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文檔簡介

1、實驗三實驗三 凝膠過濾法凝膠過濾法分離蛋白質分離蛋白質 血紅蛋白血紅蛋白+高鐵氰化鉀高鐵氰化鉀 高鐵血紅蛋白高鐵血紅蛋白 Mw=64 500 Mw=327.25 黃色黃色( (過量過量) ) 紅褐色紅褐色 實驗原理實驗原理凝膠過濾法凝膠過濾法(分子篩層析分子篩層析/凝膠層析凝膠層析): 凝膠凝膠多孔凝膠顆粒多孔凝膠顆粒(分子篩分子篩)： 交聯葡聚糖凝膠交聯葡聚糖凝膠 (Sephadex G-25 ) PBS大分子不能進入凝膠顆粒內部，大分子不能進入凝膠顆粒內部，直接沿凝膠顆粒間隙流出，流直接沿凝膠顆粒間隙流出，流程短，故先洗脫出來程短，故先洗脫出來;小分子則擴散進入凝膠微孔，小分子則擴散進入凝

2、膠微孔，流程長，在柱內保留時間長，流程長，在柱內保留時間長，則后洗脫出來則后洗脫出來凝膠過濾法的分子篩效應凝膠過濾法的分子篩效應G-25凝膠顆粒凝膠顆粒大分子大分子小分子小分子大分子大分子凝膠顆粒凝膠顆粒小分子小分子操作步驟操作步驟v凝膠準備凝膠準備（已完成）（已完成）v裝柱裝柱（關（關開開關關）v樣品處理樣品處理 (3滴滴+8滴滴+2滴，已完成滴，已完成) v上樣上樣(開開關，加樣關，加樣0.2ml，開，開)v洗脫洗脫(3cm)v分部收集分部收集（10滴滴/min, 13滴滴/管）管）v測定測定A425(+2ml蒸餾水，空白管蒸餾水，空白管)1.裝柱后裝柱后及洗脫時及洗脫時2.上樣時上樣時柱

3、床柱床PBS(3cm)PBS(1mm)管編號管編號A425 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10洗脫圖譜洗脫圖譜MetHbK3Fe(CN)61. 裝柱后要裝柱后要檢查柱床是否均勻檢查柱床是否均勻，若有，若有氣泡或分層氣泡或分層的的界面時，需要重新裝柱。界面時，需要重新裝柱。2. 上樣時滴管末端一定要上樣時滴管末端一定要靠近凝膠柱表面靠近凝膠柱表面(1cm)、沿柱內壁緩緩滴加沿柱內壁緩緩滴加，不能沖擊凝膠柱表面。樣，不能沖擊凝膠柱表面。樣品上柱后應在凝膠柱表面品上柱后應在凝膠柱表面形成一層薄液層形成一層薄液層。3. 收集要及時收集要及時，不能等紅褐色物質流出之后再收集，不能等紅褐色物質流出之后再收集(13滴滴/管管)。4. 流速不可太快流速不可太快(約約10滴滴/min)。 5. 洗脫過程中要洗脫過程中要防止凝膠柱洗脫液流干防止凝膠柱洗脫液流干(3cm)。6. 洗脫完成后洗脫完成后凝膠要回收凝膠要回收，勿丟棄。，勿丟棄。注意

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