1、12 用于酶催化的非水介質包括： 含微量水的有機溶劑 與水混溶的有機溶劑和水形成的均一體系 水與有機溶劑形成的兩相或多相體系 膠束與反膠束體系 超臨界流體 氣相345有機介質中的酶促反應的優越性有機介質中的酶促反應的優越性 原先的認識： 1）我們以前的酶學理論知道，酶溶解在水溶液中，而且酶一定是在水溶液中才能反應，又知道水是個極性分子，酶只能在極性溶劑中反應。 2）我們又知道有機溶劑是酶的變性劑，用了以后，應該在盡可能短的時間內去除有機溶劑，再把酶溶解于水中，以防止酶的變性和失活。 現在酶工程技術的發展，已經告訴我們，酶反應可在有機介質中進行，已經成為酶工程、酶化工研究的一個新的領域，開辟了一

2、個新的研究方向。6有機介質中酶促反應優越性被認為至少有以下優點： 1）有利于疏水性底物反應 2）提高酶反應T，加速反應V，提高酶反應穩定性。 3）可以催化一些在水相中不能進行的反應。 4）可以改變反應的平衡方向。 5）控制底物的專一性。 6）防止由水引起的付反應。 7）擴大反應的pH范圍. 8）有利于酶的固定化。 9）酶、產物容易回收。10）消除底物、產物的抑制作用。11）防止微生物的污染。7第二節第二節 反應條件：反應條件： 一句話，條件要適宜,在一個特定條件特定條件下進行，。 一、一、 保證必需水含量保證必需水含量 水是保證酶催化反應的必需條件，活性構象是水分子直接或間接由氫鍵等非共價鍵相

3、互作用來維持。因此與酶分子緊密結合的一單層水分子對催化作用非常重要。而其他的水則相對不那么重要(即由有機介質替代的那部分水不那么重要了）。8 必需水必需水：是維系酶構象穩定和酶催化活性所必需的那部分最少量的水分子,有時也叫結合水結合水,或者束縛水。束縛水。 只要那部分必需水不丟失只要那部分必需水不丟失, 其他的大部分水可其他的大部分水可以由有機溶劑代替以由有機溶劑代替. 所以，有機介質中的酶促反應在微觀上看是水的酶反應，但是在宏觀上看是有機介質中的酶反應。如有的酶反應即使水只占0.015%， 酶仍然有活性，可以進行酶反應, 而且反應速度非常快。9 下面是一個胰脂肪酶的反應速度下面是一個胰脂肪酶

4、的反應速度-水含量的關系水含量的關系圖。圖。10一般認為，一個酶結合水的過程分4步：1.首先與酶分子表面的帶電基團結合一部分水(0- 0.07g/g(水/酶)。2.再與酶分子表面的極性基團結合一部分水(0.07-0.25g/g(水/酶)。3.再聚集到表面相互作用較弱的部位(0.25-0.38g/g(水/酶)。4.最后酶分子表面完全水合化，水分子覆蓋酶分子表面。11 一般因酶分子本身, 或溶劑系統不同而有所不同。 如脂肪酶有幾個水分子, 胰凝乳蛋白酶幾十個水分子, 乙醇脫氫酶、多酚氧化酶有幾百個水分子。 另外同一個酶在不同溶劑系統中含水也不同。 如胰凝乳蛋白酶，在甲苯中，含水0.5%； 氯仿等系

5、統中，含水1.0%，酶活性最高。 一般酶要發揮它的催化活性，必須與有機溶劑系統獲得水分以維持酶必要的水合狀態。12酶選擇原則酶選擇原則： 在有機介質中酶有不變性的潛在能力，即能保持酶催化活性的構象和催化能力。 由于酶的組成、結構、構象多樣化，所以不能認為所有的酶都可以在有機介質中反應。 但是，一般現在的資料顯示認為大多數酶可以做到。而有些酶在有機介質中可以進行，在水中卻不能反應，如脂肪酶、蛋白酶、次黃嘌呤氧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、醛縮酶、多酚氧化酶、醇脫氫酶、細胞色素氧化酶、ATP酶，膽固醇氧化酶等。這些酶有些屬膜酶，在水溶液中反而不穩定。13 酶是否適于在有機介質中反應，除與酶性質有關

