1、食品微生物檢驗技術課程目錄課程目錄一一. .認識微生物認識微生物二二. .消毒與滅菌消毒與滅菌三三. .微生物實驗室微生物實驗室四四. .食品微生物檢驗技術食品微生物檢驗技術五五. .相關標準相關標準一一 ：認識微生物：認識微生物食物、食品、食品工業食物、食品、食品工業食物食物是人體生長發育、細胞更新、調節機是人體生長發育、細胞更新、調節機能必不可少的營養物質，也是產生熱量保持體能必不可少的營養物質，也是產生熱量保持體溫、體力的能量來源。溫、體力的能量來源。食品食品經過加工制作的食物統稱為食品經過加工制作的食物統稱為食品食品工業食品工業包括農業、食品制造、市場包括農業、食品制造、市場三個方面，

2、廣義上講，食品工業是國民經三個方面，廣義上講，食品工業是國民經濟的基礎和支柱之一。是一個永不衰弱的濟的基礎和支柱之一。是一個永不衰弱的行業。行業。微生物從不知到知的過程微生物從不知到知的過程釀酒、天花，列文虎克、巴斯德、釀酒、天花，列文虎克、巴斯德、 科赫科赫 遠古人類發現，吃剩的米粥數日后變成了醇香可口的飲料人類最早發明的酒酒 天花天花是感染痘病毒引起的，是感染痘病毒引起的，無藥可治，每無藥可治，每4名天花病人當名天花病人當中便有一人死亡，而剩余的中便有一人死亡，而剩余的3人卻要留下丑陋的痘痕。人卻要留下丑陋的痘痕。 明代以后，人痘接種法盛行起明代以后，人痘接種法盛行起來。到目前為止，天花是

3、在在來。到目前為止，天花是在在世界范圍被人類消滅或控制的世界范圍被人類消滅或控制的第一個傳染病。第一個傳染病。天花病毒安東安東列文虎克列文虎克 荷蘭荷蘭格拉夫格拉夫 霍霍夫利特霍霍夫利特微生物的鼻祖微生物的鼻祖 無孔不入的微生物，何時何地不在與人們無孔不入的微生物，何時何地不在與人們打交道。打交道。甚至在我們體內到處安營扎寨，自由出甚至在我們體內到處安營扎寨，自由出入入。可是，人們不肉眼看見它們，因而幾。可是，人們不肉眼看見它們，因而幾千年來，人類竟不知道世界上還有微生物千年來，人類竟不知道世界上還有微生物這東西存在。這東西存在。 直到直到16731673年列文虎克用自制年列文虎克用自制顯微鏡

4、發現了顯微鏡發現了“小動物小動物”的微生物世界！的微生物世界！他一生當中磨制他一生當中磨制500500多多個鏡片，制造個鏡片，制造400400多多種顯微鏡，其中只有種顯微鏡，其中只有9 9種至今仍有人使用。種至今仍有人使用。雖然他活著的時候就看到人們承認了他的雖然他活著的時候就看到人們承認了他的發現，但要等到發現，但要等到100100多年以后，當人們在多年以后，當人們在用效率更高的顯微鏡重新觀察列文虎克描用效率更高的顯微鏡重新觀察列文虎克描述的述的 “小動物小動物”，并知道他們會引起人，并知道他們會引起人類嚴重疾病和產生許多有用物質時，才真類嚴重疾病和產生許多有用物質時，才真正認識到列文虎克對

5、人類認識世界所作出正認識到列文虎克對人類認識世界所作出的偉大貢獻。的偉大貢獻。法國科學家路易斯法國科學家路易斯巴斯德巴斯德(1822-1895)被后人譽為被后人譽為“微生物學之父微生物學之父”。證實發酵由微生物引起證實發酵由微生物引起免疫學免疫學預防接種預防接種鵝頸燒瓶實驗也創造了一種有效的滅鵝頸燒瓶實驗也創造了一種有效的滅菌方法菌方法巴氏滅菌法。巴氏滅菌法。 反駁微生物自然發生說反駁微生物自然發生說鵝頸燒瓶實驗鵝頸燒瓶實驗科學雖沒有國界，但科學家卻有自己的祖國德國的波恩大學 普法戰爭爆發 傳染病是人類健康的大敵。從古至今，鼠疫、傷寒、霍亂、肺結核等許多可怕的病魔奪去了人類無數的生命。人類要戰

6、勝這些疾病，首先要弄清楚致病的原因。而第一個發現傳染病是由病原細菌感染造成的人就是羅伯特科赫。 羅伯特羅伯特科赫（科赫（18431910）-德國醫學家德國醫學家羅伯特.科赫發現結核桿菌一百周年 被后人尊為細菌學鼻祖，傳染病的克星，細菌學的奠基人和開拓者被后人尊為細菌學鼻祖，傳染病的克星，細菌學的奠基人和開拓者2003年，經過全球10個國家的科學家的共同努力，終于確認了冠狀病毒是SARS的病原體。最終判定這種冠狀病毒是否真正的元兇，依靠的是100多年前德國偉大的細菌學家科赫提出的“科赫原則”。1870結婚-1873年30歲生日-1910腐敗腐敗-食品因變質而產生臭氣、刺激味和毒性物質的現象。食品

