogX0與循環數呈線性關系,通過已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線,根據未知樣品Ct值,就可以在標準曲線上計

14、算出未知樣品初始模板量。6 6、雙鏈核酸的熔解曲線分析、雙鏈核酸的熔解曲線分析 使用熒光染料作為熒光基團時,由于熒光染料的特性隨著PCR反應的進行,雙鏈PCR產物呈指數增長,SYBR Green與雙鏈PCR產物結合后熒光越來越強,當PCR反應結束時,熒光強度達到最大,此時對PCR產物進行緩慢加熱,從50一直加熱到99,在此過程中PCR產物按照TM值的大小雙鏈被依次打開,熒光強度也隨著雙鏈的打開依次減弱,如下圖:6 6、雙鏈核酸的熔解曲線分析、雙鏈核酸的熔解曲線分析 對于核酸序列相同的PCR產物,其TM值也相同,而且其TM值在一個很小的溫度范圍內,在此溫度區間,其序列相同的核酸雙鏈全部打開,熒光

15、強度急劇降低,以熒光強度的變化率和溫度來作圖,則可得到如下圖: 6 6、雙鏈核酸的熔解曲線分析、雙鏈核酸的熔解曲線分析 上圖就是熔解曲線,熔解曲線反映的是一定序列長度的核酸雙鏈,在一定的離子強度下的TM值。核酸雙鏈的TM值由雙鏈核苷酸之間相連接的氫鍵決定,不同的核酸雙鏈,其TM值也不同,所以通過熔解曲線,我們能獲知雙鏈核酸的均一性、野生型和突變型雙鏈之間的堿基差異等,如果采用高分辨率熒光染料,鏈條核酸雙鏈哪怕只有一個堿基的差異,通過熔解曲線也能分析出來。 電泳是通過核酸分子量的大小和構象來分析的,熔解曲線是根據雙鏈核酸的TM值來分析的,這與瓊脂糖電泳及SSCP有異曲同工之處。7 7、mRNAm

16、RNA差異表達的相對定量分析差異表達的相對定量分析 研究基因表達的情況,我們只需搞清楚該基因在不同生理階段的變化趨勢如何就行了,而無需知道該基因的絕對量有多少。 實驗操作中,由于樣品選取時樣品的細胞個數不可能完全相同,RNA提取時得率不同、RNA反轉錄為cDNA的效率不同等客觀因素,用于定量分析的初始樣品濃度不同,這就造成了比較上的混亂,因此在進行基因表達調控研究中都會用一些看內參基因來標準化,以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。常用的內參基因是在各種生理條件下表達量恒定的基因,這些基因也常被稱為看家基因,該基因表達一般不隨外界的變化而變化,所以常被用作內參照,常用的內參基因有RPS16基因

17、、GAPDH基因、-Actin基因、18srRNA基因等。7 7、mRNAmRNA差異表達的相對定量分析差異表達的相對定量分析以上公式就是引入內參基因后相對定量分析的基本公式,并由此派生出兩種相對定量的分析方法:雙標準曲線法和Delta-delta Ct法。7 7、mRNAmRNA差異表達的相對定量分析差異表達的相對定量分析(1)、雙標準曲線法 所謂的雙標準曲線法就是對每個樣品的內參基因和目的基因都做絕對定量,求出每個樣品中內參基因和目的基因的絕對數量,然后根據相對定量的基本公式來求出目的基因的差異表達。(2)、2 -CT法 該方法的前提條件是目的基因和內參基因的擴增效率相同且都為1,在試驗開

18、始前必須分別對目的基因和內參基因作標準曲線,看兩者擴增效率的差別,假如兩者擴增效率之間的差異小于0.1,就可以用該方法分析。而且在接下來的實驗中,無需再做標準品。7 7、mRNAmRNA差異表達的相對定量分析差異表達的相對定量分析(2)、2 -CT法 該方法的前提條件是目的基因和內參基因的擴增效率相同且都為1,在試驗開始前必須分別對目的基因和內參基因作標準曲線,看兩者擴增效率的差別,假如兩者擴增效率之間的差異小于0.1,就可以用該方法分析。而且在接下來的實驗中,無需再做標準品。 該方法要求嚴格的重復,因為CT值的差異只要有很小的變化,測得的結果就會有很大的差別。 該方法特別適合于樣品量不大,但

