1、花生絲核菌葉枯病的鑒定肖翔,易賽,張淑娟,徐大高,紀春艷,何藝郡,潘汝謙(華南農業大學資源環境學院廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室,廣東廣州510642摘要:近年來在廣東局部地區發現一種嚴重危害花生葉部的病害,該病害主要病癥為在葉部形成水漬狀病斑,并導致葉片枯死,嚴重影響花生植株生長。在病葉的病健交界處分離獲得一真菌,該真菌菌絲寬度為5.512.3m,近直角分枝,分枝處縊縮,近分枝處有隔膜;菌絲細胞核數目為39個,多為47個;產生褐色不規則形狀菌核,外表粗糙,長寬范圍為0.926.12mm×0.744.96mm。該菌被鑒定為茄絲核菌(Rhizoctonia solani K&

2、#252;hn,有性態為Thanatephorus cucumeris(Genbank登錄號分別為KF053534、KF053535和KF053536,獲得的序列與GenBank中已報道的茄絲核菌(R.sonaliAG-1融合群的菌株E53、YN-1和H5-526(Genbank登錄號分別為KC285892、KC285893和AY154301同源性高達99%100%。離體葉片和盆栽接種,均獲得與田間相似的癥狀,并在罹病葉片上再次分離到同一種真菌。該病害被定名為花生絲核菌葉枯病。關鍵詞:花生;絲核菌葉枯病;茄絲核菌中圖分類號:S435.652文獻標識碼:A文章編號:1004-874X(20132

3、2-0090-04 Identification of peanut Rhizoctonia foliar blightXIAO Xiang,YI Sai,ZHANG Shu-juan,XU Da-gao,JI Chun-yan,HE Yi-jun,PAN Ru-qian (College of Natural Resources and Environment Guangdong Province Key Laboratory of Microbial Signals and Disease Control,South China Agricultural University,Guangz

4、hou510642,ChinaKey words:peanut;Rhizoctonia foliar blight;Rhizoctonia solani花生(Arachis hypogaea L.是廣東省重要的經濟作物和油料作物。2010年廣東全省花生種植面積達32.85萬hm2,總產量為87.13萬t。而花生病害已成為影響花生產量的重要因素之一1。廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室于20112012年于廣東地區發現一種花生葉部病害,該病害主要造成花生葉片變褐枯萎,嚴重影響花生植株生長。我們對該病害癥狀進行描述,并通過病原物的分離培養、形態學觀察、生物學性狀研究、致病性測定及病菌基因組中

5、ITS序列檢測分析,對病原菌進行鑒定,以期為該病害的防控提供科學依據。1材料與方法1.1試驗材料收稿日期:2013-07-07基金項目:廣東省科技計劃項目(2011B020308013作者簡介:肖翔(1988-,男,在讀碩士生,E-mail:superwcboy 90供試花生品種為仲愷花99,由仲愷農業工程學院鄭奕雄教授提供。1.2試驗方法將病原菌菌株接種至PDA平板,并以45°角將蓋玻片插入PDA培養基中,于25黑暗條件下培養;待菌絲生長至蓋玻片的1/3處,輕輕取出蓋玻片,置于載玻片上,于光學顯微鏡下(400×用測微尺測量菌絲寬度并觀察菌絲形態,每個玻片測10個菌絲的寬度

6、,設置3個重復,并求出平均值。同時用番紅O-KOH染液對菌絲染色23min后蓋片觀察,每個玻片測10個細胞的細胞核數,設置3個重復,并求出平均值2。將病原菌菌株移至PDA平板上活化后,用打孔器從菌落邊緣打取菌餅(直徑0.5cm,接種至PDA平板中央,置于25黑暗條件下培養,24h后用直尺測定菌落直徑,并計算菌絲每小時的生長速率,設置3個重復。菌落直徑測量后,各菌落置于相同條件下繼續培養2周,觀察記錄菌落顏色和形狀、菌核顏色變化及菌核在菌落上形成的形狀。同時收集每個培養皿(直徑9cm,培養基約15mL中的所有菌核:測定菌核的數量;在顯微鏡下(40×用測微尺測量菌核的大小,較大的菌核用游

7、標卡尺進行測量(隨機測量30個菌核;將所有菌核置于50下烘干后,稱量每皿菌核的總干重,并根據每皿的菌核數換算成單個菌核干重。2結果與分析2.1癥狀該病害在花生各生育期均可造成危害,以成株期發生為主。苗期為害,可導致幼苗莖基部腐爛和立枯。成株期危害,主要侵染花生的復葉,包括小葉片、葉柄、葉枕和托葉等部位。受害小葉片早期形成不規則水漬狀病斑,淺褐色、暗褐色至黑色。高濕條件下,病斑擴展迅速,整個小葉片變黑褐色腐爛并下垂。在天氣干燥時,病斑停止擴展,形成邊緣明顯的褐色或黑褐色枯死斑,病斑中央灰白色;枯死的病小葉常常卷縮。病葉間常有菌絲相連,致使病葉常不脫落。葉柄、葉枕和托葉受害后變褐色或黑褐色腐爛。由

