1、花生絲核菌葉枯病的鑒定肖翔,易賽,張淑娟,徐大高,紀(jì)春艷,何藝郡,潘汝謙(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州510642摘要:近年來(lái)在廣東局部地區(qū)發(fā)現(xiàn)一種嚴(yán)重危害花生葉部的病害,該病害主要病癥為在葉部形成水漬狀病斑,并導(dǎo)致葉片枯死,嚴(yán)重影響花生植株生長(zhǎng)。在病葉的病健交界處分離獲得一真菌,該真菌菌絲寬度為5.512.3m,近直角分枝,分枝處縊縮,近分枝處有隔膜;菌絲細(xì)胞核數(shù)目為39個(gè),多為47個(gè);產(chǎn)生褐色不規(guī)則形狀菌核,外表粗糙,長(zhǎng)寬范圍為0.926.12mm×0.744.96mm。該菌被鑒定為茄絲核菌(Rhizoctonia solani K&

2、#252;hn,有性態(tài)為Thanatephorus cucumeris(Genbank登錄號(hào)分別為KF053534、KF053535和KF053536,獲得的序列與GenBank中已報(bào)道的茄絲核菌(R.sonaliAG-1融合群的菌株E53、YN-1和H5-526(Genbank登錄號(hào)分別為KC285892、KC285893和AY154301同源性高達(dá)99%100%。離體葉片和盆栽接種,均獲得與田間相似的癥狀,并在罹病葉片上再次分離到同一種真菌。該病害被定名為花生絲核菌葉枯病。關(guān)鍵詞:花生;絲核菌葉枯病;茄絲核菌中圖分類號(hào):S435.652文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1004-874X(20132

3、2-0090-04 Identification of peanut Rhizoctonia foliar blightXIAO Xiang,YI Sai,ZHANG Shu-juan,XU Da-gao,JI Chun-yan,HE Yi-jun,PAN Ru-qian (College of Natural Resources and Environment Guangdong Province Key Laboratory of Microbial Signals and Disease Control,South China Agricultural University,Guangz

4、hou510642,ChinaKey words:peanut;Rhizoctonia foliar blight;Rhizoctonia solani花生(Arachis hypogaea L.是廣東省重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物。2010年廣東全省花生種植面積達(dá)32.85萬(wàn)hm2,總產(chǎn)量為87.13萬(wàn)t。而花生病害已成為影響花生產(chǎn)量的重要因素之一1。廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室于20112012年于廣東地區(qū)發(fā)現(xiàn)一種花生葉部病害,該病害主要造成花生葉片變褐枯萎,嚴(yán)重影響花生植株生長(zhǎng)。我們對(duì)該病害癥狀進(jìn)行描述,并通過(guò)病原物的分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、生物學(xué)性狀研究、致病性測(cè)定及病菌基因組中

5、ITS序列檢測(cè)分析,對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定,以期為該病害的防控提供科學(xué)依據(jù)。1材料與方法1.1試驗(yàn)材料收稿日期:2013-07-07基金項(xiàng)目:廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011B020308013作者簡(jiǎn)介:肖翔(1988-,男,在讀碩士生,E-mail:superwcboy 90供試花生品種為仲愷花99,由仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院鄭奕雄教授提供。1.2試驗(yàn)方法將病原菌菌株接種至PDA平板,并以45°角將蓋玻片插入PDA培養(yǎng)基中,于25黑暗條件下培養(yǎng);待菌絲生長(zhǎng)至蓋玻片的1/3處,輕輕取出蓋玻片,置于載玻片上,于光學(xué)顯微鏡下(400×用測(cè)微尺測(cè)量菌絲寬度并觀察菌絲形態(tài),每個(gè)玻片測(cè)10個(gè)菌絲的寬度

