1、弧菌和彎曲菌醫學檢驗系臨床微生物及免疫學教研室井申榮第一部分第一部分 弧弧 菌菌概 述 弧菌科（Vibrionaseae）包括一群氧化酶陽性、具有端極鞭毛、動力陽性的細菌，有4個菌屬，其中，弧菌屬是一群氧化酶陽性，發酵葡萄糖，對弧菌抑制劑O/129（二氨基二異丙基喋啶）敏感的細菌。 弧菌屬(Vibrio)廣泛分布于自然界，尤以水中為多，有100多種。主要致病菌為霍亂弧菌和副溶血弧菌（致病性嗜鹽菌）。前者引起霍亂；后者引起食物中毒?；?亂 弧 菌霍亂弧菌（V.cholera）是人類霍亂的病原體，霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表現為劇烈的嘔吐、腹瀉、失水，

2、死亡率甚高。屬于國際檢疫的烈性傳染病。 霍亂弧菌包括兩個生物型：古典生物型（Classical biotype）和埃爾托生物型（EL-Tor bio-type）。這兩種型別除個別生物學性狀稍有不同外，形態和免疫學性基本相同，在臨床病理及流行病學特征上沒有本質的差別。自1817年以來，全球共發生了七次世界性大流行，前六次病原是古典型霍亂弧菌，第七次病原是埃爾托型所致。1992年10月在印度東南部又發現了一個引起霍亂流行的霍亂流行的新血清型菌株（新血清型菌株（0139），它引起的霍亂在臨床表現及傳播方式上與古典型霍亂完全相同，但不能被01群霍亂弧菌診斷血清所凝集。該菌株在水中的存活時間較01群霍亂

3、弧菌長，因而有可能成為引起世界性霍亂流行的新菌株。一、生物學性狀（一）形態染色 霍 亂 弧 菌 呈 弧 形 或 逗 點 形 態弧 形 或 逗 點 形 態 ， 大 小 為1.42.60.50.8m。革蘭氏陰性菌，菌體一革蘭氏陰性菌，菌體一端有單根鞭毛和菌毛，無莢膜與芽胞。端有單根鞭毛和菌毛，無莢膜與芽胞。 取霍亂病人米泔水樣糞便作活菌懸滴觀察，可見細菌運動極為活潑，呈流星穿梭運動運動極為活潑，呈流星穿梭運動。 圖注：霍亂弧菌的鞭毛（）和它可溶解的鞘膜（） 負染，3 100 圖注：分裂中的霍亂弧菌 冰凍蝕刻，70 000 （二）培養特性 霍亂弧菌為需氧或兼性厭氧菌需氧或兼性厭氧菌; ; 營養要求不

4、高，營養要求不高，耐堿不耐酸耐堿不耐酸，在pH8.89.0的堿性蛋白胨水或平板中生長良好。因其他細菌在這一pH不易生長，故堿性蛋白胨水堿性蛋白胨水可作為選擇性可作為選擇性增殖霍亂弧菌的培養基增殖霍亂弧菌的培養基; ; 在堿性平板上菌落直徑為2mm，圓形，光滑，圓形，光滑，透明透明。 常用的選擇培養基選擇培養基為硫代硫酸鹽-枸櫞酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂平板（TCBS），霍亂弧菌在其中可形成較大的菌落，因發酵蔗糖產酸而使菌落呈黃色菌落呈黃色。（三）生化反應 兩個生物型的霍亂弧菌都能分解甘露醇、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，產酸不產氣。遲緩發酵乳糖，不分解阿拉伯糖。 氧化酶、明膠酶試驗均陽性。 能產生靛基質，霍

5、亂紅反應陽性El Tor型霍亂弧菌與古典型霍亂弧菌生化反應有所不同 El Tor型VP試驗為陽性，能產生強烈的溶血素，溶解羊紅細胞，在血平板上生長的菌落周圍出現明顯的透明溶血環， 古典型試驗VP試驗為陰性，不溶解羊紅細胞。 個別EL Tor型霍亂弧菌株亦不溶血。 霍亂弧菌的抗原結構特性O抗原H抗原屬共同抗原 群特異性型特異性耐熱性（100 2h）（四）抗原性 1抗原結構：2分群和分型： 根據O抗原的特異性，可將霍亂弧菌分成139個血清群個血清群。 根據是否與O1抗血清凝集分兩大群， 凡能與O1群抗血清發生凝集的稱為O1群霍亂弧菌群霍亂弧菌； 凡不被O1群抗血清凝集的其它血清群統稱為非非O1群霍