7、因變質而產生臭氣、刺激味和毒性物質的現象。變質變質凡引起食品理化性質發生改變的現象。凡引起食品理化性質發生改變的現象。防腐防腐-防止或阻止微生物生長繁殖的方法。防止或阻止微生物生長繁殖的方法。防腐劑防腐劑-能殺死微生物或抑制微生物生長的化學物質能殺死微生物或抑制微生物生長的化學物質消毒劑消毒劑-用于殺滅傳播媒介上的微生物使其達消毒或滅菌要求的制劑。用于殺滅傳播媒介上的微生物使其達消毒或滅菌要求的制劑。 滅菌劑滅菌劑 - -可殺滅一切微生物可殺滅一切微生物( (包括細菌芽孢包括細菌芽孢) )使其達到滅菌要求的制劑。使其達到滅菌要求的制劑。無菌無菌-不含有活的微生物的意思不含有活的微生物的意思。商

8、業無菌商業無菌-殺滅在正常的商品管理條件下的貯運銷售期間有礙人類健康的細菌。殺滅在正常的商品管理條件下的貯運銷售期間有礙人類健康的細菌。無菌技術（無菌操作）：防止微生物進入機體或物體的方法。無菌技術（無菌操作）：防止微生物進入機體或物體的方法。術語術語概論概論 微生物概念：微生物是一個通稱，微生物概念：微生物是一個通稱， 形體微小，結構簡單的低等生物。形體微小，結構簡單的低等生物。 微生物類別：包括細菌、霉菌、酵母菌、微生物類別：包括細菌、霉菌、酵母菌、支原體、衣原體、立克次氏體、微藻及原支原體、衣原體、立克次氏體、微藻及原生動物類等。生動物類等。 細菌細菌 單細胞原核生物：光學顯微鏡（油鏡）

9、下放大一單細胞原核生物：光學顯微鏡（油鏡）下放大一千倍以上并染色才能清楚看見其個體。如人體腸千倍以上并染色才能清楚看見其個體。如人體腸道內的大腸桿菌、糞鏈球菌，用于釀醋的醋酸桿道內的大腸桿菌、糞鏈球菌，用于釀醋的醋酸桿菌，使牛奶變酸的乳酸桿菌，生產味精的谷氨酸菌，使牛奶變酸的乳酸桿菌，生產味精的谷氨酸短桿菌，生產淀粉酶的枯草桿菌等。短桿菌，生產淀粉酶的枯草桿菌等。 細胞壁細胞壁主要成分是肽聚糖，功能包括：保持細胞外形；抑制機械和滲透損傷；介導細胞間相互作用；防止大分子入侵；協助細胞運動和分裂。細胞膜細胞膜主要成分是磷脂，蛋白質糖脂組成。功能包括：使細胞維持穩定代謝的胞內環境，調節和選擇物質進出

10、細胞。細胞質細胞質主要成分是可溶性酶、糖、無機鹽和水等。功能包括：進行新陳代謝的主要場所，絕大多數的化學反應都在細胞質中進行。同時它對細胞核也有調控作用。 細胞核細胞核含有DNA是細胞的控制中心，在細胞的代謝、生長、分化中起著重要作用。功能：控制細胞的遺傳，生長和發育。莢膜莢膜是某些細菌在細胞壁外包圍的一層粘液性物質，一般由糖和多肽組成。功能：抗吞噬作用粘附作用抗有害物質的損傷作用抗干燥作用等鞭毛鞭毛在某些細菌菌體上具有細長而彎曲的絲狀物，是細菌的運動器官。霉菌霉菌 真核生物，單細胞或多細胞絲狀真菌真核生物，單細胞或多細胞絲狀真菌 可用低倍或高倍鏡觀察其形態。如釀制小曲酒的可用低倍或高倍鏡觀察

11、其形態。如釀制小曲酒的根霉、制豆腐乳的毛霉、生產葡萄糖的曲霉菌、根霉、制豆腐乳的毛霉、生產葡萄糖的曲霉菌、生產青霉素的青霉等。生產青霉素的青霉等。 。酵母菌酵母菌 單細胞真菌，最低等的真核生物。一單細胞真菌，最低等的真核生物。一般用高倍鏡（般用高倍鏡（401600倍）觀察其個倍）觀察其個體細胞形態。如面包酵母、釀酒酵母、體細胞形態。如面包酵母、釀酒酵母、紅酵母等。紅酵母等。 支原體、衣原體、立克次氏體支原體、衣原體、立克次氏體 單細胞，介于細菌與病毒之間的一類原始而小型的原核微生物。單細胞，介于細菌與病毒之間的一類原始而小型的原核微生物。 衣原體模型衣原體模型微細藻類微細藻類單細胞藻類：如紅藻

12、、綠藻、小球藻等單細胞藻類：如紅藻、綠藻、小球藻等。 原生動物原生動物 單細胞，無真正細胞壁。單細胞，無真正細胞壁。 如變形蟲、吸管蟲、草履蟲等。如變形蟲、吸管蟲、草履蟲等。 種類多種類多- -到目前為止，人們已認識的微生物已有到目前為止，人們已認識的微生物已有1010多萬種。多萬種。 分布廣分布廣- -微生物因其形體微小，重量輕，故可以隨著風和水流到微生物因其形體微小，重量輕，故可以隨著風和水流到處傳播。處傳播。 繁殖快繁殖快- -微生物驚人的生長繁殖速度是其他任何生物都望塵莫及微生物驚人的生長繁殖速度是其他任何生物都望塵莫及的。一般細菌的世代時間為幾十分鐘到一百多分鐘。在最適宜的的。一般細

