1、實(shí)驗(yàn)九實(shí)驗(yàn)九 植物原生質(zhì)體分離及融合植物原生質(zhì)體分離及融合制作人：眼睛咪咪制作人：眼睛咪咪 學(xué)習(xí)植物原生質(zhì)體的分離及學(xué)習(xí)植物原生質(zhì)體的分離及融合的原理，掌握其操作方法。融合的原理，掌握其操作方法。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康?植物原生質(zhì)體是具有質(zhì)膜，但去掉植物原生質(zhì)體是具有質(zhì)膜，但去掉了細(xì)胞壁的植物細(xì)胞，分離的原生質(zhì)體在了細(xì)胞壁的植物細(xì)胞，分離的原生質(zhì)體在培養(yǎng)條件下具有再生新壁，進(jìn)行連續(xù)的細(xì)培養(yǎng)條件下具有再生新壁，進(jìn)行連續(xù)的細(xì)胞分裂并分化成完整植株的能力，即具胞分裂并分化成完整植株的能力，即具有細(xì)胞全能性。細(xì)胞壁的主要成份是纖維有細(xì)胞全能性。細(xì)胞壁的主要成份是纖維素和果膠質(zhì)，它們分別經(jīng)纖維素酶，果

2、膠素和果膠質(zhì)，它們分別經(jīng)纖維素酶，果膠酶處理即可分解，從而脫去細(xì)胞壁。酶處理即可分解，從而脫去細(xì)胞壁。 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 由于質(zhì)膜完全暴露，原生質(zhì)體具有攝取由于質(zhì)膜完全暴露，原生質(zhì)體具有攝取大分子大分子(如核酸如核酸)，細(xì)胞器，細(xì)胞器(如核、葉綠體如核、葉綠體)和細(xì)和細(xì)菌，病毒的能力，因此是進(jìn)行遺傳操作，基菌，病毒的能力，因此是進(jìn)行遺傳操作，基因轉(zhuǎn)移的好材料。而原生質(zhì)體融合是實(shí)現(xiàn)上因轉(zhuǎn)移的好材料。而原生質(zhì)體融合是實(shí)現(xiàn)上述目的的一個(gè)極為重要的手段。同種或異種述目的的一個(gè)極為重要的手段。同種或異種原生質(zhì)體可在聚乙二醇原生質(zhì)體可在聚乙二醇(PEG)誘導(dǎo)下產(chǎn)生異核誘導(dǎo)下產(chǎn)生異核體，實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞雜

3、交，實(shí)現(xiàn)廣泛的遺傳重組，體，實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞雜交，實(shí)現(xiàn)廣泛的遺傳重組，創(chuàng)造新的生物類型。創(chuàng)造新的生物類型。 (一)材料：植物葉片(菠菜葉片) (二)用具：倒置顯微鏡，離心機(jī)。過(guò)濾篩(100目)，漏斗，燒杯，吸管，長(zhǎng)注射 針，注射器(5-10m1)等；三、實(shí)驗(yàn)用品三、實(shí)驗(yàn)用品 1纖維素酶纖維素酶2，果膠酶，果膠酶l ，在在0.65M甘露醇甘露醇，0.05MCaCl22H20和和0.1MES中，中，PH調(diào)至調(diào)至5.6-6.0。 20.16M CaCl22H20溶液溶液(內(nèi)含內(nèi)含0.1MES)PH5.6。 322蔗糖溶液。蔗糖溶液。 430聚乙二醇聚乙二醇(PEG)溶液溶液 5高高PH高鈣洗脫液高鈣洗脫液

4、(PH=9) 0.1M CaCl22H20 0.1M梨酶醇梨酶醇 0.5ml100ml 1M Tris 60.24M CaCl22H20 (三三)試劑：試劑： (一一)原生質(zhì)體的分離收集：原生質(zhì)體的分離收集： 1.取菠菜葉片撕去下表皮，每小組稱取菠菜葉片撕去下表皮，每小組稱0.2g切成小塊放切成小塊放到到10ml酶液中，在酶液中，在26下酶解下酶解4-5小時(shí)，或酶含量減半過(guò)小時(shí)，或酶含量減半過(guò)夜，期間輕輕搖動(dòng)幾次。夜，期間輕輕搖動(dòng)幾次。 2用用100目的過(guò)濾篩過(guò)濾。目的過(guò)濾篩過(guò)濾。 3用與濾液等體積的用與濾液等體積的0.16M CaCl22H20溶液沖洗過(guò)濾篩，溶液沖洗過(guò)濾篩，使沖洗液沖入過(guò)濾

5、液。使沖洗液沖入過(guò)濾液。四、實(shí)驗(yàn)方法四、實(shí)驗(yàn)方法 4.濾液用離心機(jī)濾液用離心機(jī)100-300rpm，離心，離心5分鐘棄上清。分鐘棄上清。 5.沉淀中加入沉淀中加入0.16M CaCl22H20溶液溶液1-2ml于沉淀，于沉淀，輕搖使之懸浮，用帶長(zhǎng)針輕搖使之懸浮，用帶長(zhǎng)針頭的注射器自離心管底部頭的注射器自離心管底部輕輕地加入輕輕地加入6-8ml 22蔗糖溶液，使之形成界面。蔗糖溶液，使之形成界面。 6靜置待原生質(zhì)體形成一條帶時(shí)棄去上、下液及靜置待原生質(zhì)體形成一條帶時(shí)棄去上、下液及殘?jiān)梦芪∈占|(zhì)體。殘?jiān)梦芪∈占|(zhì)體。 7用用0.24M CaCl22H20溶液洗滌一次，離心吸

6、去溶液洗滌一次，離心吸去上清液。上清液。 8沉淀中加入沉淀中加入l-2ml O.16M CaCl22H20溶液懸溶液懸浮沉淀，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使原生質(zhì)體密度為浮沉淀，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使原生質(zhì)體密度為2105個(gè)個(gè)ml。 9取一滴于載玻片上，低倍鏡觀察原生質(zhì)體的取一滴于載玻片上，低倍鏡觀察原生質(zhì)體的純度和完整性，也可用熒光顯微鏡檢查。純度和完整性，也可用熒光顯微鏡檢查。 1取上述原生質(zhì)體液兩滴，間隔取上述原生質(zhì)體液兩滴，間隔5mm滴于滴于載玻片上，靜置載玻片上，靜置l0分鐘，使原生質(zhì)體分鐘，使原生質(zhì)體沉淀在載沉淀在載玻片上。玻片上。 2在兩滴懸液之間加在兩滴懸液之間加1滴滴30PEG液，使液，