6、群霍亂弧菌亂弧菌。O1群霍亂弧菌的血清分型型別別名O抗原成份原型稻葉型（Inaba）A、C異型小川型（Ogawa） A、B中間型彥島型（Hikojima）A、B、C血清型：O1群霍亂弧菌的菌體抗原由A、B、C三個抗原成份三個抗原成份組成 生物型生物型：O1群霍亂弧菌有古典生物型和古典生物型和E1 Tor 生物型生物型之分，兩個生物型具有相同的血清型。我國流行以El Tor、小川型霍亂弧菌為主。 噬菌體分型噬菌體分型： 對噬菌體的敏感性進行分型，其中較為實用的是第組和第組噬菌體。霍亂弧菌兩個生物型的鑒別性 狀古 典 型E1 Tor 型溶血（1%綿羊紅細胞）d血凝（2.5%雞紅細胞）V-P試驗多

7、粘 菌 素 B 敏 感 試 驗（50U/片）噬 菌 體 組 裂 解（106/ml）噬 菌 體 組 裂 解（106/ml）以上為陽性；以上為陰性；陽性霍亂弧菌的變異性形態變異弧型直桿狀 多形 菌落變異S RL 溶血性變異（ El Tor型）溶血性 非溶血性 傳代 毒力變異強毒株 弱毒株 無毒株 血清型別變異小川型 稻葉型 （五）變異性：（六）抵抗力 霍亂弧菌古典生物型對外環境抵抗力較弱古典生物型對外環境抵抗力較弱，EL-Tor生物型抵抗力較強。生物型抵抗力較強。 霍亂弧菌對熱、干燥、日光、化學消毒劑和酸霍亂弧菌對熱、干燥、日光、化學消毒劑和酸均很敏感，耐低溫，耐堿而不耐酸均很敏感，耐低溫，耐堿而

8、不耐酸。 霍亂弧菌對鏈霉素、氯霉素和四環素敏感，但El Tor生物型對一定濃度的多粘菌素B及慶大霉素有耐藥性。二、致病性和免疫性1致病物質（1） 鞭毛、菌毛、粘液素酶鞭毛、菌毛、粘液素酶（2） 霍亂腸毒素霍亂腸毒素（cholera enterotoxin） 霍亂腸毒素本質是蛋白質，不耐熱。對蛋白酶敏感而對胰蛋白酶抵抗。 該毒素屬外毒素，具有很強的抗原性?；魜y腸毒素霍亂腸毒素1個A亞單位毒性單位A1肽鏈具有激活腺苷酸環化酶的酶活性A2肽鏈結合B亞單位；參與轉位5個B亞單位（46）結合單位特異地識別腸上皮細胞膜上的神經節苷脂受體致病機理霍亂弧菌胃對酸敏感，很快被殺死腸胃酸降低或缺乏，菌體增多鞭毛、

9、菌毛、粘液素酶絨毛上大量繁殖CT的B亞單位結合神經節苷脂受體形成膜通道A1肽鏈進入細胞ATP cAMP 腸粘膜上皮細胞分泌亢進腸液大量分泌大量體液和電解質進入腸腔而發生劇烈吐瀉大量脫水和失鹽發生代謝性酸中毒，血循環衰竭，甚至休克或死亡激活腺苷酸環化酶系統2所致疾病引起烈性腸道傳染病的霍亂，為我國的法定傳染?。最悾?，表表現為現為劇烈的上吐下瀉，導致嚴重的脫水、酸中毒、痙攣、尿閉、劇烈的上吐下瀉，導致嚴重的脫水、酸中毒、痙攣、尿閉、休克和死亡。休克和死亡。人類在自然情況下是霍亂弧菌的唯一易感者，主要通過污染的水源或飲食物經口傳染（糞口途徑糞口途徑）。患者出現上吐下瀉，瀉出物出現上吐下瀉，瀉出物呈

10、呈“米泔水樣米泔水樣”，并含大量弧菌，此為本病典型的特征，并含大量弧菌，此為本病典型的特征。 3免疫性 患過霍亂的人可獲得獲得牢固的免疫力牢固的免疫力，再感染者少見。 病后小腸內可出現分泌型分泌型lgA。三、微生物學診斷 由于霍亂流行迅速，且在流行期間發病率及死亡率均高，危害極大，因此早期迅速和正確的診斷，對治療和預防本病的蔓延有重大意義。（一）標本采集： 標本以糞便為主標本以糞便為主， 一般米泔水樣便米泔水樣便采取13ml，成形便采取蠶豆大小。 在某些情況下，亦可采取嘔吐物和尸體腸內容嘔吐物和尸體腸內容物物作檢材。 檢驗程序（三）檢驗方法及鑒定1直接鏡檢：1）動力觀察：動力觀察：采取病人“米

