1、植物細胞培養與次級代謝產物制備Chapter 5細胞工程細胞工程plant cells culture：指在離體條件下，將分指在離體條件下，將分離的植物細胞通過繼代培養增殖獲得大量細離的植物細胞通過繼代培養增殖獲得大量細胞群體的一種技術。胞群體的一種技術。 植物細胞培養是在植物組織培養的基礎上植物細胞培養是在植物組織培養的基礎上發展起來的，是生產植物次生代謝產物的一發展起來的，是生產植物次生代謝產物的一種技術。種技術。 5.1 5.1 植物細胞培養及其特點植物細胞培養及其特點Chapter 5細胞工程細胞工程與微生物細胞相比，植物細胞：與微生物細胞相比，植物細胞： 平均直徑平均直徑 Large

2、r in 30-100 times Tend to occur in aggregates形成細胞團形成細胞團 Shear-sensitive易被剪切力損傷易被剪切力損傷 Slow growing生長慢，周期長生長慢，周期長 Easily contaminated易受微生物污染易受微生物污染 Light, oxygen, CO2 demandCharacteristics of plant cells cultureChapter 5細胞工程細胞工程Copyright 2011 Wang Weidong, All rights reserved.1、植物細胞培養基植物細胞培養基 無機鹽（大量、

3、微量）無機鹽（大量、微量） 碳源（蔗糖）碳源（蔗糖） 有機氮源（水解酪蛋白）有機氮源（水解酪蛋白） 有機酸、維生素有機酸、維生素 植物生長激素植物生長激素等等5.2 5.2 植物細胞培養技術植物細胞培養技術29Chapter 5細胞工程細胞工程2.1 Single cell separation酶解方法：纖維素酶和果膠酸酶 水解掉細胞壁愈傷組織誘導法：(常用)2、植物單細胞分離與小規模培養、植物單細胞分離與小規模培養Chapter 5細胞工程細胞工程由愈傷組織分離單細胞步驟步驟： 莖段1） 誘導產生愈傷組織；2） 愈傷組織反復繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織松散性；Chapter 5細胞工程

4、細胞工程Copyright 2011 Wang Weidong, All rights reserved.由愈傷組織分離單細胞步驟3）將愈傷組織在液體培養基中培養，建立懸浮培養物 優點：細胞團成小細胞團或單細胞；在培養基中均勻分布；有空氣交流。優點：細胞團成小細胞團或單細胞；在培養基中均勻分布；有空氣交流。懸浮振蕩培養 4）振動或酶解處理，獲得單細胞。Chapter 5細胞工程細胞工程:用一塊活躍生長用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個的愈傷組織來看護單個細胞，并使其持續分裂細胞，并使其持續分裂和增殖的培養方法。這和增殖的培養方法。這個愈傷組織塊稱為看護個愈傷組織塊稱為看護 愈傷組織。愈傷組織。

5、方法：接種于濾紙上培養方法：接種于濾紙上培養(1) Nursing culture2.2 植物單細胞小規模培養植物單細胞小規模培養注：注：離體單細胞在直接培養技術下不分裂，看護培離體單細胞在直接培養技術下不分裂，看護培養下則分裂養下則分裂 Nurse callus provides nutrition and other substances that enhances cell division.細胞工程細胞工程（在兩層細胞之間放置兩層濾紙）(2) 飼養層培養飼養層培養飼養層培養：指用飼養層培養：指用X射線等處理過的無活性或分裂很慢的細胞來飼養射線等處理過的無活性或分裂很慢的細胞來飼養需要培

6、養的植物細胞。具體方法：需要培養的植物細胞。具體方法：Chapter 5Chapter 5細胞工程細胞工程 將飼養細胞與需要培養細胞共混合于培養基中將飼養細胞與需要培養細胞共混合于培養基中培養培養將飼養細胞放于下層，培養細胞置于上層培養將飼養細胞放于下層，培養細胞置于上層培養二者細胞共培養于液體培養基中二者細胞共培養于液體培養基中（2）飼養層培養）飼養層培養（3）液體淺層靜置培養）液體淺層靜置培養 將一定密度的懸浮細胞接種在三角瓶中封口靜置將一定密度的懸浮細胞接種在三角瓶中封口靜置培養。培養。Chapter 5細胞工程細胞工程體積選擇法：體積選擇法：用大、小孔徑篩網過濾、收集單用大、小孔徑篩網

