1、中國宏基因組學第二代測序技術(shù)檢測感染病原體的臨床應用專家共識2022年3月21日背景病原學診斷始終是感染性疾病診斷中最重要的環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的病原學診斷是臨床醫(yī)師根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)做出一系列鑒別診斷，然后針對這些進行 檢 測 ， 通 常 一 項 檢 測 只 能 對 應 一 種 病 原 體 ， 而 宏 基 因 組 學 第 二 代 測 序 （ m e t a genomics next generation sequencing，mNGS）技術(shù)檢測能覆蓋更廣范圍的病原體。宏基因組測序技術(shù)（mNGS）因其覆蓋度廣、特異性好等特點越來越多地被應用于臨床感染性疾病的精準診斷，但因一直沒有相應的標準而無法在臨床

2、進行更為規(guī)范化的開展。中國宏基因組學第二代測序技術(shù)檢測感染病原體的臨床應用專家共識2020年11月15日，復旦大學附屬華山醫(yī)院張文宏教授作為通訊作者、艾靜文博士作為執(zhí)筆秘書在中華傳染病雜志發(fā)表了“中國宏基因組學第二代測序技術(shù)檢測感染病原體的臨床應用專家共識”。該共識就第二代測序技術(shù)的臨床應用范圍、樣本采集、分析解讀和診斷效能等進行了證據(jù)總結(jié)，給出27條推薦意見首次針對不同感染癥候群、不同病原體的適應范圍給出了相應的推薦意見，并在共識中多次強調(diào)質(zhì)量控制與數(shù)據(jù)量的重要性。目錄CONTENTS臨床需求與應用范圍1流程與質(zhì)量控制2結(jié)果的臨床應用建議及其臨床判讀、驗證3針對不同病原體類型的診斷效能4在成

3、本經(jīng)濟效益分析下的臨床應用推薦5第一節(jié)mNGS臨床需求與應用范圍證據(jù)強度和證據(jù)質(zhì)量的分級定義證據(jù)強度： 為強烈推薦 為推薦，但其他替代方案也可接受 為推薦強度低，尋求替代方案為從不推薦證據(jù)質(zhì)量：為證據(jù)來自隨機對照試驗為證據(jù)來自非隨機對照試驗為證據(jù)僅來自專家意見。臨床需求推薦意見1：若懷疑細菌、真菌、DNA病毒、寄生蟲、不典型病原體感染且需進行二代測序檢測時，建議采用DNA檢測；若懷疑RNA病毒感染時，則建議采用RNA法檢測（A,）:p 覆蓋范圍廣：二代測序檢測能覆蓋較大范圍的病原體，病毒、細菌、真菌、寄生蟲都能被同時檢測，不論臨床樣培養(yǎng)成功與否，只要含有可檢測到的DNA 或RNA即可。p 周期

4、短：從接收樣本至完成數(shù)據(jù)分析，二代測序的周轉(zhuǎn)時間根據(jù)測序技術(shù)、方法和生物信息學分析方法的不同而不同，已有報道為6h 至7d不等（平均48h)臨床需求推薦意見2：對于臨床疑似感染的病重、病危或免疫抑制、免疫缺陷的感染患者，建議在完善傳統(tǒng)實驗室及分子生物學檢測的同時，采集疑似感染部位的標本進行二代測序（B,）p 臨床疑難雜癥或免疫抑制患者：二代測序在感染性疾病診斷領(lǐng)域中的優(yōu)勢在于其能檢測到其他傳統(tǒng)手段無法檢測到的病原體。因此，二代測序可能在應用于臨床疑難雜癥或免疫抑制患者時有更大意義。p 排除檢測：二代測序也被報道可用于“排除”檢測，即檢測陰性有助于排除感染性疾病的診斷，但前提條件是測序覆蓋度足夠