13、菌的世代時間為幾十分鐘到一百多分鐘。在最適宜的條件下，人們最熟悉的大腸桿菌每條件下，人們最熟悉的大腸桿菌每131320min20min就可分裂出新的一就可分裂出新的一代。代。 代謝強代謝強- -微生物的代謝強度比起高等生物要高出幾百到幾萬倍，主要微生物的代謝強度比起高等生物要高出幾百到幾萬倍，主要表現在吸收多轉化快。表現在吸收多轉化快。 易變異易變異- -微生物結構簡單微生物結構簡單, ,因而在受到外界物理或化學因素影因而在受到外界物理或化學因素影響后，很容易引起細胞內的遺傳物質發生突變，結果導致變異。響后，很容易引起細胞內的遺傳物質發生突變，結果導致變異。另一個原因是細胞增殖速度快。另一個原

14、因是細胞增殖速度快。微生物的特性微生物的特性來自來自土壤土壤 水水 空氣空氣 人體人體食品中微生物來源食品中微生物來源來自來自-土壤土壤 土壤是微生物的天然培養基，它具備微生物正常發育所必須的土壤是微生物的天然培養基，它具備微生物正常發育所必須的一切條件。含有大量的微生物，細菌來自天然生活在土壤中的一切條件。含有大量的微生物，細菌來自天然生活在土壤中的自養菌和腐物寄生菌以及隨動物排泄物及其尸體進入土壤的細自養菌和腐物寄生菌以及隨動物排泄物及其尸體進入土壤的細菌。菌。來自來自-水水 水也是微生物存在的天然環境，水中的細菌來自土壤、塵埃、水也是微生物存在的天然環境，水中的細菌來自土壤、塵埃、污水、

15、人畜排泄物及垃圾等。污水、人畜排泄物及垃圾等。來自來自-空氣空氣 在冬春季節，更容易發生感冒等傳染病，就是因為空氣的在冬春季節，更容易發生感冒等傳染病，就是因為空氣的傳播。傳播。來自來自-人體人體 人自出生后，外界的微生物就逐漸進入人體。在正常人體皮膚、粘人自出生后，外界的微生物就逐漸進入人體。在正常人體皮膚、粘膜及外界相通的各種通道（如口腔、鼻咽腔、腸道和泌尿道）等部膜及外界相通的各種通道（如口腔、鼻咽腔、腸道和泌尿道）等部位，都存在著微生物群。位，都存在著微生物群。微生物引起食品腐敗變質微生物引起食品腐敗變質 食品中含有蛋白質，脂肪，碳水化合物，這些成份是微生物的生長食品中含有蛋白質，脂肪

16、，碳水化合物，這些成份是微生物的生長基質，所以微生物在食品中能夠生長繁殖。環境中無處不存在微生基質，所以微生物在食品中能夠生長繁殖。環境中無處不存在微生物，食物在生產、加工、運輸、儲存、銷售過程中，很容易被微生物，食物在生產、加工、運輸、儲存、銷售過程中，很容易被微生物污染。只要溫度適宜，微生物就會生長繁殖，分解食物中的營養物污染。只要溫度適宜，微生物就會生長繁殖，分解食物中的營養素。這時食物中的蛋白質就被破壞了，食物會發出臭味和酸味，顏素。這時食物中的蛋白質就被破壞了，食物會發出臭味和酸味，顏色也會發生變化從而造成食品變質。色也會發生變化從而造成食品變質。乳及乳制品的營養成分比較完全，都含有

17、豐富的蛋白質、極易吸收的乳及乳制品的營養成分比較完全，都含有豐富的蛋白質、極易吸收的鈣等。因此極易為微生物所腐敗變質。鈣等。因此極易為微生物所腐敗變質。二：消毒和滅菌二：消毒和滅菌概念概念 消毒消毒 -殺滅或清除傳播媒介上病原微生物殺滅或清除傳播媒介上病原微生物,使其達到無害化的使其達到無害化的FF。 滅菌滅菌 -用物理和化學方法殺滅或清除傳播用物理和化學方法殺滅或清除傳播媒介上一切微生物的方法。媒介上一切微生物的方法。溫度溫度 利用溫度進行滅菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高溫可使微生物細胞利用溫度進行滅菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高溫可使微生物細胞內的蛋白質和酶

18、類發生變性而失活，從而起滅菌作用內的蛋白質和酶類發生變性而失活，從而起滅菌作用. .低溫通常起抑菌作用。低溫通常起抑菌作用。 嗜冷微生物適合于嗜冷微生物適合于1010生活的細菌，最適生長溫度在生活的細菌，最適生長溫度在2020左右。左右。 嗜溫微生物生長溫度在嗜溫微生物生長溫度在15154545之間，最適生長溫度在之間，最適生長溫度在3737左右的細菌。左右的細菌。 嗜熱微生物生長溫度在嗜熱微生物生長溫度在30307575之間，最適生長溫度在之間，最適生長溫度在5555，在，在100100以上溫度生長，稱以上溫度生長，稱為嗜高熱微生物。為嗜高熱微生物。微 生 物 熱 死溫 度 ( )時 間時