19、是檢測的基因種類很多的情況。 二、引物設計及原則1 1、染料法引物的設計原則、染料法引物的設計原則:(1)、序列選取應在基因的保守區段,不能有堿基變異;(2)、避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續配對,避免引物 自身形成環狀發卡結構;(3)、檢測mRNA時,為避免基因組的擴增,引物設計最好能跨兩個外顯 子;(4)、引物之間的TM相差避免超過2;(5)、典型的引物18到24個核苷長;(6)、目的基因和內參基因所擴增的PCR產物長度盡量一致,不大于 300bp,這樣有利于使兩種基因PCR效率相同(7)、將設計好的引物用序列分析軟件分析其二級結構并做BLAST分析其 特異性 2 2、Taq

20、manTaqman探針及引物的設計原則探針及引物的設計原則: 在Taqman探針法中,Taq酶除了5-3聚合酶作用之外,還要5-3外切酶的活性來切斷探針鏈產生熒光,普通PCR的延伸溫度為72,此溫度為Taq酶聚合作用的最佳溫度;Taqman探針法反應中,在要求Taq酶5-3聚合酶活性的同時,還需要Taq酶5-3外切酶的活性來切斷探針鏈產生熒光,Taq酶5-3外切酶活性的最佳溫度為60,所以Taqman PCR反應的一般采用兩步法,即95變性,60復性延伸。 在Taqman探針及引物的設計過程中,引物的TM值已經確定為60左右,在每輪PCR循環的復性過程中(9560),為了確保探針先于引物與模板

21、結合,這就要求探針的TM值高于引物10左右,所以Taqman探針及引物一般都是引物TM值為60左右,探針的TM值為70左右。2 2、TaqmanTaqman探針及引物的設計原則探針及引物的設計原則:(1)、序列選取應在基因的保守區段,不能有堿基變異;(2)、檢測mRNA時,為避免基因組的擴增,引物設計最好能跨兩個外顯 子;(3)、引物TM值為60左右,探針的TM值為70左右;(4)、探針的5端應避免使用鳥嘌呤G,因為5G會有淬滅作用,而且即使 是被切割下來還會存在淬滅作用; (5)、整條探針中,堿基C的含量要明顯高于G的含量 G含量高會降低反應 效率,這時就應選擇配對的另一條鏈作為探針; (6

22、)、引物之間的TM相差避免超過2;(7)、典型的引物長度為18-24bp,探針長度為15-45bp;(8)、PCR產物長度在50-150bp之間,這樣有利于使PCR效率相同;(9)、將設計好的引物用序列分析軟件分析其二級結構并做BLAST分析其 特異性 2 2、TaqmanTaqman探針及引物的設計原則探針及引物的設計原則:探針中GC含量的差異對定量PCR反應效率的影響3 3、TaqmanTaqman探針及引物合成時注意事項探針及引物合成時注意事項(1)、引物及探針設計好之后,委托一家放心的合成公司合成;(2)、先不要急于合成探針,先引物合成,引物合成好以后,做普通 PCR,電泳檢測PCR產

23、物,看是否和設計的長度吻合,再看看非特異 性擴增情況,必要時進行PCR產物的測序驗證;(3)、確定引物沒有問題后,再將探針送交合成,這樣安排能避免很多以 外的損失;(4)、探針合成好后,先檢測一下探針的質量,250nm的探針終濃度, 25ul水,反應體系中只有水和探針,在熒光定量PCR儀上檢測, 95,2min; 95,20s,60,20s,40個cycles;看熒光本底和 熒光強度的變化情況,好的探針熒光本底較低,隨著PCR反應,熒 光強度不會變化,假如熒光強度變化的比較大,說明探針合成質量 較差,建議重新合成。4、引物設計的具體步驟及操作詳解(1 1)、在)、在PubmedPubmed中查

