1、組織工程骨軟骨復合體的研究進展及展望                    作者：楊強，彭江 綜述 盧世璧，袁玫 【關鍵詞】  軟骨      隨著材料科學、細胞生物學、力學生物學以及生物反應器技術的進步，采用組織工程的方法構建合適形狀和大小的組織工程骨軟骨復合體為骨軟骨復合缺損的修復提供

2、了新的希望。本文將對這一領域進行綜述。    1  支  架    目前關于組織工程骨軟骨體支架材料的設計原則有很大差異，主要分為以下4類：    1.1  僅采用骨支架，軟骨部分不采用支架    即直接將高密度的軟骨細胞或成軟骨細胞直接種植到骨支架上方，在體外培養或者植入體內修復骨軟骨復合缺損。Wang1等將高密度的豬原代軟骨細胞分別種植到3種支架材料P(L)LA、P(D，L

3、)LA、膠原羥基磷灰石(Col-HA)復合支架材料上，在體外用閉合的靜態生物反應器培養7周后，構建出的骨軟骨復合體的軟骨部分富含型膠原和糖胺多糖(GAG)，軟骨部分與骨支架材料結合良好。Waldman2等同樣將牛軟骨細胞高密度種植到聚磷酸鈣(calcium polypho sphate，CPP)支架上，體外成功培養出骨軟骨復合體。Kandel3等用相同方法構建組織工程骨軟骨復合體，體外培養8周以后植入到羊股骨髁間窩遠端的骨軟骨缺損，組織工程骨軟骨復合體與周圍的骨軟骨床愈合良好，并且其生物力學性能有了很大的提高。    TULI4采用人

4、骨髓來源的間充質祖細胞，誘導成軟骨后在離心管中做成高密度的細胞片，然后將PLA支架壓于其上，然后將誘導成骨的細胞種植到PLA支架中，組織學結果表明生成了軟骨樣組織和骨樣組織，骨、軟骨結合部界面跟正常骨、軟骨結合部類似。    1.2  骨與軟骨部分分別采用適合骨、軟骨構建的不同的支架材料，然后在體外培養或者手術植入時組裝成一體化雙層支架    分別培養組織工程骨、軟骨，然后用粘合劑粘合、縫合或者順序植入等方法將組織工程骨、軟骨部分組裝成組織工程骨軟骨復合體。Kreklau5等報道將軟骨細胞纖維蛋

5、白懸液滴加到聚乙交酯(PGA)和左旋聚丙交酯(PLLA)共聚物支架，置于天然珊瑚(Biocoral)或人工合成的碳酸鈣材料(Calcite)上，并用纖維蛋白膠和凝血酶粘合固定，用灌注式生物反應器體外培養成雙層骨軟骨復合物，組織學檢查見軟骨部分有基質分泌，骨、軟骨界面結合良好。GAO6等利用鼠骨髓來源的間充質干細胞分別向成骨與成軟骨誘導分化以后分別種植到多孔陶瓷材料和透明質烷衍生物(HYAFF-11)材料，兩者之間的界面用纖維蛋白粘合，植入裸鼠皮下培養，生成組織工程骨軟骨復合體，但是生成的軟骨組織為纖維軟骨。    Schaefer7等將牛的軟骨細胞接種到

6、PGA非編織纖維網狀支架，將骨膜成骨細胞接種到聚丙交酯聚乙交酯共聚物(PLGA)和聚乙二醇(PEG)的混合物支架，分別培養組織工程骨、軟骨，然后用縫線縫合的方法成功構建組織工程骨軟骨復合體。李旭升8等也采用無創傷線縫合的方法組裝分別培養的組織工程骨、軟骨部分，構建出骨軟骨復合體，但是構建的骨、軟骨部分之間有大量纖維組織，沒有解決骨軟骨構件間分層的問題。Schaefer9等用將兔異體軟骨細胞種植在PGA支架上，體外培養46周以后，與Collagraft(一種骨替代材料，含HA)縫合后構建成骨軟骨復合組織，成功修復了兔股骨髁間窩(非負重區)骨軟骨缺損，但是組織工程軟骨部分與周圍宿主軟骨整合欠佳。&

7、#160;   GAO10等采用順序植入可注射鈣磷復合物以及透明質烷(UA)海棉的方法修復了兔膝關節負重區骨軟骨缺損。ShaomI等將骨髓來源的間充質干細胞(BMSC)分別種植到三維多孔的聚己酸內酯(PCL)支架以及磷酸三鈣加強的聚己酸內酯(TCP、PCL)支架上，順序植入兔股骨髁負重區骨軟骨缺損，組織學結果顯示成功的修復了骨軟骨缺損，生物力學評估表明6個月時組織：工程軟骨的楊氏模量接近正常軟骨的水平。    1.3  骨軟骨部分采用相同的支架材料構建的單層支架   