19、間 ( 分 )金 黃 色 葡 萄 球 菌6 37大 腸 桿 菌6 05 3 0沙 門 氏 菌6 05酵 母 菌5 0 6 01 0 1 5霉 菌6 05 1 0消毒與滅菌方法消毒與滅菌方法 一、干熱滅菌法一、干熱滅菌法 1.火焰滅菌（酒精燈）火焰滅菌（酒精燈） 2.干熱滅菌（電熱干燥箱）干熱滅菌（電熱干燥箱） 二、濕熱滅菌法二、濕熱滅菌法 1.巴氏消毒巴氏消毒 2.煮沸消毒煮沸消毒 3.間歇滅菌法間歇滅菌法 4.加熱蒸汽滅菌法（高壓滅菌鍋）加熱蒸汽滅菌法（高壓滅菌鍋） 三、輻射三、輻射 四、過濾四、過濾 五、化學方法五、化學方法干熱滅菌法干熱滅菌法a.a.灼燒滅菌法：灼燒滅菌法：利用火焰直接把

20、微生物燒死。此法徹底可靠，滅菌迅速，但易焚毀物品，所以使用范圍有限，只適合于接種針、環、試管口及不能用的污染物品或實驗動物的尸體等的滅菌。b.b.干熱空氣滅菌法：干熱空氣滅菌法：這是實驗室中常用的一種方法，即把待滅菌的物品均勻地放入烘箱中，升溫至160C，恒溫1小時即可。此法適用于玻璃皿、金屬用具等的滅菌。濕熱滅菌法濕熱滅菌法在同樣的溫度下，濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好a.巴氏消毒法：有些食物因高溫破壞營養成分，如牛奶、醬油、啤酒等，只能用較低的溫度來殺死其中的病原微生物，這樣既保持營養和風味，又進行消毒。該法一般在62C，30分鐘既可達到消毒目的。b.煮沸消毒法：直接將要消毒的物品放入清水中，

21、煮沸15分鐘，即可殺死細菌的全部營養和部分芽孢。c.間歇滅菌法：上述兩種方法在常壓下，只能起到消毒作用，而很難做到完全無菌。若采用間歇滅菌的方法，就能殺滅物品中所有的微生物。具體做法是：將物品加熱至100C，1530分鐘。然后冷卻，放入37恒溫箱中過夜，讓殘留的芽孢萌發成營養體。第2天再重復上述步驟，三次左右，就可達到滅菌的目的。 d. 加壓蒸汽滅菌法：在蒸汽壓達到1.055公斤時，加壓蒸汽滅菌鍋內的溫度可達到121C。在這種情況下，微生物（包括芽孢）在15-20分鐘便會被殺死，而達到滅菌目的。 輻射及過濾輻射及過濾輻射輻射：利用輻射進行滅菌消毒，可以避免高溫滅菌或化學藥劑消毒的缺點，所以應用

22、越來越廣，目前主要應用在以下幾個方面：）接種室、手術室、食品、藥物包裝室常應用紫外線殺菌。）應用射線作食品表面殺菌，射線用于食品內部殺菌。過濾：過濾：采用機械方法，設計一種濾孔比細菌還小的篩子，做成各種過濾器。通過過濾，從而達到除菌的目的。但是比細菌還小的病毒仍然能留在液體培養基內。超高溫殺菌：超高溫殺菌： 135-150C和2-8s對液態食品進行。可保持食品價值和營養成分。化學方法化學方法一般化學藥劑無法殺死所有的微生物，而只能殺死其中的病原一般化學藥劑無法殺死所有的微生物，而只能殺死其中的病原微生物，所以是起消毒劑的作用，而不是滅菌劑。微生物，所以是起消毒劑的作用，而不是滅菌劑。一種化學藥

23、物是殺菌還是抑菌，常不易嚴格區分。消毒劑在低濃一種化學藥物是殺菌還是抑菌，常不易嚴格區分。消毒劑在低濃度時也能殺菌。由于消毒防腐劑不僅能殺死或抑制病原微生物，度時也能殺菌。由于消毒防腐劑不僅能殺死或抑制病原微生物，而且對人體組織細胞也有損傷作用，所以只能用于體表、器械、而且對人體組織細胞也有損傷作用，所以只能用于體表、器械、排泄物和環境的消毒。常用的化學消毒劑有：石碳酸、來蘇水排泄物和環境的消毒。常用的化學消毒劑有：石碳酸、來蘇水（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。 三：食品微生物實驗室三：食品微生物實驗室 生物實驗室級別生物實驗室級別 管理制度管理制度 建

24、設布局建設布局 常用儀器及用途常用儀器及用途生物安全水平分級生物安全水平分級 生物安全防護水平（biosafety level，BSL）分為4級，以表示實驗室的相應生物安全防護水平。 BSL1：防護水平最低,普通建筑物即可，每個實驗室應設洗手池。 BSL-2：實驗室的門有可視窗。在實驗室工作區域外還應當有供長期使用的存儲空間。在實驗室內使用專門的工作服；應戴乳膠手套。配備高壓蒸汽滅菌器，在實驗室內配備生物安全柜。BSL-2生物安全水平分級生物安全水平分級 BSL3實驗室實驗室：自成隔離區（有出入控制）或為獨立建筑物。 BSL4 防護水平最高。實驗室應建造在獨立的建筑物內或建筑物中獨立的完全隔離