8、于病原菌的菌絲體沿莖干攀援,因此,在接近莖干的葉柄基部和托葉常常容易受害。潮濕條件下,?？梢娤∈璧陌咨梁稚木z體平鋪在罹病葉片上。后期于罹病部位可形成白色至褐色半球狀菌核(圖1,封二,菌核表面粗糙;菌核由菌絲聯系附著在植物表面,易脫落。病害在田間常常有明顯的發病中心。在惠州市、河源市和陽江市等地均有分布。在鄰近廣東的江西贛州也有分布。2.2病原菌的形態和生物學性狀病原菌在PDA培養基上形成圓形菌落。菌絲初期白色,后轉為淺褐色。菌絲粗壯,寬度為5.512.3m。菌絲近直角分枝,分枝處縊縮,近分枝處有隔膜(圖2C,封二。菌絲生長迅速,平均生長速率介于2.02.3 mm/h。菌絲細胞均為多核,細

9、胞核數目為39個,多為47個。病原菌不產生分生孢子,能形成白色至褐色的菌核,每皿產菌核1634個,靠近培養皿中央分布(圖2A,封二。菌核形狀不規則,長寬范圍約為0.926.12 mm×0.744.96mm,單菌核干重為1.783.77mg,菌核表面粗糙(圖2B,封二。根據形態特征,將該病原菌鑒定為茄絲核菌(Rhizoctonia solani Kühn3。2.3病原菌的致病性鑒定離體葉片接種試驗中,保濕2d后,接種葉片上鋪滿白色至淺褐色菌絲,小面積葉面變褐;保濕4d 后,接種葉片部分區域變黑,菌絲增多;保濕7d后,多數接種葉片大面積變黑腐爛,部分菌絲體糾結成91M123CK

10、2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM:DL2000Marker;1-3:菌株JXWD5,菌株GDHZ12,菌株GDHY38;CK:陰性對照圖3菌株ITS序列PCR電泳圖譜圖4基于ITS 序列構建的病原菌的系統發育樹白色小團并形成褐色菌核。盆栽植株接種試驗中,接種后2d后,接種處長出菌絲,并延枝條延伸;接種后4d,葉芽處產生小型不規則病斑,菌絲延伸至頂部;接種后7d,部分葉片及枝條基部變褐腐爛;接種后14d,大部分葉片枯萎脫落,部分枝條枯萎,并于受害葉片上形成白色至褐色菌核。接種試驗結果表明發病癥狀與田間觀察癥狀一致。從接種葉片及接種植株上再次分離到的病菌與供試菌株

11、培養性狀及形態特征一致,經柯赫氏法則驗證,確認供試菌株為該病害的病原菌。2.4病原菌的分子鑒定采用真菌ITS區域通用引物ITS1和ITS4對代表性菌株JXWD5、GDHZ12及GDHY38的ITS序列進行擴增,獲得大小約為700bp的DNA片段,測序結果表明該片段實際大小為720bp(圖3。將測序后的病原菌ITS序列提交至GenBank數據庫(登錄號分別為KF053534、KF053535和KF053536。將獲得的病原菌ITS序列和GenBank中已報道的ITS序列比對,結果表明:病原菌菌株ITS序列與已知的茄絲核菌(R.sonali AG-1融合群的菌株E53、YN-1和H5-526(Ge

12、nBank 登錄號分別為KC285892、KC285893和AY154301同源性高達99%100%。從系統發育樹(圖4可以看出,菌株GDSH12和GDSH38與茄絲核菌(R.solaniAG-1融合群的菌株E53、YN-1及H5-526聚在一個末端聚類簇上;菌株JXWD5與這3個菌株相鄰,但與茄絲核菌(R.Solani AG-1融合群的菌株在同一分支上。茄絲核菌(R. solaniAG-4融合群的菌株分屬于不同分支。結果表明病原菌屬于茄絲核菌AG-1融合群。3結論與討論早在1976年,廣東電白縣發生花生紋枯病,該病的癥狀與水稻紋枯病的癥狀極為相似,病原菌被鑒定為水稻紋枯病菌Pellicula

13、ria sasakii(ShiraiIto,無性階段為絲核菌(R.solani Palo4。在南方地區,張曉葵等51983年報道湖南湘潭和益陽等地由水稻紋枯病菌(R.solani kühn引起花生紋枯病日益嚴重;唐乾忠61985年報道四川合江縣花生紋枯病日趨嚴重;孫曉陽71993年報道花生紋枯病是四川南部縣新上升的病害;但是,這些報道都沒有進行病原菌的鑒定。孟憲曾81985年也引用了廣東農林學院的材料,記載了由佐佐木薄膜革菌P.sasakii(ShiraiIto引起的花生紋枯病。張明厚91996年將花生紋枯病的病原菌記載為瓜亡革菌Thanatephorus cucumeris(Fra