7、過濾、收集單 細細胞。胞。冷處理法冷處理法：4低溫下處理幾天使細胞同步化后，低溫下處理幾天使細胞同步化后，再添加新的培養液培養。再添加新的培養液培養。饑餓法：饑餓法：控制營養液濃度，通過饑餓使細胞達到同步控制營養液濃度，通過饑餓使細胞達到同步化，再添加營養液培養。化，再添加營養液培養。抑制法：抑制法：使用抑制劑如尿苷、使用抑制劑如尿苷、5-5-氟脫氧尿苷、秋水仙氟脫氧尿苷、秋水仙素等使細胞達到同步化。素等使細胞達到同步化。（4）細胞同步化培養）細胞同步化培養細胞系細胞系(Cell line)：是由原：是由原代培養經傳代培養純化，獲代培養經傳代培養純化，獲得的以一種細胞為主的、能在體外長期生存的

8、不得的以一種細胞為主的、能在體外長期生存的不均一的細胞群體。均一的細胞群體。細胞株細胞株(Cell strain)：是指從：是指從一個經過生物學鑒定的細一個經過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養或通過篩選的方法，由單胞系用單細胞分離培養或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群。再由原細胞株進一步分細胞增殖形成的細胞群。再由原細胞株進一步分離培養出與原株性狀不同的細胞群，亦可稱之為離培養出與原株性狀不同的細胞群，亦可稱之為亞株亞株(Substrain)。2.3 細胞系與細胞株細胞系與細胞株 細胞株工業化生產需滿足條件細胞株工業化生產需滿足條件（1）分散性好，適合大規模懸浮培養。分散性好，適合大

9、規模懸浮培養。（2）均一性好，細胞大小、生理狀態一致。均一性好，細胞大小、生理狀態一致。（3）生長速度快，培養周期短，不易染菌。）生長速度快，培養周期短，不易染菌。（4）目標產物含量高，容易分離提取。）目標產物含量高，容易分離提取。（5）細胞遺傳穩定。）細胞遺傳穩定。3.1 細胞株篩選細胞株篩選1.愈傷組織的誘導與培養：選用植物的目標化合物高產部位作為外植體誘導愈傷組織。愈傷組織形成后，進行繼代培養。2.單細胞分離：選取生長快速而疏松的愈傷組織，通過固體培養基繼代培養，挑選生長快速的細胞。3.細胞無性系的分離：轉移到液體培養基中進行懸浮培養，從中選擇分散性好、生長速度快的細胞。4.細胞株篩選：

10、檢測目標產物含量，從（3）中選擇目標產物含量高的細胞株。5.性能評價：進行較大規模培養，考察細胞生長與目標產物合成的穩定性。6.細胞株獲得：得到適合工業化生產的細胞株，保種。（1）一般步驟：）一般步驟：（2）細胞株定向富集馴化）細胞株定向富集馴化激素自養型細胞株的篩選馴化：激素自養型細胞株的篩選馴化： 將愈傷組織或分離到的細胞接種在將愈傷組織或分離到的細胞接種在不含生長素、不含生長素、分裂素的繼代培養基中進行傳代培養，挑選生長分裂素的繼代培養基中進行傳代培養，挑選生長好的細胞進行反復繼代培養馴化，可以獲得激素好的細胞進行反復繼代培養馴化，可以獲得激素自養型細胞。自養型細胞。耐受高劑量有毒物質細

11、胞株的篩選馴化：耐受高劑量有毒物質細胞株的篩選馴化： 將愈傷組織或分離到的細胞接種在將愈傷組織或分離到的細胞接種在含高濃度的乙酸鹽、含高濃度的乙酸鹽、苯甲酸鈉等可能對細胞產生毒害的化合物的培養基中反復繼代培苯甲酸鈉等可能對細胞產生毒害的化合物的培養基中反復繼代培養訓化，不斷提高這些成分含量，可以獲得耐受高劑量有毒物質養訓化，不斷提高這些成分含量，可以獲得耐受高劑量有毒物質細胞株。細胞株。（3）人工誘變篩選細胞株）人工誘變篩選細胞株懸浮培養系統：懸浮培養系統： 誘變劑處理后，根據懸浮培養系統中細胞生長較快、細誘變劑處理后，根據懸浮培養系統中細胞生長較快、細胞群體比較均勻的特點進行篩選胞群體比較均