6、外，還取決于酶-底物、產物-溶劑間的關系問題。這完全需要用實驗來決定。14 酶在有機介質中的溶解特性、穩定性、活性等，對酶的選擇很重要。1）酶酶00000000粉粉 將酶做成凍干粉，然后在有機介質中充分攪拌，超聲波處理，使得顆粒變小，懸浮于介質中。2）控制酶量的問題控制酶量的問題 需要適量。如-凝乳蛋白酶在乙醇中的轉脂反應，隨著加酶量的下降，活性反而上升，速度快。可能理由可能理由： 被認為在水含量不變的情況下，酶少到一個合適的濃度，可以使酶聚合體變小，反而增大了酶-底物接觸的面，減少了底物擴散的限制，酶反應速度反而加快。153）酶化學修飾的問題酶化學修飾的問題 化學修飾可以改變酶的一些理化性質

7、，有利于酶在有機溶劑中的穩定性，原先不穩定的酶經過修飾變得穩定，主要是因為改變了酶的一些理化性質。 一般認為大多數酶可以在有機介質中反應。但是，操作穩定性差。化學修飾的目的就是要提高酶的穩定性。16 化學修飾方法很多，聚乙二醇（PEG）修飾較常見。 如PEG修飾過氧化氫酶，然后在有機介質中活性顯著提高。還研制了磁性脂肪酶（磁性顆粒外包PEG修飾的脂肪酶），它在有機介質中較穩定，活力也較高，且可在磁場中回收。還有用谷氨酸、十二醇、葡萄糖酸內酯合成了糖脂后修飾超氧化物歧化酶（SOD）。所得的這種SOD糖脂復合物變成脂溶性的酶，而不是水不溶性的。SOD糖脂復合物在有機介質中活性高大大高于在水中的活性

8、，并且它對溫度、pH、蛋白酶水解等的穩定性均高于天然SOD。17還有用聚磷酸酯、脂肪酸等修飾SOD，同樣得到了適合于有機介質中進行催化反應的化學修飾酶-SOD。在進行了不同化學修飾酶在有機介質中的反應的研究以后，發現化學修飾（采用脫糖基化、PEG修飾等）能夠增加酶的表面疏水性，而疏水性的增加正是提高酶在有機介質中的溶解性和活力的重要原因。 PEG修飾酶在甲苯中的活性比未修飾酶高16倍。通過酶蛋白甲基化作用或疏水分子對酶蛋白的修飾，均可提高酶在有機介質中的溶解性、穩定性和活性。 184） 固定化酶固定化酶 第二章已經講到固定化酶和細胞的問題，固定化有許多好處。在有機溶劑中進行酶反應，如果進行酶的

9、固定化，必定可以充分顯示其優越性。 酶被吸附或者固定在固相載體（水不溶性）上，就可以對抗有機介質對酶的變性能力，提高反應的速度和對熱的敏感性。 一般象用硅膠、硅藻土、玻璃珠等制成固定化酶，載體通過分配效應劇烈地改變酶所處的微環境中底物和產物的局部濃度。固定化后，首先使載體能通過分配效應改變酶所處微環境中底物和產物的局部濃度。 19例子：在水溶液中，底物肉桂醇濃度在0.1mmol/L以上可強烈抑制馬肝醇脫氫酶活性。 現在它在乙酸丁酯中使用親水載體固定化酶，底物濃度高達50mmol/L也不會發生抑制作用。還有個例子：研究幾種不同載體的固定化脂肪酶時發現，疏水性瓊脂珠載體的固定化效果最好。 固定化后

10、脂肪酶在有機介質中的活性比對應酶粉高46.5。 由于載體上疏水基團的存在，使疏水性底物在疏水作用下分配到載體周圍的濃度高于反應介質中的濃度。使酶反應速度提高。20 其次，載體影響酶分子上的結合水。親水性高的載體會從溶劑和酶分子中奪取大量的水，造成酶部分失水而降低酶的活性；親水性低的載體不足以奪取酶的必需水，能保持它的高酶活性。 還有通過載體與酶之間形成的多點的結合作用，可穩定酶的催化活性構象。例如，-胰凝乳蛋白酶與聚丙烯酰胺凝膠共價結合后，在乙醇中的穩定性明顯提高，并且對有機溶劑的抗性隨酶與載體間共價鍵數量的增加而增強。2122 另外載體問題還會影響酶的動力學。如影響一個酶同時催化兩個反應的相