24、找引物基因的全序列;中查找引物基因的全序列;(2 2)、用)、用primer3.0primer3.0引物序列及大小設計;引物序列及大小設計;在網頁中搜索Primer 3將上一步中在Word中粘貼的基因序列信息,復制到Primer 3 中,如圖:(3 3)、在)、在PubmedPubmed中找引物序列中各個內含子外顯子片段構架,中找引物序列中各個內含子外顯子片段構架,確保設計的引物序列跨兩個外顯子;確保設計的引物序列跨兩個外顯子;三、內參基因的選擇1 1、理想的內參基因具有的特點、理想的內參基因具有的特點(1)、不存在假基因;(2)、高度或中度表達,排除太高或低表達(3)、穩定表達于不同類型的細

25、胞和組織(如正常細胞和癌細胞),而且其 表達量是近似的,無顯著性差別;(4)、表達水平與細胞周期以及細胞是否活化無關;(5)、其穩定的表達水平與目標基因相似;(6)、不受任何內源性或外源性因素的影響,如不受任何實驗處理措施的 影響。 理想的內參基因很少或者說不存在,因為所有基因在不同的細胞或組織中、在細胞的不同生理時期、在不同的理化等外界刺激下,其表達量都會有所差異,有時可以是幾倍、幾十倍甚至是上百倍的差異。盲目地使用一種看家基因作為內參,一方面可能使基因表達的微小差異難以發現,另一方面可能引致錯誤甚至相反的結論。2 2、常用內參基因的表達情況、常用內參基因的表達情況(1)、GAPDH GAP

26、DH mRNA在不同癌組織(包括肺癌、乳腺癌、腎細胞癌等)中的表達升高,在不同個體間、懷孕期間以及細胞周期的不同階段等變化很大,在正常的結腸上皮、人類前列腺癌的細胞周期不同階段也呈現出顯著性變化。在各種因素(例如低氧、胰島素、地塞米松、絲裂原、表皮生長因子等)刺激下,培養細胞GAPDH mRNA的表達水平也不同。(2)、-actin 當細胞向惡性轉化時,-actin mRNA的表達水平增加。(3)、Rps16等3 3、內參基因的選擇策略、內參基因的選擇策略 根據實驗的實際情況,不同組織、不同細胞、細胞的不同生理時期、不同的理化條件刺激等,查閱相關資料,選取三、四合適的內參基因,做熒光定量PCR

27、,先以CT值最小的那條基因作為內參,其他幾條內參基因與其相比,分析所得的比值,找出比值穩定的幾條基因,比值穩定說明該基因表達穩定,適合作為理想的內參。 也可用geNorm內參分析軟件來選擇合適的內參基因。 對于比較精確的實驗,最好采用兩種或兩種以上表達穩定的基因作為內參,對每種內參基因測得的基因表達變化求方差和平均值。 四、定量PCR的實驗設計和數據處理定量定量PCRPCR實驗方案實驗方案定量定量PCRPCR實驗方案實驗方案熒光染料法熒光染料法TaqmanTaqman探針法探針法雙標準曲線法雙標準曲線法雙標準曲線法雙標準曲線法定量定量PCRPCR實驗方案實驗方案(1)、染料法適合于基因含量及基

28、因表達變化的粗略分析或初篩;在分析 的基因種類很多,但是樣品量很少時,尤其適用。(2)、探針法適合常被用作基因含量的精確檢測(精確度可達幾十個拷貝) 及基因表達變化的精確分析(精確度可達0.1倍的變化)。(3)、雙標準曲線法適合樣品量大、檢測的基因種類相對較少、精度要求 較高的實驗。(4)、 2 -CT法適合檢測精度要求一般,樣品量相對較少,檢測的基 因種類相對較多的實驗。 根據實驗的實際情況,如檢測的精度要求、樣品數量、基因數量、經費情況等來選擇合適的實驗方案。絕對定量與相對定量絕對定量與相對定量 絕對定量:精確的計算初始反應的模板濃度(絕對定量:精確的計算初始反應的模板濃度(DNADNA,