12、勻的特點進行篩選。愈傷組織系統：愈傷組織系統：在前面篩選的基礎上，用誘變劑篩選，系統包括在前面篩選的基礎上，用誘變劑篩選，系統包括： 對愈傷組織誘變處理后，再通過選擇壓進行篩選。對愈傷組織誘變處理后，再通過選擇壓進行篩選。原生質體系統：原生質體系統： 裸露的原生體容易進行誘變和篩選。裸露的原生體容易進行誘變和篩選。繼代培養保存法：繼代培養保存法： 將懸浮培養細胞每隔將懸浮培養細胞每隔1-2周進行繼代培養保存周進行繼代培養保存。低溫保存法：低溫保存法： 5-10下培養，但每隔下培養，但每隔1010天左右更換一次培養液天左右更換一次培養液。冰凍保存法：冰凍保存法： -20 或液氮下保存。或液氮下保

13、存。3.2 細胞株保存細胞株保存Chapter 5細胞工程細胞工程Copyright 2011 Wang Weidong, All rights reserved. 懸浮培養：懸浮培養：將離體的植物細胞接種在液體培養基將離體的植物細胞接種在液體培養基中，保持良好分散狀態下的培養。中，保持良好分散狀態下的培養。 特點：特點：1）增加細胞與培養液的接觸，促進營養吸收和氣體）增加細胞與培養液的接觸，促進營養吸收和氣體的良好傳遞；的良好傳遞；2）細胞生長快，能大量提供比較均勻的細胞；）細胞生長快，能大量提供比較均勻的細胞； 3）容易實現大規模工業化培養。）容易實現大規模工業化培養。2.4 植物細胞大規

14、模懸浮培養植物細胞大規模懸浮培養 Chapter 5細胞工程細胞工程Copyright 2011 Wang Weidong, All rights reserved.Steps of cell suspension cultureChapter 5細胞工程細胞工程1延遲期延遲期3直線期直線期 延遲期：適應新培養基環境延遲期：適應新培養基環境，很少分裂；，很少分裂； 對數期：細胞開始分裂，數對數期：細胞開始分裂，數目緩慢增加；目緩慢增加； 直線期：細胞分裂旺盛，數目快直線期：細胞分裂旺盛，數目快速增加；速增加； 減緩期：細胞因營養消耗、減緩期：細胞因營養消耗、老化，分裂速度減慢；老化，分裂速度減

15、慢； 平臺期：死亡與生成細胞數平臺期：死亡與生成細胞數目平衡，凈增長為零；目平衡，凈增長為零； 衰亡期：細胞死亡速度加快衰亡期：細胞死亡速度加快，細胞自溶、死亡。，細胞自溶、死亡。Growth patterns in suspension cell culture2對數生長期對數生長期4 減緩期減緩期6 衰亡期衰亡期5 平臺期平臺期Chapter 5細胞工程細胞工程Copyright 2011 Wang Weidong, All rights reserved. 懸浮培養生物反應器要求：懸浮培養生物反應器要求： 良好的良好的O O2 2傳遞、液體流動性和低的剪切力。傳遞、液體流動性和低的剪切力

16、。 按攪拌方式分為：機械式和氣動式按攪拌方式分為：機械式和氣動式（1）機械攪拌式機械攪拌式生物反應器：生物反應器： 動力：利用攪拌器使懸液產生徑向和軸向流動；動力：利用攪拌器使懸液產生徑向和軸向流動； 擋板擋板: :將渦流由徑向改為軸向流動，增加將渦流由徑向改為軸向流動，增加O O2 2溶解。溶解。 優點：攪拌充分，供優點：攪拌充分，供O O2 2、混合效果好；、混合效果好； 缺點：剪切力對細胞損傷大。缺點：剪切力對細胞損傷大。2.4.1 植物細胞懸浮培養的生物反應器植物細胞懸浮培養的生物反應器Chapter 5細胞工程細胞工程氣升式反應器氣升式反應器優點：剪切力小對細胞損傷少，結構簡單，耗能