11、對速度。 在低水活度下把胰凝乳蛋白酶固定在聚酰胺載體AccureI PA6上，水解反應被抑制，卻有利于醇解反應進行。這是固定化后發生的另外一種情況。 一般來說，載體要選擇疏水性基質，目的是為了有利于在有機溶劑中反應。 如用具有高氧滲透性的硅聚合物比較好。 用固定化材料，還應考慮載體的酶負載量、顆粒大小、表面積、內部孔徑大小、酶與載體間的相互作用等。 這與前面固定化時講的要求，出發點不一樣。231.水溶性有機溶劑 甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、甘油、正丁醇等2.水不溶性有機溶劑 石油醚、三氯乙烷、乙酸乙酯、苯、己烷等 在這些酶反應溶劑的選擇中，介質的組成一般可有四種： 1）單相共溶劑系統（水與能與水

12、相溶的有機溶劑） 2）雙相溶劑系統（水與跟水不相溶的有機溶劑） 3）低水有機系統 4）反向微團系統242526在上面四種系統中，1-3用的多原因是： 1）因為這幾個系統容易建立 2）產物和酶容易回收其中又以低水有機系統為好，因為適合其中又以低水有機系統為好，因為適合疏水的有機溶劑和耐高溫（增加穩定性）。疏水的有機溶劑和耐高溫（增加穩定性）。 缺點：擴散差，所以反應速度慢等。缺點：擴散差，所以反應速度慢等。 克服的方法： 選用反向微團系統。2728那么，有機溶劑最終是如何影響酶反應的？那么，有機溶劑最終是如何影響酶反應的？一般解釋有如下幾種：一般解釋有如下幾種：1）通過底物、產物在水相和有機溶劑

13、中分配，必然影響到底物、產物在酶必需水在水層中的濃度，這樣，自然影響到酶的反應速度。2） 必需水對特定的酶是一定的。如果有機溶劑與酶的必需水作用，奪取酶的必需水，一定影響酶的活性。 如果是極性強的有機溶劑，奪取酶的必需水就多，酶就可能最終失活。 如果是一般的有機溶劑，奪取酶的必需水不明顯，就最適合酶在這類有機溶劑中反應。 29 有一個例子十分明顯。 胰凝乳蛋白酶，在辛烷中的反應速度比吡啶中 快104倍。酶活性隨著疏水性增加而增加。 3）有機溶劑本身的影響。 (1)有機溶劑使底物基態能級下降或使酶-底物復合物能級升高，從而增大酶反應的活化能來降低酶反應速度； (2)有機溶劑分子進入酶活性中心，降

14、低活性中心內部極性并加強底物與酶之間形成的氫鍵，使酶活性下降； (3)有機溶劑侵人會造成酶的三級結構變化，間接改變酶活性中心結構來影響酶活性。30正由于以上原因，正確選擇有機溶劑顯得十分重要。所以必須考慮以下幾種因素：（1）溶劑與反應的相容性。例如，酶催化糖修飾反應，必須在親水性的有機溶劑（加二甲基甲酰胺等）中進行。若使用疏水性有機溶劑，底物不溶解，酶促反應不能發生。（2）溶劑對主要的反應應該是惰性的。 （3）溶劑的密度、粘度、表面張力、毒性、廢物的處理和成本等。但是普遍認為最佳溶劑因底物而異。 即一種溶劑在辛醇水兩相間分配系數的常用對數值(lgP)。 P大，酶活性大，所需要的水量少。31 后

15、來又有用臨界流體反應體系，在產物中不留下任何溶劑。即在臨界溫度、臨界壓力下反應。 如用CO2作介質，進行多酚氧化酶的催化反應，反應后CO2全部從反應體系中自然去除。 還有用超臨界CO2作介質，進行脂肪酶的催化反應，可以把壓力提高到適當的數值，使轉酯反應大大加快。3233 圖中表示了與氣相、液相、固相區相對應的超臨界流體區 圖中直線表示以CO2的密度為第三參數的Tp關系。CO2密度隨壓力與溫度的增減而產生較大的變化。 如溫度為37時，壓力由7.2MPa（p0.21g/cm3）上升到10.3Mpa（p=0.59g/ cm3），密度增加了2.8倍。 當壓力為10.3MPa時，溫度由92下降到37 ，