6、,設(shè)置3個(gè)重復(fù),并求出平均值。同時(shí)用番紅O-KOH染液對(duì)菌絲染色23min后蓋片觀察,每個(gè)玻片測(cè)10個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核數(shù),設(shè)置3個(gè)重復(fù),并求出平均值2。將病原菌菌株移至PDA平板上活化后,用打孔器從菌落邊緣打取菌餅(直徑0.5cm,接種至PDA平板中央,置于25黑暗條件下培養(yǎng),24h后用直尺測(cè)定菌落直徑,并計(jì)算菌絲每小時(shí)的生長(zhǎng)速率,設(shè)置3個(gè)重復(fù)。菌落直徑測(cè)量后,各菌落置于相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)2周,觀察記錄菌落顏色和形狀、菌核顏色變化及菌核在菌落上形成的形狀。同時(shí)收集每個(gè)培養(yǎng)皿(直徑9cm,培養(yǎng)基約15mL中的所有菌核:測(cè)定菌核的數(shù)量;在顯微鏡下(40×用測(cè)微尺測(cè)量菌核的大小,較大的菌核用游

7、標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量(隨機(jī)測(cè)量30個(gè)菌核;將所有菌核置于50下烘干后,稱量每皿菌核的總干重,并根據(jù)每皿的菌核數(shù)換算成單個(gè)菌核干重。2結(jié)果與分析2.1癥狀該病害在花生各生育期均可造成危害,以成株期發(fā)生為主。苗期為害,可導(dǎo)致幼苗莖基部腐爛和立枯。成株期危害,主要侵染花生的復(fù)葉,包括小葉片、葉柄、葉枕和托葉等部位。受害小葉片早期形成不規(guī)則水漬狀病斑,淺褐色、暗褐色至黑色。高濕條件下,病斑擴(kuò)展迅速,整個(gè)小葉片變黑褐色腐爛并下垂。在天氣干燥時(shí),病斑停止擴(kuò)展,形成邊緣明顯的褐色或黑褐色枯死斑,病斑中央灰白色;枯死的病小葉常常卷縮。病葉間常有菌絲相連,致使病葉常不脫落。葉柄、葉枕和托葉受害后變褐色或黑褐色腐爛。由

8、于病原菌的菌絲體沿莖干攀援,因此,在接近莖干的葉柄基部和托葉常常容易受害。潮濕條件下,常可見(jiàn)稀疏的白色至褐色的菌絲體平鋪在罹病葉片上。后期于罹病部位可形成白色至褐色半球狀菌核(圖1,封二,菌核表面粗糙;菌核由菌絲聯(lián)系附著在植物表面,易脫落。病害在田間常常有明顯的發(fā)病中心。在惠州市、河源市和陽(yáng)江市等地均有分布。在鄰近廣東的江西贛州也有分布。2.2病原菌的形態(tài)和生物學(xué)性狀病原菌在PDA培養(yǎng)基上形成圓形菌落。菌絲初期白色,后轉(zhuǎn)為淺褐色。菌絲粗壯,寬度為5.512.3m。菌絲近直角分枝,分枝處縊縮,近分枝處有隔膜(圖2C,封二。菌絲生長(zhǎng)迅速,平均生長(zhǎng)速率介于2.02.3 mm/h。菌絲細(xì)胞均為多核,細(xì)

9、胞核數(shù)目為39個(gè),多為47個(gè)。病原菌不產(chǎn)生分生孢子,能形成白色至褐色的菌核,每皿產(chǎn)菌核1634個(gè),靠近培養(yǎng)皿中央分布(圖2A,封二。菌核形狀不規(guī)則,長(zhǎng)寬范圍約為0.926.12 mm×0.744.96mm,單菌核干重為1.783.77mg,菌核表面粗糙(圖2B,封二。根據(jù)形態(tài)特征,將該病原菌鑒定為茄絲核菌(Rhizoctonia solani Kühn3。2.3病原菌的致病性鑒定離體葉片接種試驗(yàn)中,保濕2d后,接種葉片上鋪滿白色至淺褐色菌絲,小面積葉面變褐;保濕4d 后,接種葉片部分區(qū)域變黑,菌絲增多;保濕7d后,多數(shù)接種葉片大面積變黑腐爛,部分菌絲體糾結(jié)成91M123CK

10、2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM:DL2000Marker;1-3:菌株JXWD5,菌株GDHZ12,菌株GDHY38;CK:陰性對(duì)照?qǐng)D3菌株ITS序列PCR電泳圖譜圖4基于ITS 序列構(gòu)建的病原菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)白色小團(tuán)并形成褐色菌核。盆栽植株接種試驗(yàn)中,接種后2d后,接種處長(zhǎng)出菌絲,并延枝條延伸;接種后4d,葉芽處產(chǎn)生小型不規(guī)則病斑,菌絲延伸至頂部;接種后7d,部分葉片及枝條基部變褐腐爛;接種后14d,大部分葉片枯萎脫落,部分枝條枯萎,并于受害葉片上形成白色至褐色菌核。接種試驗(yàn)結(jié)果表明發(fā)病癥狀與田間觀察癥狀一致。從接種葉片及接種植株上再次分離到的病菌與供試菌株