14、nkDonk,無性階段為立枯絲核菌(R.solani Kühn。茄絲核菌過去被稱為立枯絲核菌。因為茄絲核菌引起水稻紋枯病,因此又被稱為水稻紋枯病菌。但將茄絲核菌引起的花生葉部病害稱為“花生紋枯病”,這個名稱其實并不貼切,不宜繼續使用。因為,茄絲核菌在花生的葉片上的病斑是葉部組織的快速死亡,并沒有“紋枯”的癥狀特征。在我國北方,1976年在遼寧省的旅大地區,首次發現由絲核菌引起的花生葉腐病,但是,沒有對病原菌進行鑒定10。杜化仿等11也使用了花生葉腐病這個名稱。Yan等122013年報道,茄絲核菌(R.solani的AG-1-IA融合群引起花生葉腐病(peanut leaf rot。從

15、這些報道來看,花生葉腐病這個病害名稱反映了病害癥狀的主要特點。徐秀娟等13報道由絲核菌屬(Rhizoctonia sp.引起的花生菌核病,病害主要危害葉片,產生不規則的水漬狀病斑,導致大量落葉;病組織上有白色菌絲和黑褐色不規則形狀的菌核。徐秀娟等14-15進一步鑒定了花生菌核病的病原菌是立枯絲核菌(R.solani,有性態是瓜亡革菌(T.cucumeris。但是,徐秀娟等強調該病害與孟憲曾描述的花生紋枯病不同,并且與由茄絲核菌引起的花生立枯病和葉腐病也不同:葉腐病的病原菌的菌絲體分支多為直角,27下,在PDA培養基上形成菌核的時間為57d;而菌92核病的菌絲分支多為銳角;25下,在PDA培養基

16、上形成菌核的時間為3d。鄢洪海等16則將花生菌核病這個病害稱為葉部菌核病,強調該病害主要危害葉部。從這些報道來看,花生菌核病或者花生葉部菌核病的癥狀和花生葉腐病是相似的。國外的研究表明,茄絲核菌(R.solani在花生的任何部位均可危害,以枝腐(limb rot為主,在葉片上的病害被稱為葉枯病(foliar blight17-19。本文所報道的病害主要危害花生葉片,導致大量葉片快速枯死,根據這一特征,參考國外的病害名稱,我們將該病害鑒定為花生絲核菌葉枯病(Rhizoctonia foliar blight of peanut。美國報道花生枝腐與葉枯病的病原菌主要是茄絲核菌的AG-4融合群18,

17、20。Yan等12報道在山東省引起花生葉腐病的茄絲核菌為AG-1-IA融合群。本研究結果表明廣東花生絲核菌葉枯病的病原菌與茄絲核菌的AG-1融合群同源,但該菌是否為茄絲核菌的AG-1融合群還需通過試驗進一步確認。參考文獻:1鄭奕雄.南方花生產業技術學M.廣州:中山大學出版社,2009:1-38,236-248.2黃江華,楊媚,周而勛,等.絲核菌細胞核染色技術的研究J.仲愷農業技術學院學報,2001,14(4:13-17.3陸家云.植物病原真菌學M.北京:中國農業出版社,2001:360-363.4廣東農林學院植物病理學教研組.經濟作物病害防治M.廣州:廣東人民出版社,1977:28-32.5張

18、曉葵,劉玲.水稻紋枯病菌危害玉米、大豆、花生的情況及防治建議J.湖南農業科學,1983(2:45-46.6唐乾忠.花生紋枯病的防治J.四川農業科技,1985(3:26-27.7孫曉陽.花生紋枯病發生規律與測報技術初探J.云南農業大學學報,1993,8(3:144-145.8孟憲曾.花生病害M.北京:農業出版社,1985:92-94.9張明厚.油料作物病害M.北京:中國農業出版社,1995:174-175.10中國科學院林業土壤研究所和二十里堡公社農業站.花生葉腐病J.新農業,1978(15:13.11杜化仿,張茹琴,夏淑春,等.花生葉腐病菌毒素提取及致病性研究J.青島農業大學學報(自然科學版,

19、2011,28(2: 99-102.12Yan H H,Zhang R Q,Du H F,et al.Rhizoctonia solaniidentified as the disease causing agent of peanut leaf rot in ChinaJ.Plant Disease,2013,97(1:140.13徐秀娟,遲玉成,宋文武,等.花生菌核病的研究J.花生科技,1999(S:430-432.14徐秀娟,趙志強,宋文武,等.花生菌核病及其防治研究J.山東農業大學學報(自然科學版,2003,34(1:33-36. 15徐秀娟,趙志強,王佩圣,等.花生菌核病病原分類及其特性研究J.廣西農業科學,2004(3:211-212.16鄢洪海,趙志強,盧鈺,等.花生葉部菌核病流行規律及生物防治初報J.花生學報,2006,35(3