16、也可發生相應的密度變化。 在臨界區的附近，壓力和溫度的微小變化，引起流體的密度大幅度的變化。34 因為在有機介質中的最適pH與水溶液中的最適pH的酶反應是一樣的，所以在進行酶的凍干時，可以在最適pH的緩沖液中凍干出來，再進行有機系統的反應。 這樣，可以使酶在有機溶劑中反應的微環境具有溶液酶的最適pH環境。 35總起來講基本上遵循米氏方程的動力學。總起來講基本上遵循米氏方程的動力學。但也有一些影響。但也有一些影響。361）一般被認為酶更加穩定，因為對熱的穩定性提高。 如豬胰脂肪酶在醇和酯中進行反應，100溫度下反應,半衰期12小時以上, 活性比25時高好幾倍。胰凝乳蛋白酶在60水中，幾分鐘就會有

17、失活。而在辛烷中，半衰期有幾個小時。2）存儲酶的存儲穩定性提高胰凝乳蛋白酶20的水中，半衰期只有幾天。而在辛烷中，半衰期有6個月，活性全部不損失。 37a)單相共溶劑系統中單相共溶劑系統中 對酶的影響作用主要是如下： 1) 有機溶劑直接作用于酶，破壞維持酶活性構象的氫鍵、疏水鍵、水化層，酶變性失活。 一般有隨著有機溶劑濃度上升,活性下降的一般規律。 2)但有些酶，有機溶劑的濃度上升，酶活性反而上升，到一定濃度， 酶活性達最高，如再提高濃度，酶活性反而下降。 如胰蛋白酶在1,4-丁二醇中最適濃度80%豬心線粒體ATPase，在乙醇中最適濃度10% EcoRI內切酶在甘油中最適濃度為20%38 有

18、些酶反應會發生變化，如沉淀在玻璃球上的膽固醇氧化酶在有機溶劑中測定膽固醇，速度只是水中的1025%。又如酵母醇脫氫酶在1%的水和醋酸丁酯中反應，酶活性是水中的1-60%左右。 總之，酶活性隨著水活度的大小而不同，而水活度一定，酶活性會隨著載體不同而不同，這是一般的規律。39在這個系統中有些酶活性會上升。漆酶（Laccase）與水中的漆酶比較，它水解鄰苯二酚氧化的最大速率，催化活性大100倍以上。分析原因：分析原因： 主要是依賴于微團的水化程度，因為水與表面活性劑存在的摩爾比大小。反向微團脂肪酶的最適水化程度R=9.8。 過氧化物酶、酸性磷酸酶在反向微團中的活性 高成萬倍(與水中比)。把活性高于

19、水中的叫超活性超活性40 分析這種現象的理論很多，主要的解釋是： 1）微團的水化程度W=水/表面活性劑其水化程度的最佳值與酶活性 最大值成正比例關系。 2）W值最佳時，微團內徑=酶分子直徑，認為酶的超活性超活性是由酶分子 外面的表面活性劑這一個外殼的較大的剛性所引起。41一般產生的專一性減弱，被認為由二種原因引起：1)有疏水騷動力作用的結果。2)酶活性中心剛性的增強引起。 例如：脂肪酶是水解脂肪-脂肪酸，而在有機介質中有合成肽鍵的功能。42 水解酶類在水介質中，水的濃度為55.5M/L，反應是向右，即水解的方向。而在有機介質中，平衡向左，向合成的方向進行。而且已經應用在工業生產上，如Aspat

20、ame(天冬二肽甜味劑)的酶法合成。43 是一種能夠記住酶的活性構象的一種能力。枯草桿菌蛋白酶可以從含有競爭性抑制劑的水溶液中凍出來，再把抑制劑去除，在辛烷中進行酶反應，其速度比水溶液中凍出來的活性高100倍。這只要是抑制劑導致酶活性中心構象發生變化，形成高活性的構象形式。去除抑制劑后，酶在有機介質中保持酶的高度剛性而得到保持。 舉一個了例子：正丁醇沉淀 -凝乳蛋白酶和N-乙酰-D-色氨酸間的酶-抑制劑復合物，凍干轉入環己烷，可以催化合成 N-乙酰-D-色氨酸乙酯。然而在水中卻失去對 D型氨基酸的專一性。44 那是因為酶分子接受了D型氨基酸的構象被凍結，并且在有機溶劑中能夠保持，而在水中酶回復到它的天然構象，又催化L型氨基酸酯化。 酶的另一個記憶是記住酶的記住酶的pH 因為pH決定了酶分子上有關基團的電離狀態，這種狀態在凍干和在有機溶液中能夠保持,并發揮作用。45