11、泔水樣”大便或嘔吐物制成懸滴片，觀察細菌動力觀察細菌動力，可見可見流星或穿梭狀動力的細菌流星或穿梭狀動力的細菌。2）制動試驗：制動試驗： 標本，標本， 霍亂多價診斷血清霍亂多價診斷血清（效價1：64），用暗視野鏡觀察，3分鐘內分鐘內運動被抑制運動被抑制的即為陽性的即為陽性， 此法優點是快速而特異操作簡便快速而特異操作簡便，但必須有數量較多的弧菌才檢出。3）涂片染色涂片染色：革蘭氏染色陰性革蘭氏染色陰性并成魚群狀排列的弧菌并成魚群狀排列的弧菌。2快速診斷：1） 免疫熒光菌球法：免疫熒光菌球法：將標本接種于含有霍亂弧菌熒熒光抗體光抗體的堿性蛋白胨水中，經3746h，如有霍亂弧菌，在熒光顯微鏡下可見

12、發熒光的菌球可見發熒光的菌球。本法適用于做大量標本的初篩大量標本的初篩。2） SPA協同凝集試驗：協同凝集試驗：以霍亂弧菌IgG型抗體型抗體與SPA陽性葡萄球菌結合作為試劑，與米泔水樣便或增菌液作玻片凝集，立即出現明顯凝集者（）為立即出現明顯凝集者（）為陽性。陽性。3細菌分離培養1） 直接分離培養：直接分離培養： 分離用的培養基有強、弱2種選擇培養基。 弱選擇培養基弱選擇培養基：堿性瓊脂和堿性膽鹽瓊脂。 強選擇培養基：強選擇培養基：常用的有慶大霉素瓊脂、4號瓊脂和TCBS瓊脂等。 現多采用堿性蛋白胨水增菌，再用強選擇培養基進行現多采用堿性蛋白胨水增菌，再用強選擇培養基進行分離。分離。 4 鑒定

13、： 根據霍亂弧菌在各種選擇培養基上的特點，挑選可疑菌落進行鑒定。鑒定以血清學（玻片凝集）為主，鑒定以血清學（玻片凝集）為主，結合形態學、生化反應作出判斷結合形態學、生化反應作出判斷。1） 玻片凝集試驗：玻片凝集試驗：從分離培養基上挑取可疑菌落于霍亂弧菌多價診斷血清多價診斷血清作玻片凝集試驗。診斷血清應稀釋成1:32-1:64的效價使用，立即出現凝集者為陽性立即出現凝集者為陽性，同時設生理鹽水和陽性細菌株對照。 2） 形態學檢查：形態學檢查：取純培養物涂片革蘭氏染色，觀觀察菌體形態及染色性察菌體形態及染色性。用懸滴法或半固體穿刺法檢測檢測動力動力。3） 生化反應：生化反應：霍亂弧菌氧化酶試驗、靛

14、基質試驗、粘絲試驗和霍亂紅試驗均陽性。 粘絲試驗：粘絲試驗：用于測定霍亂弧菌形成粘絲的特性。將0.5去氧膽酸鈉去氧膽酸鈉水溶液于霍亂弧菌混勻制成濃厚菌液，1min內懸液由混變清，并變得粘稠，以接種以接種環挑取時可以拉出絲環挑取時可以拉出絲來來?；魜y弧菌古典生物型和El Tor生物型均呈陽性。 霍亂紅試驗：霍亂紅試驗：出現薔薇色出現薔薇色，為霍亂紅試驗陽性。由于霍亂弧菌和其他弧菌均有此種反應，故無特異性。（霍亂弧菌含有色氨酸酶，能分解色氨酸產生吲哚，霍亂弧菌液能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，因此當霍亂弧菌培養在含有硝酸鹽成分的蛋白胨水中，所產生的亞硝酸鹽可與吲哚結合成亞硝酸吲哚，滴加濃硫酸即可出現薔薇色

15、，稱為霍亂紅試驗陽性） O/129敏感試驗：敏感試驗：將O/129（2，4二氨基6，7二異丙基喋啶）藥敏紙片（10150g）貼在接種有待測菌的瓊脂平板上作紙片擴散試驗，凡藥物紙片周圍出凡藥物紙片周圍出現抑菌環者為敏感現抑菌環者為敏感。4） 霍亂弧菌的分型鑒別試驗：血清分型：血清分型：用小川型和稻葉型單價診斷血清單價診斷血清作玻片凝集。與小川型血清凝集而與稻葉型血清不凝集者為小川型，反之為稻葉型。在兩個單價血清中均有明顯凝集者為彥島型。生物型別的鑒定：生物型別的鑒定：目前，兩型主要依靠第組霍亂噬菌體裂解試驗進行鑒別，并輔以多粘菌素敏感試驗、雞紅細胞凝集試驗、VP試驗和溶血試驗。 第第組霍亂噬菌體