5、高，能確保樣本中存在的病原微生物被檢測出p 病原體的耐藥基因檢測、醫(yī)院感染控制的監(jiān)測，以及社區(qū)傳染性疾病暴發(fā)的監(jiān)測：通常需要極高的覆蓋深度疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中的適用范圍推薦意見3：急性感染對于懷疑中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性感染的患者，如有條件，推薦在抽取腦脊液時同步留取2mL腦脊液標本保存于-1620冰箱。在完成常規(guī)生物化學檢查和培養(yǎng)之后，若3d內(nèi)未獲得明確的病原學依據(jù)且經(jīng)驗性抗感染治療無效，推薦對留存腦脊液標本進行二代測序檢測。若未留存標本，可重新采集標本（A,）。推薦意見4：病毒感染對于疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒感染的患者，如有條件，推薦在抽取腦脊液時同步留取2mL 腦脊液標本保存于-1620冰箱。在傳

6、統(tǒng)PCR分子檢測（包括多重探針分子PCR方法）后若未能獲得明確的病原學依據(jù)，推薦對留存腦脊液標本進行二代測序檢測。若未留存標本，可重新采集標本（A,）。推薦意見5：需隨訪病原學證據(jù)對于慢性中樞神經(jīng)感染及需要隨訪病原學證據(jù)的患者，可首選二代測序進行檢測 （A,）。疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中的適用范圍p 提高檢測率：目前，在常見病原體之外，二代測序在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中已成功檢測到多種新發(fā)及少見病原體，如羊布魯菌、星狀病毒、熱帶假絲酵母、狒狒巴拉姆希阿米巴等對于慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的患者，二代測序檢測罕見、少見病原體的能力可顯著提高患者病原學確診的概率。在一項針對結(jié)核性腦膜炎患者的隊列研究中，二代測序被

7、證實可提高患者的病原體檢出率p 病原體載量動態(tài)變化：對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染進展的臨床動態(tài)監(jiān)測，主要以臨床表現(xiàn)、腦脊液常規(guī)實驗室檢查結(jié)果和腦脊液培養(yǎng)為指在某些情況下的特異性免疫試驗如隱球菌乳膠凝集試驗，可間接監(jiān)測病原體的載量情況。由于二代測序可檢測病原體及其匹配的序列數(shù)，所以能直接并結(jié)合宿主內(nèi)標背景值半定量地顯示病原菌載量的動態(tài)變化臨床疑似血流感染中的適用范圍推薦意見6：常規(guī)檢測陰性對于懷疑血流感染的患者，如有條件，推薦在抽取血培養(yǎng)標本時同步留取2mL血標本，分離血漿后保存于-1620冰箱，血培養(yǎng)3d未報陽且經(jīng)驗性抗感染治療無效時，推薦對留存血標本進行二代測序檢測。若未留存標本，可重新采集標本（A

8、,）。 推薦意見7：繼發(fā)性血流感染對于懷疑繼發(fā)性血流感染的患者，在原發(fā)感染灶的病原學檢測陰性或因各種因素無法送檢合適標本進行檢測的情況下，可考慮將血標本的二代測序檢測作為二線檢測方法（B,）。臨床疑似血流感染中的適用范圍p 對于血流感染患者首選DNA測序：由于大部分血流感染的病原體包括細菌、真菌、寄生蟲（如瘧原蟲）、部分病毒（如皰疹病毒）均以DNA作為遺傳物質(zhì)，所以推薦將DNA二代測序作為血流感染的首選檢測方法，僅在不能排除RNA病毒感染（如腎綜合征出血熱、登革熱、病毒性肺炎等）時推薦進行RNA二代測序。p 檢測最佳時間窗起病后目前，由于缺乏抗感染治療對二代測序診斷性能影響的高等級研究，所以在

9、血流感染中二代測序檢測的最佳時間窗仍未確定。研究提示，二代測序在患者起病后1-2周的時間內(nèi)仍可保持高于培養(yǎng)的陽性率，但其仍可隨時間推移下降。在臨床疑似局灶性感染中的適用范圍推薦意見8：常規(guī)檢測陰性對于懷疑局灶感染的患者，在對局灶部位完成常規(guī)的生物化學、培養(yǎng)或PCR檢測后，若未能獲取病原學診斷結(jié)果，推薦將二代測序作為二線的首選檢測手段（B,）p 二代測序可提高皮膚軟組織感染、骨關(guān)節(jié)感染、眼內(nèi)感染、尿路感染、漿膜腔感染、其他組織感染中的病原學檢測能力p 二代測序在局灶性感染標本中的較高靈敏性，可能與局灶性感染標本中的致病病原體相對載量較高有關(guān)。p 組織感染:對創(chuàng)傷弧菌、非結(jié)核分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌

10、等均有較強的診斷價值p 眼部感染:除了對常見的病毒、細菌、真菌性眼內(nèi)炎有診斷價值以外，還對不常見的病原體如弓形蟲、棘阿米巴、風疹病毒、隱球菌等感染有較強的提示作用p 尿路感染：研究顯示其可用于耐藥細菌的檢測在臨床疑似呼吸道感染中的適用范圍推薦意見8：常規(guī)檢測陰性對于呼吸道感染患者，若3d內(nèi)未通過傳統(tǒng)實驗室檢查獲得明確的病原學依據(jù)且經(jīng)驗性抗感染治療無效，推薦留取呼吸道標本進行二代測序檢測（A,）推薦意見8：病毒性肺炎常規(guī)檢測陰性對于強烈懷疑病毒性肺炎且病情持續(xù)進展的患者，可先完善呼吸道病毒多重PCR檢測，若為陰性，再行二代測序檢測，并應同時進行核酸RNA反轉(zhuǎn)錄（A,）。p 呼吸道定植菌群和引起感

11、染的病原菌同時進行檢測：根據(jù)mNGS原理，可對包括呼吸道定植菌群和引起感染的病原菌同時進行檢測。可在24-72h內(nèi)鑒定標本中可能存在的常規(guī)方法無法鑒定的罕見病原體、病毒等。并可對多重感染進行鑒p 作為傳統(tǒng)檢測方法的補充：目前，商業(yè)化的mNGS檢測產(chǎn)品數(shù)據(jù)量大多在20M左右，靈敏度低于熒光PCR等傳統(tǒng)分子檢測方法，尚不能替代傳統(tǒng)檢測方法（除非提高數(shù)據(jù)量使其靈敏度大于傳統(tǒng)分子檢測方法），而是應作為傳統(tǒng)方法無法明確感染病原體時的補充。在臨床疑似呼吸道感染中的適用范圍p 呼吸道定植菌群和引起感染的病原菌同時進行檢測：根據(jù)mNGS原理，可對包括呼吸道定植菌群和引起感染的病原菌同時進行檢測。可在24-72

12、h內(nèi)鑒定標本中可能存在的常規(guī)方法無法鑒定的罕見病原體、病毒等。并可對多重感染進行鑒定p 作為傳統(tǒng)檢測方法的補充：目前，商業(yè)化的mNGS檢測產(chǎn)品數(shù)據(jù)量大多在20M左右，靈敏度低于熒光PCR等傳統(tǒng)分子檢測方法，尚不能替代傳統(tǒng)檢測方法（除非加大測序覆蓋度使其靈敏度大于傳統(tǒng)分子檢測方法），而是應作為傳統(tǒng)方法無法明確感染病原體時的補充。普通呼吸道感染：傳統(tǒng)方法mNGS。高度懷疑病毒性肺炎的患者：病毒多重 檢測以及培養(yǎng)mNGS(注意RNA反轉(zhuǎn)錄檢測)對于免疫抑制患者出現(xiàn)呼吸道感染或病情危重：傳統(tǒng)方法+mNGS，呼吸道標本盡量靠近病灶二代測序檢測，以盡早明確罕見病原體或混合感第二節(jié)mNGS流程與質(zhì)量控制一、