25、區域內，該建筑物應遠離城區。 實驗室管理制度實驗室管理制度 1 1實驗室應制定儀器配備管理使用制度，藥品管理使用制度，玻璃器皿實驗室應制定儀器配備管理使用制度，藥品管理使用制度，玻璃器皿管理使用制度，并根據安全制度和環境條件的要求，本室工作人員應嚴格掌握，管理使用制度，并根據安全制度和環境條件的要求，本室工作人員應嚴格掌握，認真執行。認真執行。2 2進入實驗室必須穿工作服，進入無菌室換無菌衣、帽、鞋，戴好口罩，進入實驗室必須穿工作服，進入無菌室換無菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非實驗室人員不得進入實驗室，嚴格執行安全操作規程。非實驗室人員不得進入實驗室，嚴格執行安全操作規程。3 3實驗室內物品擺放整

26、齊，試劑定期檢查并有明晰標簽，儀器定期檢查、保養、檢實驗室內物品擺放整齊，試劑定期檢查并有明晰標簽，儀器定期檢查、保養、檢修修, , 嚴禁在冰箱內存放和加工私人食品。嚴禁在冰箱內存放和加工私人食品。4 4各種器材應建立請領消耗記錄，貴重儀器有使用記錄，破損遺失應填各種器材應建立請領消耗記錄，貴重儀器有使用記錄，破損遺失應填寫報告；藥品、器材、菌種不經批準不得擅自外借和轉讓，更不得私自拿出。寫報告；藥品、器材、菌種不經批準不得擅自外借和轉讓，更不得私自拿出。5 5禁止在實驗室內吸煙、進餐、會客、喧嘩，實驗室內不得帶入私人物品，禁止在實驗室內吸煙、進餐、會客、喧嘩，實驗室內不得帶入私人物品，離開實

27、驗室前認真檢查水、電、暖氣、門窗，對于有毒、有害、易燃、污染、腐蝕離開實驗室前認真檢查水、電、暖氣、門窗，對于有毒、有害、易燃、污染、腐蝕的物品和廢棄物品應按有關要求執行。的物品和廢棄物品應按有關要求執行。檢驗室建設布局圖檢驗室建設布局圖 1.辦公臺 2.文件柜 3.樣品柜 4.通風櫥 5.實驗邊臺 6，7.無菌臺 8.天平臺9.在落地儀器區再加個高溫儀器臺，放高壓滅菌鍋、干燥箱、水浴鍋、電熱板等無菌室建設無菌室建設 檢驗環境要求檢驗環境要求 微生物學檢驗室要求操作區域與辦公區域微生物學檢驗室要求操作區域與辦公區域分開。分開。 洗滌室、培養室、消毒間、無菌室應分開。洗滌室、培養室、消毒間、無菌

28、室應分開。 無菌室要設有套間或緩沖間，最好設推拉無菌室要設有套間或緩沖間，最好設推拉門，以防空氣振蕩過大。門，以防空氣振蕩過大。 微生物檢驗室應備有自動或腳踩式洗手池微生物檢驗室應備有自動或腳踩式洗手池和固定的消毒設施。和固定的消毒設施。 食品微生物實驗室食品微生物實驗室 常用儀器及用途常用儀器及用途潔凈工作臺（超凈工作臺、無菌臺）潔凈工作臺（超凈工作臺、無菌臺）是一種供人操作的通用型局部凈化設備，通是一種供人操作的通用型局部凈化設備，通過風機將空氣吸入，經由靜壓箱通過高效過過風機將空氣吸入，經由靜壓箱通過高效過濾器過濾，將過濾后的潔凈空氣以垂直或水濾器過濾，將過濾后的潔凈空氣以垂直或水平氣流

29、的狀態送出，使操作區域持續在潔凈平氣流的狀態送出，使操作區域持續在潔凈空氣的控制下達到百級潔凈度它可造就局部空氣的控制下達到百級潔凈度它可造就局部高清潔度空氣環境。高清潔度空氣環境。生物安全柜生物安全柜是為操作原代培養物、菌毒株以及診斷性標本等具有感染性的實是為操作原代培養物、菌毒株以及診斷性標本等具有感染性的實驗材料時，用來保護操作者本人、實驗室環境以及實驗材料，驗材料時，用來保護操作者本人、實驗室環境以及實驗材料，使其避免暴露于上述操作過程中可能產生的感染性氣溶膠和使其避免暴露于上述操作過程中可能產生的感染性氣溶膠和濺出物而設計的。濺出物而設計的。高壓滅菌鍋高壓滅菌鍋烘箱烘箱培養箱培養箱水

30、浴鍋水浴鍋顯微鏡顯微鏡普通光學顯微鏡普通光學顯微鏡顯微鏡被用來放大微小物體的圖像。一般應用于對生物、醫藥、微觀粒子等觀測。分光光度計分光光度計分光光度計已經成為現分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規代分子生物實驗室常規儀器。常用于核酸，蛋儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃白定量以及細菌生長濃度的定量度的定量pHpH計計離心機離心機PCRPCR儀儀原理：原理：采用實時熒光采用實時熒光PCR技術檢測食品中技術檢測食品中是否有致病菌；是否有致病菌；靈敏度：靈敏度：對目標菌檢測靈敏度為對目標菌檢測靈敏度為1個個/g效率：效率：檢測過程用時檢測過程用時2-4H主要耗材：主要耗材：各菌種試劑盒各