11、培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征一致,經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證,確認(rèn)供試菌株為該病害的病原菌。2.4病原菌的分子鑒定采用真菌ITS區(qū)域通用引物ITS1和ITS4對(duì)代表性菌株JXWD5、GDHZ12及GDHY38的ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增,獲得大小約為700bp的DNA片段,測(cè)序結(jié)果表明該片段實(shí)際大小為720bp(圖3。將測(cè)序后的病原菌ITS序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(登錄號(hào)分別為KF053534、KF053535和KF053536。將獲得的病原菌ITS序列和GenBank中已報(bào)道的ITS序列比對(duì),結(jié)果表明:病原菌菌株ITS序列與已知的茄絲核菌(R.sonali AG-1融合群的菌株E53、YN-1和H5-526(Ge

12、nBank 登錄號(hào)分別為KC285892、KC285893和AY154301同源性高達(dá)99%100%。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4可以看出,菌株GDSH12和GDSH38與茄絲核菌(R.solaniAG-1融合群的菌株E53、YN-1及H5-526聚在一個(gè)末端聚類簇上;菌株JXWD5與這3個(gè)菌株相鄰,但與茄絲核菌(R.Solani AG-1融合群的菌株在同一分支上。茄絲核菌(R. solaniAG-4融合群的菌株分屬于不同分支。結(jié)果表明病原菌屬于茄絲核菌AG-1融合群。3結(jié)論與討論早在1976年,廣東電白縣發(fā)生花生紋枯病,該病的癥狀與水稻紋枯病的癥狀極為相似,病原菌被鑒定為水稻紋枯病菌Pellicula

13、ria sasakii(ShiraiIto,無(wú)性階段為絲核菌(R.solani Palo4。在南方地區(qū),張曉葵等51983年報(bào)道湖南湘潭和益陽(yáng)等地由水稻紋枯病菌(R.solani kühn引起花生紋枯病日益嚴(yán)重;唐乾忠61985年報(bào)道四川合江縣花生紋枯病日趨嚴(yán)重;孫曉陽(yáng)71993年報(bào)道花生紋枯病是四川南部縣新上升的病害;但是,這些報(bào)道都沒(méi)有進(jìn)行病原菌的鑒定。孟憲曾81985年也引用了廣東農(nóng)林學(xué)院的材料,記載了由佐佐木薄膜革菌P.sasakii(ShiraiIto引起的花生紋枯病。張明厚91996年將花生紋枯病的病原菌記載為瓜亡革菌Thanatephorus cucumeris(Fra

14、nkDonk,無(wú)性階段為立枯絲核菌(R.solani Kühn。茄絲核菌過(guò)去被稱為立枯絲核菌。因?yàn)榍呀z核菌引起水稻紋枯病,因此又被稱為水稻紋枯病菌。但將茄絲核菌引起的花生葉部病害稱為“花生紋枯病”,這個(gè)名稱其實(shí)并不貼切,不宜繼續(xù)使用。因?yàn)?茄絲核菌在花生的葉片上的病斑是葉部組織的快速死亡,并沒(méi)有“紋枯”的癥狀特征。在我國(guó)北方,1976年在遼寧省的旅大地區(qū),首次發(fā)現(xiàn)由絲核菌引起的花生葉腐病,但是,沒(méi)有對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定10。杜化仿等11也使用了花生葉腐病這個(gè)名稱。Yan等122013年報(bào)道,茄絲核菌(R.solani的AG-1-IA融合群引起花生葉腐病(peanut leaf rot。從