13、樣本采集推薦意見11：采集樣本送檢二代測序必須嚴格遵守無菌原則（A,）。推薦意見12：樣本應直接從患者感染部位的體液或組織中進行采集（A,）。推薦意見13：當患者存在感染表現(xiàn)但病情危重或不能耐受有創(chuàng)操作時，可考慮采集患者的血液標本送檢（B,）。一、樣本采集原則針對患者感染部位的不同，采集的樣本類型主要包括靜脈血、腦脊液、痰液、肺泡灌洗液、胸腔積液、腹水、組織、咽拭子、局灶穿刺物等多種類型 對于無菌體液，如靜脈血、腦脊液、胸腔積液、腹水等，需按照嚴格的無菌操作采集樣本，采集前對局部或周圍皮膚進行消毒處理，消毒液需與皮膚作用一定時間，待皮膚干燥后再取樣，一般收集第 管標本送檢。采集的樣本須置于無菌

14、容器內(nèi)。 對于有菌部位的樣本，如痰液、肺泡灌洗液、咽拭子等，應標明樣本的采集部位，在樣本采集過程中應盡量避免引入該部位的正常菌群，以免干擾后續(xù)檢測結(jié)果。樣本采集原則所有采集的感染部位樣本均應及時送檢。標本遠距離運輸需采用冷鏈運輸，并保證無菌原則，避免凍融環(huán)節(jié)二、樣本前處理核酸抽提及文庫建p 滅活：不同樣本類型均來源于疑似感染部位，具有潛在的感染性，在樣本處理前需進行滅活處理。p 去除人員細胞：為提高檢測結(jié)果的靈敏性，在不影響樣本中病原體含量的前提下，可通過差異離心法或過濾等選擇性地去除部分人源細胞（或人源基因組轉(zhuǎn)錄組成分）。p 核酸提取：核酸的質(zhì)量是決定二代測序成功的關(guān)鍵，因此不同實驗室應建立

15、完整的核酸檢測流程，通過測定核酸的完整性或降解程度，制訂合格樣本的標準p 文庫制備：文庫制備流程對核酸樣本有嚴格要求，需對每次提取的核酸樣本進行定量檢測，以確保核酸量滿足后續(xù)實驗要求。針對不同樣本類型對提取的核酸進行文庫制備，文庫制備流程一般包括核酸片段化、末端修復、標簽接頭連接和PCR文庫等。工程菌和環(huán)境污染微生物：全過程無菌操作：設置內(nèi)參：每批次實驗中都應包括內(nèi)參照、陰性對照品和陽性對照品三、質(zhì)量控制及生物信息分析推薦意見14：實驗室在充分保障生物安全性的前提下，應建立完整的核酸檢測流程（樣本采集，樣本前處理/核酸抽提及文庫建立，質(zhì)量控制及生物信息分析，二代測序結(jié)果的實驗室判讀）（A, ）

16、。推薦意見15：每批次實驗中都應包括內(nèi)參照、陰性對照品和陽性對照品。每批次實驗均需嚴格評估是否存在操作或環(huán)境帶來的污染。單個樣本測序數(shù)據(jù)量特異性序列片段數(shù)建議不低于2107條（即20M特異性序列），此外建議測序序列讀長不少于單端50bp（A,）。三、質(zhì)量控制及生物信息分析質(zhì)量控制體系：應包含多個質(zhì)量控制點，依次為樣本運輸溫控、提取濃度與純度、出庫濃度、文庫片段分布、下機總數(shù)據(jù)量、測序質(zhì)量（Q20、Q30比率）等，分別監(jiān)控運輸溫度、核酸提取、文庫構(gòu)建、下機數(shù)據(jù)可靠性等方面。全流程的質(zhì)量控制標準應包含但不限于如下幾項：1）內(nèi)參：每批次實驗中都應包括內(nèi)參照、陰性對照品和陽性對照品 2）數(shù)據(jù)量：在缺乏

17、有效的人源宿主去除步驟的情況下，建議單個標本測序數(shù)據(jù)量特異性序列片段數(shù)不低于2*107 條（即20M 特異性序列數(shù)）3）讀長50bp：為確保序列比對的準確性，避免因同源錯配導致的序列比對錯誤，建議測序序列單端讀長不少于50bp三、質(zhì)量控制及生物信息分析推薦意見16：對數(shù)據(jù)進行分析時，建議采用臨床應用級別的數(shù)據(jù)庫，審慎使用公共數(shù)據(jù)庫（A,）。推薦意見17：建議二代測序檢測病原體的報告應涵蓋該批次實驗中的內(nèi)參照、陰性對照品和陽性對照品結(jié)果，并記錄相關(guān)質(zhì)量控制標準，如單個樣本數(shù)據(jù)量、序列讀長，以及相關(guān)的質(zhì)控參數(shù)（A,）生物信息分析流程應有統(tǒng)一標準，以自動化為主，以人工糾錯為輔，不應帶有過多的人工判讀