31、菌種試劑盒 真空泵真空泵 冰箱冰箱 純水機純水機 振蕩器振蕩器/均質機均質機 移液器移液器其它儀器其它儀器四：食品微生物檢驗技術四：食品微生物檢驗技術主要內容主要內容1.微生物檢測作業規范微生物檢測作業規范2.微生物檢驗流程微生物檢驗流程3.常見衛生指標及致病菌常見衛生指標及致病菌4.測定微生物的大小測定微生物的大小5.測定微生物的數量測定微生物的數量6.菌落總數的測定菌落總數的測定7.大腸菌群的測定大腸菌群的測定8.生產環境檢測生產環境檢測無菌操作基本技術無菌操作基本技術用于防止用于防止微生物微生物進入人體組織或其它無菌進入人體組織或其它無菌范圍的操作技術稱為無菌操作。范圍的操作技術稱為無菌

32、操作。如外科手術需防止細菌進入傷口及各種微生物實驗中,為了防止其它微生物影響實驗的進行,也要在無菌的環境下進行. 無菌操作的要求是無菌操作的要求是: 1操作前將界面上的細菌和病毒等微生物殺滅 2操作過程中是界面與外界隔離,避免微生物的侵入 一、在執行無菌操作時，必須明確物品的無菌區和非無菌區。 二、執行無菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并將手擦干，注意空氣和環境清潔。 三、夾取無菌物品，必須使用無菌持物鉗。 四、進行無菌操作時，凡未經消毒的手、臂、均不可直接接觸無菌物品或超過無菌區取物。 五、無菌物品必須保存在無菌包或滅菌容器內，不可暴露在空氣中過久。無菌物與非無菌物應分別放置。無菌包一經打開

33、即不能視為絕對無菌，應盡早使用。凡已取出的無菌物品雖未使用也不可再放回無菌容器內。 六、無菌包應按消毒日期順序放置在固定的柜櫥內，并保持清潔干燥，與非滅菌包分開放置，并經常檢查無菌包或容器是否過期。七、在操作前2030分鐘要先啟動超凈臺和紫外燈，并認真洗手和消毒。在操作時，嚴禁喧嘩，嚴禁用手直接拿無菌物品，如瓶塞等，而必須用消毒的鉗、鑷子等。傾倒平板應在超凈臺內操作，并且在開啟和加蓋瓶塞時需反復用酒精燈燒。對于吸管應先用手拿后1/3處，并用酒精燈燒烤之后再吸液體。無菌操作原則無菌操作原則1.微生物檢測作業規范微生物檢測作業規范 培養液配制完成后，殺菌前放入冰箱冷藏保存，但必須在48小時內對其進

34、行分裝殺菌使用。l已殺菌未開封的培養液在24小時內可直接使用；已殺菌未開封超過24小時或者已殺菌但開封而未用完的培養液都必須重新殺菌后使用。同一培養液反復殺菌不超過2次。l進入無菌間作業時必須做到：緩沖間、無菌間的紫外燈開啟時間超過半小時；關閉紫外燈后，微檢員把作業過程中將用到的所有物品放在緩沖間，同時在緩沖間更換專用的工作衣，同時佩戴口罩和衛生帽，然后再將物品轉移到無菌間；作業時關閉紫外燈、空調、和無菌操作臺風機；l完成作業后，立即做好相關標識、填寫實驗記錄，然后清理無菌間。清理結束后，開啟紫外燈殺菌30分鐘。l無菌間只允許放置無菌操作臺、轉椅、水浴鍋；無菌操作臺上只允許擺放以下物品： 物物

35、 品品數數 量量物物 品品數數 量量酒精燈1個滅菌平皿10塊打火機1個試管架2副接種針1個滅菌吸管根據需要消毒棉球1瓶電子稱1臺洗耳球1個250ml滅菌三角瓶2個鑷子1個培養基根據需要油性筆1支混勻器1臺 樣品的采集樣品的采集 1 所用接觸樣品的用具經過滅菌（所用接觸樣品的用具經過滅菌（不能用消毒不能用消毒劑消毒）劑消毒） 2 取樣要均勻、特殊樣品要控制溫度取樣要均勻、特殊樣品要控制溫度 3 樣品采好后要貼上標簽（注明：樣品名稱、樣品采好后要貼上標簽（注明：樣品名稱、來源、數量、采樣人、地點及時來源、數量、采樣人、地點及時間）間）一般可保一般可保存在存在0-50-5的環境中，如果樣品是冷凍食品

36、，的環境中，如果樣品是冷凍食品，應保持在冷凍狀態，并及時送檢。應保持在冷凍狀態，并及時送檢。 4 采好的樣品送檢不要超過采好的樣品送檢不要超過3小時小時2.微生物檢測流程微生物檢測流程3.3.常見衛生指標及致病菌常見衛生指標及致病菌細菌總數細菌總數大腸菌群大腸菌群霉菌和酵母菌霉菌和酵母菌大腸桿菌大腸桿菌（肉制品）（肉制品）沙門氏菌沙門氏菌（禽、畜肉）（禽、畜肉）副溶血性弧菌（水產品）副溶血性弧菌（水產品）金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌（剩飯）（剩飯）單增李斯特氏菌單增李斯特氏菌（乳制品、冷藏食品）（乳制品、冷藏食品）肉毒梭菌肉毒梭菌（發酵制品、肉制品）（發酵制品、肉制品）4.測定微生物的大小測定