17、低。優點：剪切力小對細胞損傷少，結構簡單，耗能低。缺點：在低氣速和后期細胞密度高時，混合效果不良。缺點：在低氣速和后期細胞密度高時，混合效果不良。 包括：包括：（2）氣升式生物反應器氣升式生物反應器： 動力：氣量差在底部產生的壓力；動力：氣量差在底部產生的壓力； 類型類型: :內環流與外環流。特點：混合較均一內環流與外環流。特點：混合較均一（3）鼓泡式生物反應器：）鼓泡式生物反應器： 動力：底部噴出的氣體沖力，液體呈無序湍流；動力：底部噴出的氣體沖力，液體呈無序湍流；特點特點: :適合剪切力敏感的細胞；缺點：混合效率低。適合剪切力敏感的細胞；缺點：混合效率低。2.4.1 植物細胞懸浮培養的生物

18、反應器植物細胞懸浮培養的生物反應器Chapter 5細胞工程細胞工程Airlift systemsChapter 5細胞工程細胞工程2.4.2 植物細胞培養方式植物細胞培養方式（1 1）分批培養（）分批培養（Batch culture） 特點：一次性添加和收獲培養液體，期間不更換。特點：一次性添加和收獲培養液體，期間不更換。 缺點：培養后期營養不足，產率降低；缺點：培養后期營養不足，產率降低；（2 2）流加式培養：）流加式培養： 特點：間歇或連續補加一種或多種營養特點：間歇或連續補加一種或多種營養（細胞初始接種細胞初始接種的培養液體積一般為終體積的的培養液體積一般為終體積的1/21/3） ；

19、整個培養過程沒有培養液流出或細胞產品的收集整個培養過程沒有培養液流出或細胞產品的收集。Chapter 5細胞工程細胞工程Copyright 2011 Wang Weidong, All rights reserved.（3）半連續式培養半連續式培養 半連續式培養（半連續式培養（Semi-continuous culture）又稱）又稱為重復分批式培養或換液培養。在細胞增長和產為重復分批式培養或換液培養。在細胞增長和產物形成過程中，每間隔一段時間從中取出部分培物形成過程中，每間隔一段時間從中取出部分培養液或者細胞，剩余的細胞作為種子，再用新的養液或者細胞，剩余的細胞作為種子，再用新的培養液補足到

20、原有體積，使生物反應器內的總體培養液補足到原有體積，使生物反應器內的總體積不變積不變。 每次稀釋培養體積的每次稀釋培養體積的1/2-3/4，以維持細胞的指數，以維持細胞的指數生長狀態。生長狀態。Chapter 5細胞工程細胞工程（4）連續培養（）連續培養（Continuous culture）含義：含義：指在培養過程中，指在培養過程中，以一定速度不斷添加營養液，同以一定速度不斷添加營養液，同時以同樣速度排出時以同樣速度排出培養物，維持恒定體積的培養。培養物，維持恒定體積的培養。特點：特點：（1）新鮮培養基不）新鮮培養基不斷加入，保證斷加入，保證了養分的充分供應；了養分的充分供應；（2）可使細胞

21、保持在增殖）可使細胞保持在增殖旺盛的對數生長期中；旺盛的對數生長期中；（3）適于大規模工業化生產）適于大規模工業化生產加入培養基加入培養基排出培養基及其培養物排出培養基及其培養物Chapter 5細胞工程細胞工程2.5 植物細胞固定化培養植物細胞固定化培養優點：優點：（1 1）細胞生長較為緩慢，利于次級代謝產物的細胞生長較為緩慢，利于次級代謝產物的 積累。積累。 （2 2）利于保持培養液液體性質，利于傳質；利于保持培養液液體性質，利于傳質；（3 3）細胞經包埋后使所受的剪切力損傷減小細胞經包埋后使所受的剪切力損傷減小；（4 4）利于進行連續培養和生物轉化（利于進行連續培養和生物轉化（細胞生長與

22、產物合成分成細胞生長與產物合成分成兩個階段，次級代謝產物合成在生長停止后才大量合成兩個階段，次級代謝產物合成在生長停止后才大量合成）。Chapter 5細胞工程細胞工程 植物細胞固定化需要采用固定劑，是一些多糖和多聚類化合物，常用的植物細胞固定化需要采用固定劑，是一些多糖和多聚類化合物，常用的包括海藻酸鹽、瓊脂糖、卡拉膠等。包括海藻酸鹽、瓊脂糖、卡拉膠等。1、海藻酸鹽、海藻酸鹽固定化固定化在在Ca2+離子等多離子等多價陽離子的存在下價陽離子的存在下，海藻酸鹽的羧基和，海藻酸鹽的羧基和Ca2+之間以離之間以離子鍵形成不溶于水的海藻酸鈣，從子鍵形成不溶于水的海藻酸鈣，從而在細胞而在細胞表面形成凝膠