29、RNARNA) 相對定量:計算初始反應模板的相對含量相對定量:計算初始反應模板的相對含量定量定量PCR-PCR-絕對定量絕對定量 標準品,標準曲線標準品,標準曲線 已知濃度的相應已知濃度的相應DNADNA模板,按不同濃度稀釋模板,按不同濃度稀釋 根據實時根據實時PCRPCR反應得到相應的反應得到相應的C(t)C(t),構建標準曲線,構建標準曲線 樣品樣品 與標準品同時進行與標準品同時進行PCRPCR反應得到未知濃度樣品的反應得到未知濃度樣品的C(t)C(t)值值unknown104103使用定量使用定量PCRPCR進行絕對定量的優勢進行絕對定量的優勢 敏感性高敏感性高檢測低拷貝數樣品:單拷貝檢

30、測低拷貝數樣品:單拷貝 大范圍拷貝數樣品同時檢測大范圍拷貝數樣品同時檢測10100 010101010 省時有效省時有效定量定量PCR-PCR-相對定量相對定量 相對定量的目的相對定量的目的 比較基因在不同情況下的表達差異(倍數關系)比較基因在不同情況下的表達差異(倍數關系) 相對定量的問題相對定量的問題 樣品材料不均一造成的差別樣品材料不均一造成的差別 內標基因內標基因 內標通常是內標通常是b-b-actinactin、GAPDHGAPDH、18SrRNA18SrRNA等看家基因(內等看家基因(內標基因的表達要相對恒定,表達不受處理因素影響)標基因的表達要相對恒定,表達不受處理因素影響) 對

31、目的基因進行均一化:去除樣本間加樣量不同帶來的對目的基因進行均一化:去除樣本間加樣量不同帶來的誤差誤差SYBR Green I法進行相對定量的問題問題:問題:SYBR Green ISYBR Green I可以與非特異性雙鏈結合可以與非特異性雙鏈結合 非特異產非特異產物信號物信號 結果不準確結果不準確解決辦法:解決辦法:引入熔鏈曲線分析引入熔鏈曲線分析熔鏈曲線分析 決定退火溫度決定退火溫度Non-specific productspecific productspecific product五、實時定量PCR兩種相對定量方法比較 相對雙標準曲線法和相對雙標準曲線法和2-c(t) 法法1.1.相

32、對標準曲線法相對標準曲線法 用目標基因和內標基因的標準品分別獲得用目標基因和內標基因的標準品分別獲得標準曲線標準曲線 處理與未處理樣品同時擴增目標基因和內標基因,獲得處理與未處理樣品同時擴增目標基因和內標基因,獲得C(t)C(t)值值 用內標基因對目標基因用內標基因對目標基因均一化均一化 處理樣本與未處理樣本目標基因處理樣本與未處理樣本目標基因C(t)C(t)值經內參基因均一化值經內參基因均一化后相除,即可得出處理樣本與未處理樣本的表達差異后相除,即可得出處理樣本與未處理樣本的表達差異適用范圍適用范圍 目標基因與內標基因擴增效率差異較大目標基因與內標基因擴增效率差異較大 擴增效率較低擴增效率較

33、低2.2-c(t) 法 公式推導公式推導 M:M:目標基因,目標基因,N N:內標基因:內標基因 X XC(t)MC(t)M=X=X0M0M* *2 2C(t)MC(t)M=A(=A(域值域值) (1) (1) X XC(t)NC(t)N=X=X0N0N* *2 2C(t)NC(t)N=A(=A(域值域值) (2) (2) 均一化均一化 (1)/(2):(1)/(2): X X0M0M/X/X0N0N=2=2 C(t)N- C(t)M C(t)N- C(t)M=2=2-C(t)-C(t) 處理處理2 2與處理與處理1 1相比:相比: (X(X0M20M2/X/X0N20N2): (X): (X