8、0;Cao12等利用熔融沉積技術(FDM)用多孔聚已酸內酯(PCL)材料制造出多孔蜂窩狀 的支架材料，分為兩部分，分別種植成骨誘導的入骨髓基質細胞和人肋軟骨細胞，掃描電鏡結果表明骨、軟骨部分有不同的基質分泌。Alhadlaq1315等將鼠骨髓基質干細胞分別向成軟骨與成骨方向誘導分化，然后用聚乙二醇(PEG)水凝膠懸液包裹，順序倒入具有人顳下頜關節突形狀的模具中，在裸鼠皮下成功培養4周后組織學觀察到分層的軟骨樣和骨樣組織。    1.4  骨軟骨部分采用不同的支架材料構建的一體化的雙層支架   &

9、#160;直接構建骨軟骨部分結合良好的一體化雙層支架，這種支架的優點是：(1)骨、軟骨支架部分結構不同，分別適合骨、軟骨生長的不同要求；(2)骨、軟骨部分結合良好，解決了在體外培養或者植入體內時骨、軟骨分層的問題。這種一體化的組織工程骨軟骨復合支架，可能是以后發展的方向。    Chang CH16利用明膠和煅燒骨制備了骨、軟骨支架部分結合良好的新型骨軟骨雙層支架，作為軟骨組織支架的明膠部分滲透到作為骨支架的煅燒骨中，達到良好的結合。將豬軟骨細胞接種到明膠支架部分，放在特別設計的雙腔生物反應器中培養2周或者4周，組織學檢查表明骨軟骨復合體的軟骨

10、部分為透明軟骨病且有陷窩形成。Hung CT1719等用松質骨和包裹軟骨細胞的瓊脂糖凝膠體外培養構建出骨軟骨復合體。Tanaka20等用膠原凝膠覆蓋在多孔的D-TCP構建雙層支架，在膠原凝膠中種植軟骨細胞部分修復了兔關節骨軟骨缺損。這幾項研究的共同點就是采用凝膠作為軟骨支架，利用凝膠能滲入到多孔骨支架材料的特性，構建出的骨軟骨復合組織不易分層，構建出結合良好的組織工程骨軟骨復合體。    Sherwood21等利用三維打印技術(TheriForm TM)制造出的新型骨軟骨三維支架，體外成功培養出組織工程骨軟骨復合物。支架的軟骨部分采用

11、D，LPLGALPLA材料，孔隙率為90，孔徑為106150 m；骨部分采用LPLGATCP材料，孔隙率為55，孔徑為125150 m。特別新穎的是在骨、軟骨支架交界區組成成分含量、氣孔率等方面形成梯度變化，這樣可以避免支架在體外培養和體內植入時發生界面分層，有利于新生的骨與軟骨組織之間形成良好界面；并且骨支架部分設計成苜蓿葉形狀，體內植入時增加了支架材料與周圍骨質的接觸面積，增強了抗扭轉應力。解放軍總醫院骨科研究所張東22等將兔骨髓基質細胞成軟骨誘導以后種植在一體化不同孔隙率的雙層PLGA支架材料上構建組織工程骨軟骨復合體，成功的修復兔膝關節軟骨及軟骨下骨缺損。 

12、;   2  種子細胞    關于種子細胞的接種類型具體分為以下4類：    2.1  只接種用于軟骨構建的種子細胞    在修復骨軟骨缺損時，由于骨髓中含有大量的骨源性細胞，因此組織工程骨軟骨復合體可以只接種用于軟骨組織構建的種子細胞。Wang1waldman2Sherwood21等僅用軟骨細胞為種子細胞在體外構建了骨軟骨復合體，或用于體內骨軟骨缺損的修復。但是軟骨細胞本身為成熟細胞，增殖能力較低，并且存

13、在去分化現象，分泌基質能力降低，并且在實際臨床應用中存在來源有限、多次手術的問題23，可向軟骨分化的干細胞如骨髓基質干細胞或者脂肪干細胞24是一種較好的選擇。    2.2  骨軟骨部分分別接種用于骨、軟骨構建的組織細胞    Schaefer7等采用軟骨細胞和骨膜細胞，Cao12等用人肋軟骨細胞和人骨髓來源的間充質干細胞，Schek25，26等采用豬的原代軟骨細胞與腺病毒轉染BMP7基因的人成纖維細胞為種子細胞在體外成功構建出骨軟骨復合體。    2.3

14、  接種可誘導成骨與軟骨的干細胞    Tuli4等用人骨髓來源的間充質組細胞分別向軟骨和骨方向誘導，成功構建出骨軟骨復合體。采用單一的多能干細胞作為種子細胞輔以誘導成骨、成軟骨，并在支架材料上誘導骨軟骨復合組織形成的方法，雖然調控過程復雜，但是其過程類似于體內骨軟骨發育過程，故可能是以后發展的方向。    2.4  單純支架材料，不接種種子細胞    Fukuda27等利用羥基磷灰石(HA)噴涂的超高分子量聚乙烯纖維制造的三維支架，用