23、。表面形成凝膠。如果采用磷酸、檸檬酸、如果采用磷酸、檸檬酸、EDTA等等螯合劑處理將螯合劑處理將Ca2+離子除去，又能離子除去，又能使膠體使膠體溶解釋放出細胞。溶解釋放出細胞。無菌空氣入口無菌空氣入口玻璃瓶玻璃瓶細胞和褐藻酸鈉混合液細胞和褐藻酸鈉混合液空氣出口空氣出口形成膠體顆粒的噴射口形成膠體顆粒的噴射口隔濾板隔濾板裝有裝有CaCl2溶液溶液的燒瓶的燒瓶2.5.1 植物細胞固定化方法海藻酸鹽固定化細胞步驟海藻酸鹽固定化細胞步驟Chapter 5細胞工程細胞工程 常用方法：常用方法：（1 1）滴入法：）滴入法：將細胞懸浮液與滅菌的含將細胞懸浮液與滅菌的含NaClNaCl的卡拉膠溶液混勻，然后滴

24、的卡拉膠溶液混勻，然后滴入含中入含中KClKCl的培養基中，使其分散成小顆粒。過濾、清洗顆粒后轉入適當的的培養基中，使其分散成小顆粒。過濾、清洗顆粒后轉入適當的培養基中進行培養。培養基中進行培養。（2 2）模鑄法：）模鑄法：將細胞將細胞- -卡拉膠溶液注入柱形鑄模中形成顆粒。卡拉膠溶液注入柱形鑄模中形成顆粒。（3 3）兩相法：）兩相法：將細胞將細胞- -卡拉膠溶液與無菌豆油或石蠟油攪拌混勻，形成液滴卡拉膠溶液與無菌豆油或石蠟油攪拌混勻，形成液滴置于冰浴中不斷攪拌，凝固成均勻顆粒，再離心除去油相和大部分溶液。置于冰浴中不斷攪拌，凝固成均勻顆粒，再離心除去油相和大部分溶液。2 2、卡拉膠固定化、卡

25、拉膠固定化Chapter 5細胞工程細胞工程 瓊脂糖瓊脂糖(Agarose)固定化：固定化：（1 1）凝塊法：）凝塊法：將細胞懸浮于滅菌的瓊脂糖中，攪拌待凝結包埋細將細胞懸浮于滅菌的瓊脂糖中，攪拌待凝結包埋細胞后，將凝塊擠進無菌金屬網中，使其分散成小顆粒。清洗顆粒胞后，將凝塊擠進無菌金屬網中，使其分散成小顆粒。清洗顆粒后轉入適當的培養基中進行培養。后轉入適當的培養基中進行培養。（2 2）模鑄法：同卡拉膠法）模鑄法：同卡拉膠法（3 3）兩相法：同卡拉膠法）兩相法：同卡拉膠法 優點：與海藻酸鹽、優點：與海藻酸鹽、卡拉卡拉膠等固定化方法相比，不需要其膠等固定化方法相比，不需要其它離它離 子來保證膠的

26、穩定性。子來保證膠的穩定性。 不足：制得的顆粒較大、形狀不規則。不足：制得的顆粒較大、形狀不規則。3 3、瓊脂糖、瓊脂糖(Agarose)固定化固定化Chapter 5細胞工程細胞工程 固定化后需要測定細胞存活率大小，方法有：固定化后需要測定細胞存活率大小，方法有：（1 1）熒光染色觀察法：）熒光染色觀察法：根據活細胞對根據活細胞對FDAFDA（二乙酸熒光素）（二乙酸熒光素）黃綠色黃綠色熒光染料能被吸收，而死細胞無法吸收原理鑒定。熒光染料能被吸收，而死細胞無法吸收原理鑒定。（2 2）呼吸強度測定：）呼吸強度測定： 用氧電極法測定固定化細胞的呼吸強度判斷存活率。用氧電極法測定固定化細胞的呼吸強度