18、成分。三、二代測序結(jié)果的實驗室判讀推薦 在進入分析解讀流程后應遵循以下原則：p 剔除試劑、環(huán)境、測序和生物信息分析流程中引入的假陽性病原體信息，將樣本中含有的病原體核酸信息真實地呈現(xiàn)給臨床。p 原則上報告病原體信息應準確到種（檢出序列數(shù)極少或極高相似度的病原體復合群除外），同時應包含相應的屬信息。p 建議根據(jù)病原體出現(xiàn)的頻度和臨床致病性等信息，將臨床高度關(guān)注、健康人樣本中極少出現(xiàn)的病原體核酸信息單獨呈現(xiàn)（即高度致病可能性），同時將某些部位（如呼吸道、皮膚、腸道等）的常見、低（或無）致病性病原體（定植菌等）單獨呈現(xiàn)。p 建議對報告中呈現(xiàn)的所有病原體引用權(quán)威文獻進行關(guān)鍵信息的注釋，以便臨床能快速做

19、出判斷。報告中應有適度的微生物相關(guān)信息及相關(guān)文獻幫助臨床醫(yī)師理解報告結(jié)果第三節(jié)mNGS結(jié)果的臨床應用建議及其臨床判讀、驗證二代測序結(jié)果的臨床應用建議及其臨床判讀、驗證推薦意見18：二代測序結(jié)果應在與患者臨床表現(xiàn)及實驗室檢查密切結(jié)合的前提下進行解讀和驗證（B,）。推薦意見19：對于疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血流、呼吸道感染或需排除感染性疾病的患者，根據(jù)推薦意見1至13采集合適的樣本進行二代測序，根據(jù)送檢樣本類型結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)及其他結(jié)果輔助判斷或排除診斷，同時應注意排除檢出病原體定植的情況（B,）。推薦意見20：對于二代測序結(jié)果為陰性，但根據(jù)其他輔助檢查結(jié)果（如培養(yǎng)結(jié)果）高度提示感染可能的尚不能排除感

20、染的患者，建議必要時再次取樣重復二代測序檢測（B,）。里程碑論文影響因子 70.67發(fā)表時間 2014.062014年，一名患有嚴重聯(lián)合免疫缺陷的14歲男童在4個月的時間里三次到醫(yī)療機構(gòu)就診，發(fā)燒和頭痛發(fā)展為腦積水和癲癇持續(xù)狀態(tài)，導致昏迷。通過多種抗菌藥物仍然無法改善腦積水和癲癇狀態(tài)，腦活檢在內(nèi)的診斷無法找到病因。研究者通過腦脊液（CSF）宏基因組測序檢出圣地羅西鉤端螺旋體序列，隨后通過更換使用青霉素進行治療，男童32天后痊愈出院。NGS檢測病原體：鉤端螺旋體，占比0.016%；驗證：靶向PCR和Sanger測序治療調(diào)整：改用青霉素G治療，32天出院 若二代測序結(jié)果符合患者的臨床表現(xiàn)和其他實驗

21、室檢查，推薦根據(jù)二代測序結(jié)果指導臨床決策。 若患者二代測序結(jié)果陽性且符合臨床表現(xiàn)，但缺乏除二代測序結(jié)果外的其他實驗室支持證據(jù)，應進行PCR驗證（在具有合適引物的條件下），并建議臨床進一步完善可獲得的傳統(tǒng)實驗室檢查加以驗證。 若患者二代測序結(jié)果陽性，但臨床表現(xiàn)或?qū)嶒炇覚z查結(jié)果不支持該結(jié)果，則不能僅根據(jù)二代測序結(jié)果進行診斷，而應以傳統(tǒng)實驗室檢查結(jié)果為首要臨床參考依據(jù)。 對于二代測序結(jié)果為陰性，但根據(jù)其他輔助檢查結(jié)果（如培養(yǎng)結(jié)果）高度提示感染可能的尚不能排除感染的患者，建議必要時再次取樣重復二代測序檢測。二代測序結(jié)果的臨床應用建議及其臨床判讀、驗證第四節(jié)mNGS在臨床感染性疾病中針對不同病原體類型的

