1、關(guān)于分光光度計的使用現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第一頁，共17頁分光光度法的概念分光光度法的概念分光光度法：分光光度法：是利用物質(zhì)特有的吸收光譜，進行物質(zhì)鑒定及測定其含量的一種分析技術(shù)。也稱為吸收光譜法。是光譜分析技術(shù)中最常見的一種，應(yīng)用最多的是紫外及可見分光光度法。特點：特點：靈敏、精確、快速和簡便。應(yīng)用應(yīng)用：生物化學(xué)微量物質(zhì)定量分析測定研究中廣泛使用的方法之一，常用于糖，蛋白質(zhì)，核酸，酶等的快速定量檢測。 光譜范圍：光譜范圍：2001000nm 。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二頁，共17頁分光光度法的概念分光光度法的概念紅外分光光度計:大于760 nm的紅外光區(qū) 可見光分光光度計:400760 nm的可見光區(qū)紫外分光光

2、度計: 200400 nm的紫外光區(qū)分光光度計的分類分光光度計的分類現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三頁，共17頁722E722E可見分光光度計可見分光光度計現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四頁，共17頁722E722E可見分光光度計可見分光光度計現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五頁，共17頁分光光度計的基本結(jié)構(gòu)分光光度計的基本結(jié)構(gòu)光源光源單單色色光光器器吸收池吸收池檢測檢測 系系統(tǒng)統(tǒng)鎢絲鎢絲燈燈氫氫燈燈氘氘燈燈棱鏡棱鏡衍射光衍射光柵柵玻璃比色杯玻璃比色杯石英比色杯石英比色杯硒硒光光電電池池光光電電管管光光電電倍增管倍增管現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第六頁，共17頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第七頁，共17頁當(dāng)一束單色光透過溶液時當(dāng)一束單色光透過溶液時部分被吸收部分被吸收部分被

3、反射部分被反射部分被透過部分被透過IrIaI入射光入射光 I0出射光出射光I比色皿比色皿 吸收杯吸收杯反射光反射光 IrIa吸收光吸收光分光光度計基本原理分光光度計基本原理現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第八頁，共17頁/ I0表示光線透過溶液的程度,稱為透光度,用T表示；IgT表示溶液對光線的吸收程度，用吸光度（A）表示。即I0CIAIgT IgII0L 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第九頁，共17頁Lambert-BeerLambert-Beer定律（光吸收定律定律（光吸收定律）Lambert定律：AK1L Beer定律：AK2C Lambert-BeerLambert-Beer定律：定律：當(dāng)一束單色光垂直通過一均勻的溶液時，

4、溶液的吸光度A，與溶液的濃度C及溶液的厚度L成正比。即AKCL其中：A吸光度 K為消光常數(shù)，表示物質(zhì)對光線吸收的能力，受物質(zhì)種類和光線波長的影響 C溶液的濃度 L溶液的厚度現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十頁，共17頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十一頁，共17頁Lambert-BeerLambert-Beer定律的應(yīng)用定律的應(yīng)用1、利用標(biāo)準(zhǔn)管計算測定物的含量 用一已知濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和一個未知濃度的待測溶液同樣處理顯色，測定吸光度，根據(jù)Lambert-Beer定律得：A1=K1C1L1 A2=K2C2L2 因為 K1=K2 L1=L2 所以C2=A2A1C1現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十二頁，共17頁Lambert-BeerLambert-B

5、eer定律的應(yīng)用定律的應(yīng)用2、利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算測定物含量 先配制一系列已知濃度的測定物溶液，按要求方法處理顯色，在最大吸收波長（max）處讀取各管的吸光度，以各管吸光度A為縱坐標(biāo)，對應(yīng)濃度C為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以后進行測定時，待測樣品以相同條件在max處讀取吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得該待樣品的濃度。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十三頁，共17頁吸光度A蛋白質(zhì)濃度（g/ml ）蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（雙縮脲法：540nm）0.20.40.6.40801201600現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十四頁，共17頁722E分光光度計使用分光光度計使用基本操作：（基本操作：（示教） 通電儀器自檢（ BLA ） 預(yù)熱20min 設(shè)定波長方式設(shè)定（MOOD T（或A） 儀器調(diào)“0.000”(將遮光杯）置入光路，在T方式下按“%T”鍵， 儀器自動校正后顯示“0.000 參比液調(diào)“0.000”A 樣品測定讀取“A”。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十五頁，共17頁722E分光光度計使用分光光度計使用注意事項：注意事項：1、預(yù)熱-保證儀器準(zhǔn)確穩(wěn)定；2、比色皿的清潔-待測液潤洗、沖洗；3、比色皿配套-比色皿不能隨意；4、比色皿內(nèi)盛液體量- 2/3 ，有液體，應(yīng)用擦鏡紙拭干，以保證光路通過時不受影響；5、拿放比色皿-應(yīng)持其“毛面”，杜絕接觸光路通過的“光面”；6、溶液濃度要適當(dāng)：吸光度讀數(shù)處于0.10.