27、判斷存活率。（3 3）細胞分解和生長速率的測定：）細胞分解和生長速率的測定： 通過測定細胞的濕重或干重增加率反映細胞活性大小。通過測定細胞的濕重或干重增加率反映細胞活性大小。2.5.2 2.5.2 固定化細胞活力測定固定化細胞活力測定Chapter 5細胞工程細胞工程常用的反應系統有常用的反應系統有2 2種：種： 流化床生物反應器流化床生物反應器(Fluid-bed bioreactor)：通過通入液體或通過通入液體或氣體使固定化細胞懸浮于反應器中；氣體使固定化細胞懸浮于反應器中；優點：細胞包埋顆粒小，傳質效率高；缺點：剪切力或碰撞會優點：細胞包埋顆粒小，傳質效率高；缺點：剪切力或碰撞會破壞固

28、定化細胞。破壞固定化細胞。2.5.3 植物細胞固定化生物反應器植物細胞固定化生物反應器細胞固定在支持物（如篩網）的內部或表細胞固定在支持物（如篩網）的內部或表面，細胞固定不動，培養物流體按一定方面，細胞固定不動，培養物流體按一定方向（從下向上）從反應器中流過實現混合向（從下向上）從反應器中流過實現混合和傳質。和傳質。優點：單位體積細胞的容量大。優點：單位體積細胞的容量大。缺點：缺點：混合效率低、細胞顆粒大，易混合效率低、細胞顆粒大，易造成傳質困難；造成傳質困難；固定床顆粒或支持物固定床顆粒或支持物碎片會阻塞液體的流動；碎片會阻塞液體的流動；固定材料易固定材料易變形，阻塞篩網。變形，阻塞篩網。細

29、胞固定化生物反應器 填充床生物反應器填充床生物反應器(Pipe-conebio-filter reactor)兩相培養技術：指在細胞培養體系中加入有機溶劑（如豆油兩相培養技術：指在細胞培養體系中加入有機溶劑（如豆油、石蠟油）或吸附性的多聚化合物，而細胞在水相生長，合、石蠟油）或吸附性的多聚化合物，而細胞在水相生長，合成的次級代謝產物立即轉移到有機相，減少了對產物的反饋成的次級代謝產物立即轉移到有機相，減少了對產物的反饋抑制作用，提高了產量，再通過對有機相的不斷回收與循環抑制作用，提高了產量，再通過對有機相的不斷回收與循環利用，實現連續培養。利用，實現連續培養。要求：要求：有機相對細胞無毒，不影

30、響細胞生產與產物合成；有機相對細胞無毒，不影響細胞生產與產物合成；產物易溶于有機相中；產物易溶于有機相中； 水相與有機相易分離；水相與有機相易分離；有機相或多聚化合物不能吸附培養基營養成份。有機相或多聚化合物不能吸附培養基營養成份。2.6 植物細胞兩相培養植物細胞兩相培養植物天然產物包括初級和次級代謝產物：植物天然產物包括初級和次級代謝產物： 初級代謝產物（初級代謝產物（Primary metabolites） 是通過初級代謝是通過初級代謝產生的維持細胞生命活動必需的物質，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂產生的維持細胞生命活動必需的物質，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂類、維生素等。在不同種類的細胞中，初

31、級代謝產物的種類基本相同類、維生素等。在不同種類的細胞中，初級代謝產物的種類基本相同。任何一種初級產物的合成發生障礙都會影響細胞正常的生命活動，。任何一種初級產物的合成發生障礙都會影響細胞正常的生命活動，甚至導致死亡。甚至導致死亡。 次級代謝產物（次級代謝產物（Secondary metabolites） 是通過次級代是通過次級代謝合成的產物，大多是分子結構比較復雜的小分子化合物，例謝合成的產物，大多是分子結構比較復雜的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物堿、毒素等。由于次級代謝產物大多具如抗生素、激素、生物堿、毒素等。由于次級代謝產物大多具有生物活性，因此是植物代謝產物研究的重點。有生物活性