34、0M0M/X/X0N0N)= 2)= 2-C(t)2-C(t)1-C(t)2-C(t)1=2=2-C(t)-C(t) C(t)=(C(t)C(t)=(C(t)M2M2-C(t)-C(t)N2N2)-(C(t)-(C(t)M1M1-C(t)-C(t)N1N1) ) 當有多個樣品時(如時間點),各樣品均一當有多個樣品時(如時間點),各樣品均一化后都與同一時間點相比化后都與同一時間點相比一般步驟一般步驟 選選定目標基因和內標基因定目標基因和內標基因 設計一步法或兩步法設計一步法或兩步法RT-PCRRT-PCR反應反應 數據獲得及處理數據獲得及處理 目標基因目標基因C(t)C(t)值(處理,未處理)值

35、(處理,未處理) 內標基因內標基因C(t)C(t)值(處理,未處理)值(處理,未處理) 計算計算2 2-c(t)-c(t) 作圖作圖適用范圍適用范圍 當當擴增效率較高,且目標基因和內標基因擴增效率比較一擴增效率較高,且目標基因和內標基因擴增效率比較一致致 不做標準曲線,高通量檢測不做標準曲線,高通量檢測六、誤差分析及操作規范1、誤差分析(1)、實驗方案本身的誤差 熒光染料法由于染料本身的特性,不可避免的會引起誤差; 2 -CT法由于也是一種近似的算法,所以不可避免的也會引起 誤差; Taqman探針法誤差相對較小; 雙標準曲線法誤差相對較小。(2)、儀器設備引起的誤差 測量標準品核酸濃度時,分

36、光光度計的誤差,從光密度值到質量再 到摩爾量,誤差本身就很大(雙標準曲線法不一定非要測標準品的 濃度); 定量PCR儀的誤差 耗材引起的誤差,96空板封口膜透光性的差異等六、誤差分析及操作規范1 1、誤差分析、誤差分析(3)、相對定量時內參基因表達不穩定引起的誤差(4)、操作引起的誤差 樣品處理、選取、核酸提取、反轉錄、加樣,操作過程中引起的誤 差。2 2、操作規范、操作規范 熒光定量PCR是一項對操作要求很高的實驗,同時又是花費很高的一項實驗,這就要求必須最大程度的減少誤差或避免錯誤。要想達到這個目標,我們必須從樣品的選取開始到上樣檢測,每一步都要規范操作。(1)、樣品的處理及選取 處理樣品

37、時,必須確保樣品都得到了充分的處理。如測定一種藥物 到小白鼠免疫系統的影響,必須做到每次飼喂時此藥品完全被小白 鼠攝食;選取試驗樣品時,要保證選取的組織盡可能的純,不要污 染其他組織,如選取脾臟組織時,盡可能的選取脾臟,不能混有結 締組織等,樣品選取好后,即可放入液氮或超低溫冰箱保存。六、誤差分析及操作規范2 2、操作規范、操作規范(2)、核酸提取 加入液氮研磨要徹底,蛋白、多糖、多酚類物質要去除干凈,確保 得到高質量的核酸,分光光度計檢測核算質量,RNA OD260/280 2.0左右,DNA OD260/2801.8左右,最好再做電泳檢測;同一樣 品要提取2到3個RNA,所剩余的樣品不要丟

38、棄,繼續低溫保存。(3)、得到的RNA立即反轉錄為cDNA,RNA樣品最好不要存放,反轉錄所得 cDNA要用看家基因檢測。(4)、對于精度要求較高的定量PCR,最好先在樣品的所有組織類型內做 內參基因的穩定性分析,找出表達恒定基因作為內參。(5)、做定量PCR時,先把除模板外的所有試劑預混,然后分裝到PCR管 中,分裝時盡量采用排槍,加樣時盡量最好采用排槍。(6)、體系中最好摻入ROX參比熒光,消除光程差和加樣的偏差。六、誤差分析及操作規范2 2、操作規范、操作規范(7)、重復操作 讓重復操作最大的修正偏差?最有意義的重復是在提取樣品RNA時 就重復,同一個樣品,分別提取3份RNA,3份RNA都做反轉錄,所 得的3份cDNA都做定量PCR檢測,這樣的重復之所以最有意義是因 為

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