37、微生物的大小測量方法：測微尺測量方法：測微尺長度單位：微米長度單位：微米表示方法：球菌：直徑表示方法：球菌：直徑 桿菌：長桿菌：長* *寬寬 螺菌：長、寬螺菌：長、寬5.測定微生物數量測定微生物數量方法：活菌計數法方法：活菌計數法平板菌落計數法；總菌計數法平板菌落計數法；總菌計數法血球計數板或霍瑟（血球計數板或霍瑟（Peroff Peroff HausserHausser）細菌計數板（二者原理和部件相同，只是厚薄不同而已）。）細菌計數板（二者原理和部件相同，只是厚薄不同而已）。 6.菌落總數的測定菌落總數的測定菌落的定義：將細菌接種在固體培養菌落的定義：將細菌接種在固體培養基上經基上經1824

38、小時培養，長出肉眼可見的小時培養，長出肉眼可見的來源于一個細胞的細菌集團。來源于一個細胞的細菌集團。菌落總數：食品檢樣經過處理，在一定條件菌落總數：食品檢樣經過處理，在一定條件下培養后，所得下培養后，所得1ml（g）檢樣中所含菌落的）檢樣中所含菌落的總數。總數。檢測意義：檢測意義：菌落總數菌落總數常作為評價食品被污染常作為評價食品被污染程度的一個重要指標。預測保質期。程度的一個重要指標。預測保質期。菌落總數的檢驗程序菌落總數的檢驗程序25g(ml)樣品樣品+225ml生理生理鹽水（鹽水（0.85%）(1:10的稀釋液的稀釋液)作幾個適當倍數的稀釋液作幾個適當倍數的稀釋液(例如例如1:100，1

39、:1000)選擇選擇23個適宜稀釋度個適宜稀釋度各取各取1ml分別加入滅菌培養皿中分別加入滅菌培養皿中平皿中加平皿中加1520ml 營養瓊脂營養瓊脂（46），于于361培養培養48h 菌落記數菌落記數/報告報告GB 4789.2-2010 （1）以無菌操作，將檢樣25g（或25mL）剪碎以后，放于含有225mL滅菌生理鹽水三角瓶內，經充分振搖做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質器中以8000r/min-100000r/min的速度處理1min，做成1：10的均勻稀釋液。 （2）用1mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內（注

40、意吸管尖端不要觸及管內稀釋液，下同），振搖試管混合均勻，做成1：100的稀釋液。 （3）另取1mL的滅菌吸管，按上項操作順序作10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用1支1mL滅菌吸管。 檢樣稀釋及培養檢樣稀釋及培養1 （4）對檢樣污染情況的估計，選擇2-3個適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移1mL稀釋液于滅菌平皿內，每個稀釋度作兩個平皿。 （5）稀釋液移入平皿后，應及時將涼至46 營養瓊脂培養基注入平皿15mL-20mL，并轉動平皿使混合均勻，同時將營養瓊脂培養基傾入加有1mL生理鹽水的滅菌平皿內作空白對照。 （6）等瓊脂凝固后，翻轉平板，置（361）恒溫

41、箱內培養（482）h取出，計算平板內菌落數目乘以倍數，即得1g（1mL）樣品所含菌落總數。 檢樣稀釋及培養檢樣稀釋及培養2流程圖流程圖l菌落計算方法菌落計算方法可用肉眼觀查，必要時用放大鏡或菌落計數器，記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落可用肉眼觀查，必要時用放大鏡或菌落計數器，記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落形成單位（形成單位（CFU)表示表示.平板菌落數的選擇平板菌落數的選擇 選取菌落數在選取菌落數在30300之間之間,無蔓延菌落生長的平板作為菌落總數。無蔓延菌落生長的平板作為菌落總數。300的記錄多不可計；每個稀釋度應采用兩個平板平均數；的記錄多不可計；每個稀釋度應采

42、用兩個平板平均數； 其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數，若片狀菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均勻，即可計算稀釋度的菌落數，若片狀菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘半個平板后乘2以代表全皿菌落數；以代表全皿菌落數； 平皿內如有菌落之間無明顯界線，可視為一個菌落數；平皿內如有菌落之間無明顯界線，可視為一個菌落數；報告報告菌落總數計算方法菌落總數計算方法 若只有一個稀釋度菌落在適宜計數范圍內，計算平均值若只有一個

43、稀釋度菌落在適宜計數范圍內，計算平均值X 稀釋倍數；作為結果；稀釋倍數；作為結果； 若兩個連續稀釋度的菌落都在適宜計數范圍內時按公式計算：若兩個連續稀釋度的菌落都在適宜計數范圍內時按公式計算： 報告報告 若所有稀釋度平均菌落數均若所有稀釋度平均菌落數均 300，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。數報告之。 若所有稀釋度的平均菌落數均若所有稀釋度的平均菌落數均 300或或 30時，則以時，則以最接近最接近30或或300的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。報告報告菌落數的報告菌落數的報告 菌落數菌落數 100內時，按