15、這些報(bào)道來(lái)看,花生葉腐病這個(gè)病害名稱反映了病害癥狀的主要特點(diǎn)。徐秀娟等13報(bào)道由絲核菌屬(Rhizoctonia sp.引起的花生菌核病,病害主要危害葉片,產(chǎn)生不規(guī)則的水漬狀病斑,導(dǎo)致大量落葉;病組織上有白色菌絲和黑褐色不規(guī)則形狀的菌核。徐秀娟等14-15進(jìn)一步鑒定了花生菌核病的病原菌是立枯絲核菌(R.solani,有性態(tài)是瓜亡革菌(T.cucumeris。但是,徐秀娟等強(qiáng)調(diào)該病害與孟憲曾描述的花生紋枯病不同,并且與由茄絲核菌引起的花生立枯病和葉腐病也不同:葉腐病的病原菌的菌絲體分支多為直角,27下,在PDA培養(yǎng)基上形成菌核的時(shí)間為57d;而菌92核病的菌絲分支多為銳角;25下,在PDA培養(yǎng)基

16、上形成菌核的時(shí)間為3d。鄢洪海等16則將花生菌核病這個(gè)病害稱為葉部菌核病,強(qiáng)調(diào)該病害主要危害葉部。從這些報(bào)道來(lái)看,花生菌核病或者花生葉部菌核病的癥狀和花生葉腐病是相似的。國(guó)外的研究表明,茄絲核菌(R.solani在花生的任何部位均可危害,以枝腐(limb rot為主,在葉片上的病害被稱為葉枯病(foliar blight17-19。本文所報(bào)道的病害主要危害花生葉片,導(dǎo)致大量葉片快速枯死,根據(jù)這一特征,參考國(guó)外的病害名稱,我們將該病害鑒定為花生絲核菌葉枯病(Rhizoctonia foliar blight of peanut。美國(guó)報(bào)道花生枝腐與葉枯病的病原菌主要是茄絲核菌的AG-4融合群18,

17、20。Yan等12報(bào)道在山東省引起花生葉腐病的茄絲核菌為AG-1-IA融合群。本研究結(jié)果表明廣東花生絲核菌葉枯病的病原菌與茄絲核菌的AG-1融合群同源,但該菌是否為茄絲核菌的AG-1融合群還需通過(guò)試驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)。參考文獻(xiàn):1鄭奕雄.南方花生產(chǎn)業(yè)技術(shù)學(xué)M.廣州:中山大學(xué)出版社,2009:1-38,236-248.2黃江華,楊媚,周而勛,等.絲核菌細(xì)胞核染色技術(shù)的研究J.仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào),2001,14(4:13-17.3陸家云.植物病原真菌學(xué)M.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2001:360-363.4廣東農(nóng)林學(xué)院植物病理學(xué)教研組.經(jīng)濟(jì)作物病害防治M.廣州:廣東人民出版社,1977:28-32.5張

18、曉葵,劉玲.水稻紋枯病菌危害玉米、大豆、花生的情況及防治建議J.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),1983(2:45-46.6唐乾忠.花生紋枯病的防治J.四川農(nóng)業(yè)科技,1985(3:26-27.7孫曉陽(yáng).花生紋枯病發(fā)生規(guī)律與測(cè)報(bào)技術(shù)初探J.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1993,8(3:144-145.8孟憲曾.花生病害M.北京:農(nóng)業(yè)出版社,1985:92-94.9張明厚.油料作物病害M.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1995:174-175.10中國(guó)科學(xué)院林業(yè)土壤研究所和二十里堡公社農(nóng)業(yè)站.花生葉腐病J.新農(nóng)業(yè),1978(15:13.11杜化仿,張茹琴,夏淑春,等.花生葉腐病菌毒素提取及致病性研究J.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版,

19、2011,28(2: 99-102.12Yan H H,Zhang R Q,Du H F,et al.Rhizoctonia solaniidentified as the disease causing agent of peanut leaf rot in ChinaJ.Plant Disease,2013,97(1:140.13徐秀娟,遲玉成,宋文武,等.花生菌核病的研究J.花生科技,1999(S:430-432.14徐秀娟,趙志強(qiáng),宋文武,等.花生菌核病及其防治研究J.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版,2003,34(1:33-36. 15徐秀娟,趙志強(qiáng),王佩圣,等.花生菌核病病原分類及其特性研究J.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),2004(3:211-212.16鄢洪海,趙志強(qiáng),盧鈺,等.花生葉部菌核病流行規(guī)律及生物防治初報(bào)J.花生學(xué)報(bào),2006,35(3