32、，因此是植物代謝產物研究的重點。5.3 植物細胞培養生產次級代謝產物植物細胞培養生產次級代謝產物優點：優點： 減少耕地占用，不受季節、地域限制；減少耕地占用，不受季節、地域限制； 可以排除病菌和害蟲的影響可以排除病菌和害蟲的影響( (密閉無菌操作密閉無菌操作) )；可通過選擇優良株系和優化培養條件提高代謝物產可通過選擇優良株系和優化培養條件提高代謝物產量；量；能通過改造生物合成途徑獲得新有用物質。能通過改造生物合成途徑獲得新有用物質。 由于資源短缺和需求量增加，依靠從栽培植物由于資源短缺和需求量增加，依靠從栽培植物提取天然的次級代謝產物途徑很難滿足人類需求提取天然的次級代謝產物途徑很難滿足人類

33、需求，而利用植物細胞生物反應器大量培養次生代謝，而利用植物細胞生物反應器大量培養次生代謝產物成為最有效途徑。產物成為最有效途徑。Chapter 5細胞工程細胞工程1 1、藥用代謝產物、藥用代謝產物 這是重要應用領域，包括生物堿、萜類、苷類、酮類等。這是重要應用領域，包括生物堿、萜類、苷類、酮類等。 例如，紫杉醇（例如，紫杉醇（TaxolTaxol）是從紅豆杉屬植物中分離得到的一種二）是從紅豆杉屬植物中分離得到的一種二萜烯類化合物，治療乳腺癌、肺癌、卵巢癌等的藥物。萜烯類化合物，治療乳腺癌、肺癌、卵巢癌等的藥物。通過植物細胞培養技術生產有價值的次生代謝產物通過植物細胞培養技術生產有價值的次生代謝

34、產物需求：僅美國每年就有需求：僅美國每年就有50 000名婦女患卵巢癌，名婦女患卵巢癌，每年需約每年需約24kg紫杉醇；還有約紫杉醇；還有約40 000名婦女死于乳名婦女死于乳腺癌，年需求量將增至腺癌，年需求量將增至100kg。全世界每年需要。全世界每年需要500kg紫杉醇才能滿足廣大癌癥患者需求。紫杉醇才能滿足廣大癌癥患者需求。 生產生產1 kg紫杉醇需要砍伐紫杉醇需要砍伐60年生大樹年生大樹3000-4000棵。紫杉醇在樹皮、嫩芽中含量最高。若光從樹棵。紫杉醇在樹皮、嫩芽中含量最高。若光從樹皮中提取紫杉，每年需砍伐皮中提取紫杉，每年需砍伐150-200萬棵左右的萬棵左右的大樹。大樹。2 2

35、、天然食品和食品添加劑、天然食品和食品添加劑 如胡蘿卜素、葉黃素、甜菊苷、辣椒素等，因為化學合成色素如胡蘿卜素、葉黃素、甜菊苷、辣椒素等，因為化學合成色素和甜味劑越來越受到擔心和嚴格限制。和甜味劑越來越受到擔心和嚴格限制。3 3、殺蟲劑和殺菌劑、殺蟲劑和殺菌劑 如利用萬壽菊細胞生產噻吩烷，香草生產魚藤酮殺蟲劑。如利用萬壽菊細胞生產噻吩烷，香草生產魚藤酮殺蟲劑。4 4、飼料、精細化工等產品、飼料、精細化工等產品 如用培養的槡、榆等細胞，再加入大豆粉、糖、淀粉等可充足供如用培養的槡、榆等細胞，再加入大豆粉、糖、淀粉等可充足供應蠶養殖業的飼料。應蠶養殖業的飼料。 精細化工產品種類繁多（精細化工產品種

36、類繁多（3636類），附加值高，具有功能性或最終使用類），附加值高，具有功能性或最終使用性。除上述醫藥、農藥、添加劑外，還包括染料、涂料、香精、洗滌劑、化性。除上述醫藥、農藥、添加劑外，還包括染料、涂料、香精、洗滌劑、化妝品、妝品、金屬表面處理劑、芳香消臭劑等產品。金屬表面處理劑、芳香消臭劑等產品。通過植物細胞培養技術生產有價值的次生代謝產物通過植物細胞培養技術生產有價值的次生代謝產物 聚酮途徑：聚酮類化聚酮途徑：聚酮類化合物包括抗生素、免疫合物包括抗生素、免疫抑制劑、抗腫瘤藥物等抑制劑、抗腫瘤藥物等。 莽草酸途徑：類黃酮，莽草酸途徑：類黃酮，生物堿包括喹啉類、異喹啉生物堿包括喹啉類、異喹啉類