44、四舍五入修約，以整數報告，內時，按四舍五入修約，以整數報告，100時，采用二位有效時，采用二位有效數字，在二位有效數字后面的數值，第三位數以四舍五入方法修約；取前兩位數字，后面數字，在二位有效數字后面的數值，第三位數以四舍五入方法修約；取前兩位數字，后面用用0代替，也可用代替，也可用10的指數表示；的指數表示； 若平板上為蔓延菌落無法計數，則報告菌落蔓延；若平板上為蔓延菌落無法計數，則報告菌落蔓延； 若空白上長菌，則實驗失敗；若空白上長菌，則實驗失敗； 稱重以稱重以CFU/g為單位報告，體積取樣以為單位報告，體積取樣以CFU/ml為單位報告。為單位報告。報告報告 菌落總數檢測注意事項：菌落總數

45、檢測注意事項： 1 操作要在無菌的狀態下進行。操作要在無菌的狀態下進行。 2 操作時間越短越好。操作時間越短越好。 3 樣品不同選擇的稀釋倍數不同。樣品不同選擇的稀釋倍數不同。 4 培養基冷卻溫度不宜過高或過低。培養基冷卻溫度不宜過高或過低。7.大腸菌群的測定大腸菌群的測定大腸菌群大腸菌群的定義：的定義：系指一群在系指一群在3724小時能發酵乳糖、產酸、產氣、需氧和兼性小時能發酵乳糖、產酸、產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，以此作為糞便污染該菌主要來源于人畜糞便，以此作為糞便污染指標來評價食品的衛生質量。指標來評價食品的衛生質量。檢

46、測意義：該菌主要來源于人畜糞便，故該指標體現了食品被糞便污染的程度。檢測意義：該菌主要來源于人畜糞便，故該指標體現了食品被糞便污染的程度。7.7.大腸菌群的測定大腸菌群的測定 基本概念基本概念大腸菌群包括大腸埃希氏菌（大腸桿菌）、檸檬酸桿菌、產氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。大腸菌群的來源分糞便來源和非糞便來源，在44.5仍能生長的大腸菌群，稱為糞大腸菌群，糞大腸菌群又叫耐熱大腸菌群，在人和動物糞便中所占的比例較大，而且在自然界容易死亡。因此，糞大腸菌群對糞便污染的指示作用更為直接和貼切，主要就是大腸桿菌，但也包括克雷伯氏菌屬，正是由于包括了克雷伯氏菌屬，使其與糞便污染的相關性受到了影響。大腸菌群

47、、糞大腸菌群和大腸桿菌這三個指標在實際工作中都在應用，但用途有所不同，一般認為大腸菌群是水源的衛生指標和食品加工衛生狀況的通用指標，糞大腸菌群主要用于貝類和貝類養殖用水的衛生指標，大腸桿菌用于指示食品受到近期糞便污染或不衛生加工。 大腸菌群表示方法：最可能數-MPN（ most probable number） /100mL 。 大腸菌群的測定流程大腸菌群的測定流程檢樣檢樣25g（ml）+225ml稀釋液，均質稀釋液，均質10倍系列，稀釋選擇適宜倍系列，稀釋選擇適宜3個連續稀釋度的樣品勻液，個連續稀釋度的樣品勻液，接種接種LST肉湯管肉湯管產氣產氣不產氣不產氣BGLB肉湯肉湯產氣產氣不產氣不產

48、氣大腸菌群陰性大腸菌群陰性大腸菌群陽性大腸菌群陽性查查MPN表表報告結果報告結果361 482h361482hGB 4789.3-20101.LST:月桂基硫酸鹽月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯胰蛋白胨肉湯2.BGLB：煌綠乳糖：煌綠乳糖膽鹽肉湯膽鹽肉湯大腸菌群的測定步驟大腸菌群的測定步驟 檢驗稀釋檢驗稀釋 取樣及稀釋方法與菌落總數檢驗方法相同。 初發酵試驗初發酵試驗 根據食品衛生要求或對檢樣污染程度的估計，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管LST,每管接種量為1ml。如接種量在1ml以上者,用雙料LST。置361溫箱內,培養242h,觀察倒管是否有氣泡產生，產氣者進行復發酵試驗，如未產氣者則繼續培養

49、至48 2h，產氣者進行復發酵試驗。未產氣者報告大腸菌群陰性。 復發酵試驗復發酵試驗用接種環從產氣的用接種環從產氣的LST肉湯管中分別取培養物一環，接種于肉湯管中分別取培養物一環，接種于BGLB管中，管中， 361溫箱內,培養482h,觀察倒管是否有氣泡產生，產氣者記為大腸菌群陽性管。 報告報告 根據證實為大腸桿菌陽性的管數，查MPN表，報告每100ml（g）大腸菌群的MPN值。大腸菌群的測定大腸菌群的測定 注意事項注意事項初發酵陽性管，只能經過復發酵實驗后，才有可能成為陽性。初發酵陽性管，只能經過復發酵實驗后，才有可能成為陽性。在實際工作中，有時遇到初發酵時產酸，但導管內無氣泡產生，復發酵卻證實為大在實際工作中，有時遇到初發酵時產酸，但導管內無氣泡產生，復發酵卻證實為大腸菌群陽性。有時導管內無