15、I型膠原和FGF-2浸漬后，用于修復兔膝關節髁間窩的骨軟骨缺損，48周后有透明軟骨樣組織和新的軟骨下骨生成?？梢?，即使不接種細胞，在支架材料中結合生長因子也可用于骨軟骨缺損的修復。    3  生物反應器技術在骨軟骨復合體培養中的應用    生物反應器在組織工程中的研究主要包括：(1)在三維支架上均勻種植種子細胞；(2)促進組織工程產品的營養供應；(3)模擬體內力學環境施加一定力學刺激；(4)通過自動化和標準化控制組織工程產品的生產過程，降低生產成本，大規模生產。  

16、0; Chang16等創新性設計了專門用于骨軟骨復合物共同培養的雙腔攪拌灌注式生物反應器，具有2個腔，中間用硅膠膜隔開，骨軟骨復合支架放置在硅膠膜的孔中，通過磁棒的攪動和培養基的灌注增加營養供應，不同的種子細胞(如軟骨細胞和成骨細胞)可以在硅膠膜隔開的骨軟骨支架中以不同的培養基培養，并且可將多能干細胞接種到骨軟骨支架后在生物反應器的2個腔中分別向成骨、成軟骨兩個方向誘導。Kreklau5研制的灌注式生物反應器也成功地培養出了骨軟骨復合組織。    4  組織工程化全關節或半關節的構建進展   &

17、#160;利用組織工程的方法構建大面積的組織工程化骨軟骨復合體甚至一個組織工程化半關節或者全關節，也是一個重要的研究方向。    Isogai28等將預制成遠節、中節指骨外形的PGA和PLLA共聚物用骨膜包裹構建中、遠節指骨，呈關節軟骨外形的PGA材料接種軟骨細胞后培養形成軟骨，PGA接種腱細胞培養形成關節囊，采用縫合方法將各配件組裝起來形成中、遠節指骨與遠側指間關節并植入裸鼠皮下，觀察到具有指骨和關節結構外形的骨、軟骨、關節囊形成，證明了培養人體小關節的可行性。Alhadlaq1315等研制出具有顳下頜關節突形狀和大小的組織工程化骨軟骨復合體。Glow

18、acki29和Feinberg29亦提出采用組織工程骨、軟骨、關節盤構建復雜的顳下頜關節的設想。Schek25,26等利用圖像輔助設計IBD(imagebaseddesign)技術和SFF(solidfreeform)固態自由成型技術制造出了具有顳下頜關節(TMJ)外形的的生物仿生支架，其優點是能夠根據個體化病人的損傷生產出與關節面幾何形狀相匹配的支架，并且能同時控制支架的微結構。Hung18，19等采用計算機輔助設計(CAD)和制造技術制造出的骨軟骨復合組織，軟骨面面積達11.7 cm2，平均厚度達3.4 mm，是迄今為止體外構建最大的具有關節面外形的骨軟骨復合組織。&#

19、160;   5  存在問題    盡管組織工程骨軟骨復合物和組織工程化關節的研究取得了很大進展，但研究中也暴露出一些問題：(1)無論在體外或體內，構建組織的骨、軟骨界面結合欠佳；(2)形成的骨與軟骨組織的質量缺陷，透明軟骨比例少，缺乏正常關節軟骨的分層結構，部分工程化軟骨缺乏表淺的扁平細胞層和潮標等；(3)構建的骨軟骨復合組織的軟骨部分面積受限，機械性能較差，還不能滿足承重的要求，并且能否長期持續存在尚待進一步研究證實，只是短期觀察表明在形態學、生化成分等方面具有軟骨組織結構；(4)組織工程軟骨與周圍宿

20、主軟骨整合欠佳。    6  展  望    構建功能性的組織工程骨軟骨復合物對作者來說是非常大的挑戰，以下幾個方面將是努力的方向：(1)種子細胞，采用單一的多能干細胞作為種子細胞輔以誘導成骨、成軟骨；(2)支架材料，采用第三代生物支架材料，即在控制支架的微結構的基礎上，研究如何在支架材料中結合生長因子或細胞因子更好的促使細胞增殖、分化、成熟，研究如何使骨、軟骨支架材料更好的結合以避免分層，研究如何采用圖像輔助設計(1BD)技術和先進制造技術制造與關節缺損甚至全關節形狀、大小

21、一致的支架；(3)生物反應器技術的應用，研制適合組織工程骨軟骨復合物培養的生物反應器。采用功能組織工程學(Functional tissue  engineering)的方法，模擬體內生化環境和力學環境，利用生物反應器對組織工程化組織施加一定的力學刺激，以提高骨軟骨復合物的生物力學性能，達到植入體內負重的要求?！緟⒖嘉墨I】  1 Wang X，Grogan SP，Rieser F，et alTissue engineering of biphasic ca

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