16、裂解試驗：組霍亂噬菌體裂解試驗： 第組霍亂噬菌體常規稀釋液（106/ml）一般僅裂 解古典型，而不裂解El Tor型。 多粘菌素多粘菌素B B敏感試驗：敏感試驗： 取被檢菌2-3h肉湯培養物點種到含藥營養瓊脂平板上（多粘菌素B50Uml）,37培養24h，El TorEl Tor生物生物型生長，而古典型敏感。型生長，而古典型敏感。 雞紅細胞凝集試驗：雞紅細胞凝集試驗：在玻片上滴加生理鹽水一滴，取被檢菌18-24h培養物少許在鹽水中制成濃厚菌懸液，然后加一滴2.5雞紅細胞懸液，充分混勻，1min1min內出現內出現凝集者為陽凝集者為陽性性，紅細胞呈均勻分散者為陰性。El TorEl Tor生物生

17、物型為陽性，型為陽性，古典型為陰古典型為陰性性。鑒定要點：確診O1群霍亂弧菌必須具備的條件：1、涂片為革蘭氏陰性弧菌或桿菌；2、TCBS等選擇培養基上典型的菌落特征；3、動力陽性；4、O1群霍亂弧菌診斷血清凝集試驗陽性。四、防治原則 必須貫徹預防為主預防為主。 人群的菌苗預防接種菌苗預防接種，可獲良好效果， 治療主要為治療主要為及時補充液體和電解質及應用抗菌及時補充液體和電解質及應用抗菌藥物藥物如四環素、鏈霉素、氯霉素、強力霉素及氟哌酸類抗生素藥物。 第二部分 彎曲菌屬 彎曲菌屬彎曲菌屬(Campylobacter)細菌是一類微需氧、不分解糖類、氧化酶陽性、菌體彎曲呈逗點狀、S型或螺旋狀、有動

18、力的革蘭氏陰性菌。 對人類致病的主要是空腸彎曲菌和胎兒彎曲菌空腸彎曲菌和胎兒彎曲菌胎兒亞種胎兒亞種，前者是人類腹瀉腹瀉最常見的病原菌之一，后者在免疫功能低下時可引起敗血癥、腦敗血癥、腦膜炎等膜炎等。 本節主要以空腸彎曲菌介紹本屬的生物學特性和檢驗方法一、生物學性狀（一）形態與染色 空腸彎曲菌 （C.jejuni）菌體輕度彎曲似逗點狀，長1.55 m，寬0.20.8 m。菌體一端或兩端有鞭毛，運動活潑，在暗視野鏡下觀察似飛蠅。有莢膜，不形成芽胞。革蘭氏陰性。圖注：空腸彎曲菌的兩端單鞭毛（） 負染，21 000 （二）培養特性（二）培養特性 為為微需氧菌微需氧菌，在含2.55%氧和10%CO2的環

19、境中生長最好。最適溫度為3742。在正常大氣或無氧環境中均不能生長。 本菌營養要求高營養要求高，需加入血液、血清才能生長需加入血液、血清才能生長。 在凝固血清和血瓊脂培養基上培養36小時可見無色半透明毛玻璃樣小菌落無色半透明毛玻璃樣小菌落，單個菌落呈中心單個菌落呈中心凸起，周邊不規則，無溶血現象凸起，周邊不規則，無溶血現象。（三）生化反應 空腸彎曲生化反應不活潑，不發酵糖類，不分解尿素，不液化明膠，靛基質陰性。 可還原硝酸鹽，氧化酶和過氧化氫酶為陽性。 甲基紅和VP試驗陰性； 枸椽酸鹽培養基中不生長。 （四）抵抗力 抵抗力不強抵抗力不強，易被干燥、直射日光及弱消毒劑所殺滅，565分鐘可被殺死。

20、 對紅霉素、新霉素、慶大霉素、四環素、氯霉素、卡那霉素等抗生素敏感抗生素敏感。但近年發現了不少耐藥菌株。 （五）抗原構造 本菌抗原構造與腸道桿菌一樣具有具有O、H和和K抗原抗原。 根據O抗原，可把空腸彎曲菌分成45個以上血清型。 二、致病性與免疫性空腸彎曲菌是多種動物如牛、羊、狗及禽類的正常寄居菌正常寄居菌。污染食物和飲水污染食物和飲水，可引起人類急性腸炎和食物急性腸炎和食物中毒中毒，其致病因素與腸毒素、內毒素、細胞毒素、侵其致病因素與腸毒素、內毒素、細胞毒素、侵襲力有關。襲力有關。感染后能產生特異性血清抗體感染后能產生特異性血清抗體，三、微生物學診斷（一）標本采集： 取腹瀉病人新鮮糞便或肛拭子新鮮糞便或肛拭子立即送檢。如不能及時送檢，應將標本接種于卡布運送培養基。（二）檢驗程序：（三）檢驗方法及鑒定1直接涂片 （1）懸滴標本檢查： 顯微鏡