37、、吡咯啶類、烏頭類、吲類、吡咯啶類、烏頭類、吲哚類、大環類等。哚類、大環類等。 甲瓦龍（戊二羥）酸甲瓦龍（戊二羥）酸途徑途徑：主要是萜類：主要是萜類、甾體、甾體類化合物。類化合物。3.1 植物次級代謝產物的合成途徑植物次級代謝產物的合成途徑Chapter 5細胞工程細胞工程（1）細胞株）細胞株 植物不同部位的細胞產生次生代謝產物的能力是不同的植物不同部位的細胞產生次生代謝產物的能力是不同的，所以，所以在進行植物細胞培養生產有價值的代謝產物時在進行植物細胞培養生產有價值的代謝產物時，必須弄清楚產物的合成部位必須弄清楚產物的合成部位，也就是應該考慮到不同，也就是應該考慮到不同部位來源細胞的特性。部

38、位來源細胞的特性。 篩選出篩選出穩定、高產、穩定、高產、生長速度快生長速度快的細胞株是細胞的細胞株是細胞大規模培養次生代謝產物的前提。缺乏適合的細胞株是目大規模培養次生代謝產物的前提。缺乏適合的細胞株是目前許多代謝產物無法利用細胞培養生產的主要限制之一。前許多代謝產物無法利用細胞培養生產的主要限制之一。1、細胞遺傳特性、細胞遺傳特性3.2 植物次級代謝產物合成的影響因素植物次級代謝產物合成的影響因素Chapter 5細胞工程細胞工程 次級代謝產物的生物合成涉及多基因參與（基因簇），機次級代謝產物的生物合成涉及多基因參與（基因簇），機制非常復雜，不同于蛋白質合成，影響因素非常多。制非常復雜，不同

39、于蛋白質合成，影響因素非常多。 結合目標產物進行生物合成機制研究，揭示代謝結合目標產物進行生物合成機制研究，揭示代謝途徑及誘導合成機制是細胞培養的重要生物學問途徑及誘導合成機制是細胞培養的重要生物學問題，有利于指導建立優化的培養工藝與技術。題，有利于指導建立優化的培養工藝與技術。（2 2）生物合成機制）生物合成機制植物次級代謝產物合成的影響因素植物次級代謝產物合成的影響因素Chapter 5細胞工程細胞工程 化學因素：化學因素： 主要包括培養基、前體和調節因子等。主要包括培養基、前體和調節因子等。（1）培養基：）培養基：一方面是保證植物細胞生物量的增長；另外一一方面是保證植物細胞生物量的增長；

40、另外一方面是要保證細胞能合成和積累次級代謝產物。方面是要保證細胞能合成和積累次級代謝產物。 普通的培養基一般僅能滿足第一方面的需要，對于第二普通的培養基一般僅能滿足第一方面的需要，對于第二方面的需求，必須針對具體的培養對象和目的，對培養基進行方面的需求，必須針對具體的培養對象和目的，對培養基進行優化，從而保證最大限度地優化，從而保證最大限度地積聚目標產物。積聚目標產物。2、培養條件的影響、培養條件的影響Chapter 5細胞工程細胞工程 前體前體指在生物合成反應的中間過程中某一階段前的物質，都指在生物合成反應的中間過程中某一階段前的物質，都可以說是該階段物質的前體物質。可以說是該階段物質的前體

41、物質。 如果在培養基中加入外源前體將會有助于合成該代謝產物或如果在培養基中加入外源前體將會有助于合成該代謝產物或使其產量增加。但同一前體物，在細胞不同生長時期加入，對次使其產量增加。但同一前體物，在細胞不同生長時期加入，對次級代謝產物合成所起作用也不同，甚至起抑制作用。例如見級代謝產物合成所起作用也不同，甚至起抑制作用。例如見P59P59（2 2）前體（）前體（precursor precursor ）（3 3）調節因子：是指那些通過細胞信號轉導作用于細胞次）調節因子：是指那些通過細胞信號轉導作用于細胞次生代謝相關的基因表達，改變細胞次生代謝相關酶活力，最生代謝相關的基因表達，改變細胞次生代謝相關酶活力，最終使細胞次生代謝水平發生改變的生長調節物質。生長調節終使細胞