22、診斷效能中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染推薦意見21：在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中，目前證據(jù)提示二代測序檢測細菌、寄生蟲、病毒的效果較好，中樞神經(jīng)系統(tǒng)真菌感染仍需更大樣本量的臨床 試驗來檢驗其檢測效能（B,）。在 項關(guān)于腦脊液的二代測序研究中，診斷率分別為0(0/36)、1.6%(2/125)、6%(4/62)、19%(3/16)和30%(3/10) 在無細胞的腦脊液上清液中只能檢測到無細胞病毒或無細胞微生物核酸，會導致較低的檢出率，提示臨床應采用腦脊液而非上清液作為二代測序標本國外一項研究顯示，與傳統(tǒng)臨床實驗室檢查結(jié)果比較，二代測序的靈敏度為73%，特異度為99%， 陽性預測值為81%，陰性預測值為99%另一項前瞻

23、性研究對腦膜炎、腦炎和（或）脊髓炎患兒中收集到的20份腦脊液陽性樣本進行二代測序檢測，與傳統(tǒng)的腦脊液微生物檢測相比，二代測序檢測診斷致病病原體的靈敏度為92%，特異度為96%。我國患兒的腦脊液測序數(shù)據(jù)顯示，55.56%的二代測序檢測結(jié)果與臨床傳統(tǒng)方法學一致，其中主要的病原體為細菌。另一項研究發(fā)現(xiàn)在疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的初治患者中，與培養(yǎng)相比，二代測序具有90%的靈敏度，其檢出率較培養(yǎng)提高了約25%。 膿毒癥患者推薦意見22：對于膿毒癥患者，推薦聯(lián)合采用傳統(tǒng)實驗室培養(yǎng)和二代測序來提高病原學的檢出率（B,）。血流感染的異質(zhì)性較大，目前尚缺乏針對血流感染者的大型二代測序診斷效能研究。現(xiàn)有的研究結(jié)果提

24、示，血液樣本二代測序與血培養(yǎng)保持了高度的一致性，是可靠的病原學檢測方法。一項中國的研究顯示，以培養(yǎng)為金標準，二代測序的靈敏度和特異度分別為72.7%和89.6% ；二代測序還表現(xiàn)出了比血培養(yǎng)更高的額外檢測效能，成為血培養(yǎng)的有力補充若以培養(yǎng)聯(lián)合二代測序、桑格法測序驗證作為金標準，則二代測序的陽性率較單用血培養(yǎng)有顯著提升（23.08%比12.82% ）另一項關(guān)于膿毒癥休克的研究中，二代測序的陽性率在起病前 周內(nèi)波動于71%左右，而血培養(yǎng)陽性率僅在起病時達33%，此后波動于10% 20%局灶膿腫或組織感染患者推薦意見23：對于局灶膿腫或組織感染患者，二代測序的總體靈敏性和特異性均較好，其中對細菌檢測的靈敏性優(yōu)于真菌（A,）已有研究證實，二代測序在包括局灶膿液、感染部位組織、感染性的體液標本中的靈敏性均優(yōu)于傳統(tǒng)實驗室檢測。在骨關(guān)節(jié)感染中，二代測序與臨床培養(yǎng)陽性標本的一致率可達83%-84.8%，在培養(yǎng)陰性的標本中可額外檢出49.3%-93%的病原體肺組織二代測序?qū)毦腥镜撵`敏度可達100%，特異度為76.5% ；對真菌感染的靈敏度為57.1%，特異度為61.5%；對細菌和真菌的陽性預測值分別為42.9%